叉頭框蛋白O1 對糖尿病心肌七氟烷后處理敏感性的調(diào)節(jié)作用

羅會林，吳志林，楊蕓蕓

糖尿病患者的機體處于高糖、高氧化應(yīng)激狀態(tài)，有糖尿病的心臟病患者心肌損傷更嚴(yán)重，且在圍術(shù)期更易發(fā)生心肌梗死，導(dǎo)致缺血再灌注（IR）損傷[1-2]。七氟烷后處理，即在缺血結(jié)束后、再灌注開始前即刻給予七氟烷處理，可減輕心肌IR 損傷[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷后處理能通過抑制氧化應(yīng)激、減少炎癥細胞聚集、阻斷細胞凋亡等實現(xiàn)對IR 心肌的保護[3,5-7]。然而，七氟烷后處理的這種保護效應(yīng)在糖尿病心肌中不明顯[5]，且原因不明。因此，尋找糖尿病心肌對七氟烷后處理不敏感的原因，有利于尋求防治糖尿病心肌IR 損傷的策略。

叉頭框蛋白（Fox）轉(zhuǎn)錄因子是心肌中胰島素的重要靶標(biāo)，成人心臟中以FoxO1 為主[8]。FoxO1 為信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）下游分子之一，可被STAT3 磷酸化失活[9]。研究表明，F(xiàn)oxO1 在糖尿病心肌中高表達，對其代謝產(chǎn)生不利影響[10]。且本研究團隊前期實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1高表達與糖尿病大鼠更嚴(yán)重的心肌IR 損傷同步發(fā)生（數(shù)據(jù)未發(fā)表），推測高水平的FoxO1 可能是糖尿病心肌對七氟烷后處理保護作用不敏感的原因。本研究擬建立糖尿病心肌IR（DM-MIR）大鼠模型，探究FoxO1 對糖尿病心肌七氟烷后處理敏感性的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠（體重270～300 g），購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，在武漢大學(xué)動物實驗中心動物房中常規(guī)飼養(yǎng)。本實驗經(jīng)武漢大學(xué)動物實驗中心倫理委員會批準(zhǔn)（編號2021-0162）。

1.2 主要試劑和儀器

七氟烷，購自上海恒瑞醫(yī)藥公司；綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的腺相關(guān)病毒9（AAV9-GFP）和攜帶FoxO1 小干擾RNA（siRNA）的綠色熒光蛋白標(biāo)記的腺相關(guān)病毒9（AAV9-FoxO1 siRNA），購自上海吉瑪公司；鏈脲佐菌素（STZ）、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）、伊文思藍（EB）染色液，購自美國Sigma 公司；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）試劑、TUNEL 凋亡試劑盒，購自上海生工生物公司；FoxO1 兔單抗、凋亡相關(guān)蛋白（Fas）兔單抗、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）兔多抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔多抗，購自美國Invitrogen 公司；STAT3 兔單抗、磷酸化STAT3（p-STAT3）兔單抗、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved-caspase3）兔多抗、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）兔單抗、組蛋白H3 兔單抗、羊抗兔二抗，購自美國CST 公司；普通顯微鏡、石蠟切片機，購自德國Leica 公司；電泳和轉(zhuǎn)膜裝置，購自美國BioRad 公司；血糖儀，購自美國Johnson 公司；小動物呼吸機，購自上海Alcott Biotech 公司；透射電子顯微鏡，購自荷蘭Philips 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DM-MIR 模型建立

選取空腹血糖水平在正常范圍的90 只大鼠，如前所述[5-6]，以65 mg/kg 的劑量單次腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病，72 h 后通過尾靜脈測定空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L 表示糖尿病大鼠模型誘導(dǎo)成功。另選取18 只大鼠腹腔注射枸櫞酸-磷酸氫二鈉溶液，即為正常大鼠。糖尿病造模成功后正常喂養(yǎng)4 周，通過腹膜內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，連接心電監(jiān)測儀記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。隨后進行氣管插管，連接動物呼吸機進行機械通氣。切開大鼠胸部肌肉暴露冠狀動脈左前降支（LAD），在LAD 起始部約2 mm 處用尼龍線打活結(jié)結(jié)扎30 min，觀察到心尖部位心肌顏色由紅色變淺或變白，且ST段向上抬高時，提示成功實現(xiàn)心肌缺血。心肌缺血維持30 min 后拉開活結(jié)，觀察到心尖部位恢復(fù)紅色且ST 段恢復(fù)則實現(xiàn)再灌注，持續(xù)2 h。假手術(shù)大鼠僅在LAD 穿線不結(jié)扎。

