萬壽菊不同部位提取物制備及其對柑橘根線蟲的毒殺影響

郭雁君，吉前華*，蔣惠，郭麗英，楊鳳梅，胡益波，

（1.廣東省肇慶學(xué)院果樹研究所 肇慶市 526061；2.廣東省德慶縣柑桔研究所 德慶縣 526600）

我國是世界柑橘生產(chǎn)第一大國，西江流域柑橘產(chǎn)業(yè)帶是我國柑橘生產(chǎn)的重要區(qū)域，其中砂糖橘Citrus reticulate（Blanco cv.Shatangju）是其主栽品種之一，也是我國特有的地方品種，目前廣西是我國砂糖橘種植面積最大的產(chǎn)區(qū)。柑橘根線蟲病在我國柑橘主產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，其中尤以柑橘半穿刺線蟲Tylenchulus semipenetrans和柑橘根結(jié)線蟲MeloidogyneSPP.危害最大[1-2]，成為近年來制約砂糖橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一個常見蟲害。砂糖橘感染柑橘根線蟲后，柑橘植株生長減緩，葉片黃化，葉片翻卷，樹冠衰退，花和果實(shí)易脫落，產(chǎn)量下降，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致植株多年不結(jié)果或死亡。其主要原因是根線蟲侵染根系和取食，造成機(jī)械損傷，引發(fā)病原菌侵染和影響柑橘根和葉中滲透活性離子的分配[3]，導(dǎo)致根的吸收能力衰退，影響根系的正常生理功能，植株對土壤養(yǎng)分的吸收能力減弱，從而影響其生長發(fā)育。柑橘根線蟲1 a發(fā)生10個世代以上，對柑橘危害時間長[4]。目前柑橘線蟲的防治方法有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治，以化學(xué)防治為主，但是這類殺線蟲劑存在使用成本高、毒性大、污染環(huán)境等弊端，如破壞生態(tài)平衡、造成次要病害發(fā)生、藥劑殘留造成水土污染、引起人畜中毒、抗性喪失等[5]。因此研究開發(fā)新型的、既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的殺線蟲劑十分必要。萬壽菊Tagete srecta是菊科萬壽菊屬一年生草本植物，種類多樣，在我國廣泛分布，其生長對土壤要求不高，栽培容易，向陽喜暖，能耐旱霜，抗性較強(qiáng)，病蟲害少，適合大面積的播種。萬壽菊化學(xué)成分包括噻吩類、精油、色素、黃酮及苷類等，目前國內(nèi)針對萬壽菊中葉黃素的研究報(bào)道較多，對于其他成分的研究報(bào)道較少[6-7]。噻吩類化合物是萬壽菊的特征性次生產(chǎn)物，它有多種生物活性，其中α-三聯(lián)噻吩是最有代表性的物質(zhì)之一，含量最高。有研究表明萬壽菊的根、莖和花的提取物對松樹線蟲具有毒殺性，尤以根的粗提物最為顯著[8]。國內(nèi)在蘋果的生產(chǎn)上利用間種萬壽菊預(yù)防蘋果根線蟲病。而柑橘的生產(chǎn)上極少使用萬壽菊作為柑橘根線蟲病的防治方法。本文以萬壽菊為材料，選取成熟萬壽菊的花、莖葉和根3個部位，用不同方法獲得粗提物，并試驗(yàn)毒殺砂糖橘園柑橘根線蟲的效果，研究萬壽菊生物活性物質(zhì)成分與柑橘根線蟲毒殺效率的相關(guān)性，為使用萬壽菊提取物毒殺柑橘根線蟲和研