1.3.2 動物分組及給藥

采用隨機數(shù)字法將DM-MIR 大鼠分為DMMIR 模型組（DM-MIR 組）、DM-MIR 模型+七氟烷后處理組（DM-MIR+Sevo-PostC 組）、DM-MIR 模型+七氟烷后處理+沉默對照組（DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 組）、DM-MIR 模型+七氟烷后處理+FoxO1 沉默組（DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 組），每組18 只，另外正常-假手術(shù)組（N-S組）和糖尿病假手術(shù)組（DM-S 組）各18 只。DMMIR+Sevo-PostC 組在再灌注前15 min 通過氣管插管給予2%七氟烷持續(xù)吸入15 min[5-6]；DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 組在結(jié)扎LAD 前2 天心肌多點注射AAV9-GFP；DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 組在結(jié)扎LAD 前2 天心肌多點注射AAV9-FoxO1 siRNA。N-S 組、DM-S 組、DM-MIR 組同步吸入氧氣或注射生理鹽水。免疫熒光顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織GFP 分布以確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。

1.3.3 心肌梗死比例檢測

再灌注2 h 時，各組隨機取6 只大鼠，通過股靜脈注射1% EB 染色液。10 min 后夾閉主動脈，取出心臟，-20℃冷凍30 min 后，沿縱軸切割制備心臟切片（5 個）。將切片在1% TTC 溶液中避光浸泡30 min，4%多聚甲醛中浸泡15 min，拍照。藍色表示正常區(qū)域，紅色表示缺血區(qū)域，灰白色表示梗死區(qū)域，用Image J 圖像分析軟件測量各切片的梗死和缺血區(qū)域面積。梗死比例（%）=（梗死和缺血區(qū)域面積/切片總面積）×100%。

1.3.4 樣本采集

再灌注2 h 時，各組隨機取6 只大鼠，經(jīng)右頸動脈取血3 ml，靜置1 h 后，4℃離心15 min 收集血清；取血后立即處死大鼠，分離心臟，取缺血區(qū)域心肌組織在4%多聚甲醛（3 只大鼠）或1%四氧化鋨（3 只大鼠）中固定，前者用石蠟包埋后制備4 μm切片，后者制備透射電鏡超薄（85 nm）切片。收集各組余下6 只大鼠的缺血區(qū)域心肌組織，-80℃保存。

1.3.5 血清生化指標(biāo)檢測

采用大鼠cTnI、CK-MB ELISA 試劑盒在自動酶標(biāo)儀上測定各組大鼠的血清cTnI、CK-MB 水平。

1.3.6 HE 和TUNEL 染色

取1.3.4 心肌切片，經(jīng)脫蠟、水化后，加入HE或TUNEL 試劑染色，光鏡下觀察各組大鼠的心肌組織形態(tài)和細胞凋亡程度。

1.3.7 透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)

取電鏡超薄切片，加入乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在透射電鏡（電壓60 kV）下觀察各組大鼠的心肌細胞核和肌原纖維排列等亞細胞結(jié)構(gòu)。

1.3.8 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測

用試劑盒提取缺血區(qū)域心肌組織的總蛋白和核蛋白，BCA 法定量蛋白濃度。加入上樣緩沖液，在沸水浴中煮5 min。取等量（30 μg）蛋白質(zhì)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，切膠并濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；5%脫脂奶粉室溫封膜1 h；加入FoxO1 一抗（1: 800）、GAPDH 一抗（1:1 000）、p-STAT3 一抗（1:800）、STAT3 一抗（1:1 000）、Fas一 抗（1:1 000）、cleaved-caspase3 一抗（1:1 000）、PCK1 一抗（1:800）、G6Pase 一抗（1:500）及組蛋白H3 一抗（1:2 000），4℃孵膜過夜；次日加入羊抗兔二抗（1:2 000）孵育1 h；加入電化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光液，用蛋白凝膠成像儀拍照。分析不同條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，各項數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù)，兩組間數(shù)據(jù)用SNK-q 檢驗比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清cTnI、CK-MB、空腹血糖水平比較

與N-S 組相比，DM-S 組空腹血糖水平明顯升高[（5.92±1.34）mmol/L vs.（21.35±3.17）mmol/L，P＜0.05]。與DM-S 組相比，DM-MIR 組血清cTnI[（226.14±22.35）pg/ml vs.（429.51±20.68）pg/ml]、CK-MB [（35.82±4.15）U/L vs.（124.61±9.35）U/L]水平均顯著升高（P均＜0.05）。與DM-MIR 組相比，DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 組血清cTnI[（429.51±20.68）pg/ml vs.（261.45±20.8）pg/ml]、CK-MB [（124.61±9.35）U/L vs.（48.73±8.61）U/L]、空腹血糖[（21.35±3.17）mmol/L vs.（13.95±2.84）mmol/L]水平均顯著降低（P均＜0.05），DM-MIR+Sevo-PostC 組、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 組上述指標(biāo)的差異則均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.2 各組大鼠心肌梗死情況（圖1）

圖1 各組大鼠心肌梗死情況（EB-TTC 染色）

N-S 組和DM-S 組大鼠心肌無梗死區(qū)域；DMMIR 組大鼠心肌梗死比例為（19.57±1.76）%。與DM-MIR 組相比，DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 組心肌梗死比例降低[（19.57±1.76）%vs.（12.74±1.36）%，P＜0.05]，而DM-MIR+Sevo-PostC 組[（18.92±1.94）%]、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 組[（19.63±1.85）%]心肌梗死比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.3 各組大鼠心肌組織GFP 分布圖（圖2）

圖2 各組大鼠心肌組織GFP 分布圖（×200）

N-S 組、DM-S 組、DM-MIR 組、DMMIR+Sevo-PostC 組大鼠心肌組織均無綠色熒光。DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 組、DMMIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 組大鼠心肌組織可見明顯綠色熒光，提示AAV9 成功將目的序列攜帶至大鼠心肌組織。

2.4 各組大鼠心肌組織形態(tài)變化（圖3、4）

圖3 HE 染色觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)變化（×400）

N-S 組和DM-S 組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清楚，分布規(guī)則，無腫脹或皺縮心肌細胞，僅有個別炎性和凋亡細胞；DM-MIR 組大鼠心肌纖維斷裂、變形，分布不規(guī)則，可見腫脹或皺縮心肌細胞，有較多的炎性和凋亡細胞；DM-MIR+Sevo-PostC 組、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 組大鼠心肌形態(tài)與DM-MIR 組接近；DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 組心肌形態(tài)較DM-MIR+Sevo-PostC 組、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 組規(guī)則，炎性和凋亡細胞減少。

圖4 TUNEL 染色觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)變化（×400）

2.5 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化（圖5）

圖5 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化（×10 000）

N-S 組和DM-S 組大鼠心肌肌原纖維排列整齊，直線形Z 線清晰可見；細胞核呈圓形或橢圓形，可見均勻的染色質(zhì)和完整的核仁。

DM-MIR 組大鼠心肌肌原纖維排列紊亂，Z 線扭曲變形，甚至斷裂；細胞核呈細長或新月等形狀，核膜呈卷曲狀。DM-MIR+Sevo-PostC 組、DMMIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 組大鼠心肌肌原纖維及細胞形態(tài)與DM-MIR 組接近。

DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 組大鼠心肌肌原纖維和Z 線趨于規(guī)則；細胞核趨于圓形等規(guī)則形狀，核膜趨于光滑。

2.6 各組大鼠心肌Fas、cleaved-caspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平比較（圖6）

圖6 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠的Fas、cleavedcaspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平

與N-S 組相比，DM-S 組大鼠心肌PCK1、G6Pase 蛋白水平均升高（分別為：0.17±0.04 vs.1.53±0.12；0.13±0.03 vs.1.86±0.13；P均＜0.05）。

與DM-S 組相比，DM-MIR 組Fas、cleavedcaspase3 蛋白水平均升高（分別為：0.35±0.07 vs.1.71±0.13；0.25±0.04 vs.1.42±0.08；P均＜0.05）。

與DM-MIR 組相比，DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 組Fas、cleaved-caspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平降低（分別為：1.71±0.13 vs.0.74±0.11；1.42±0.08 vs.0.57±0.09；1.57±0.09 vs.0.82±0.14；1.93±0.18 vs.1.03±0.10；P均＜0.05），而DM-MIR+Sevo-PostC 組、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 組上述指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.7 各組大鼠心肌STAT3/FoxO1 通路蛋白水平比較（圖7）

圖7 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠STAT3/FoxO1通路相關(guān)蛋白水平

與N-S 組相比，DM-S 組大鼠心肌FoxO1 蛋白水平升高（0.75±0.13 vs.1.09±0.24，P＜0.05），p-STAT3/STAT3 比值降低（0.74±0.06 vs.0.59±0.05，P＜0.05）。

與DM-S 組相比，DM-MIR 組大鼠心肌FoxO1蛋白水平升高（1.09±0.24 vs.2.51±0.27，P＜0.05），p-STAT3/STAT3 比值降低（0.59±0.05 vs.0.28±0.04，P＜0.05）。

與DM-MIR 組相比，DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 組FoxO1 蛋白水平降低（2.51±0.27 vs.1.52±0.10，P＜0.05），p-STAT3/STAT3比值無變化（0.28±0.04 vs.0.24±0.04，P＞0.05）。

3 討論

STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型的病理環(huán)境與臨床1 型糖尿病患者相似，是公認(rèn)的1 型糖尿病模型[11]。本研究通過對糖尿病大鼠模型行LAD 結(jié)扎術(shù)建立DM-MIR 模型，研究FoxO1 對糖尿病心肌七氟烷后處理敏感性的調(diào)節(jié)作用。心肌梗死比例是缺血性損傷程度的直觀反映[12]，而血清cTnI 水平與心肌梗死面積變化同步[13]。本研究中，DM-MIR 大鼠心肌梗死比例為（19.57±1.76）%，伴隨血清cTnI、CK-MB 水平升高，且血糖水平升高，表明DM-MIR模型復(fù)制成功。研究顯示，七氟烷后處理能有效保護正常大鼠的心肌IR 損傷，然而對糖尿病大鼠的心肌IR 損傷無保護作用[5]。本研究也觀察到，七氟烷后處理對DM-MIR 大鼠心肌梗死比例和血清cTnI、CK-MB 水平無明顯改善作用，表明七氟烷后處理對糖尿病大鼠的心肌IR 損傷無保護作用。

在非糖尿病模型中，Janus 激酶（JAK）/STAT3通路激活是后處理實現(xiàn)心肌保護作用的重要機制之一[14]，但糖尿病可誘導(dǎo)STAT3 通路傳導(dǎo)抑制[5]。在STAT3 敲除小鼠中，1-磷酸-鞘氨醇激活JAK/STAT3 通路的心肌保護作用消失，同時FoxO1 活化增加[15]，提示活性FoxO1 蛋白水平升高可能是心肌保護失效的原因。本研究中，DM-S 組大鼠心肌中FoxO1 蛋白水平升高，p-STAT3/STAT3 比值降低，DM-MIR 大鼠心肌中FoxO1 蛋白水平進一步升高，p-STAT3/STAT3 比值進一步降低，且七氟烷后處理對上述指標(biāo)均無影響，提示DM-MIR 大鼠心肌中STAT3 通路傳導(dǎo)被抑制，且FoxO1 高表達。在糖尿病心肌中，高水平的活化FoxO1 可增加心肌細胞對脂肪酸的攝入，當(dāng)攝入量超出細胞的代謝負(fù)荷時，將導(dǎo)致活性氧過度產(chǎn)生和釋放、細胞能供紊亂和結(jié)構(gòu)損傷[16]，同時激活氧化應(yīng)激信號，破壞心肌蛋白與FoxO1 的結(jié)合[17]，損害磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/蛋白激酶（Akt）信號通路[18]。此前研究顯示，減少FoxO1 表達可恢復(fù)七氟烷后處理對糖尿病患者的心肌保護作用[5]。本研究也顯示，七氟烷后處理對FoxO1 蛋白和p-STAT3/STAT3 比值均無明顯影響；當(dāng)給予FoxO1 的siRNA 后,心肌FoxO1 蛋白水平顯著降低，心肌梗死、細胞凋亡比例及血清cTnI、CK-MB 水平均顯著降低，提示沉默糖尿病心肌中的FoxO1 可能為恢復(fù)糖尿病心肌七氟烷后處理敏感性的有效策略。

FoxO1 可將胰島素、氧化應(yīng)激因子、代謝物質(zhì)等對細胞的刺激傳遞至細胞內(nèi)，通過調(diào)節(jié)凋亡基因（Fas）、糖異生基因（PCK1、G6Pase）等的表達，參與調(diào)控細胞凋亡、能量代謝等生理活動[19-21]。本研究中，DM-MIR 大鼠心肌中Fas、cleavedcaspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平升高，提示DMMIR 大鼠心肌組織處于高凋亡和高糖異生狀態(tài)。糖異生可直接造成細胞糖負(fù)荷過高[21]，還可誘導(dǎo)氧化損傷，啟動細胞凋亡程序[22]，加重DM-MIR 損傷。而七氟烷后處理對Fas、cleaved-caspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平均無明顯影響，但在給予FoxO1 的siRNA 后,心肌Fas、cleaved-caspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平及心肌梗死、細胞凋亡比例和血清cTnI 水平均顯著降低，提示FoxO1 可能通過調(diào)節(jié)下游凋亡和糖異生基因表達[19-21]，影響心肌細胞凋亡和糖異生，調(diào)節(jié)糖尿病心肌對七氟烷后處理的敏感性。

綜上所述，F(xiàn)oxO1 在DM-MIR 大鼠心肌中高表達，可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡和糖異生基因表達而影響糖尿病心肌對七氟烷后處理的敏感性。該研究結(jié)果可能為研發(fā)糖尿病心肌IR 損傷保護藥物或藥物聯(lián)合應(yīng)用提供潛在的作用靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突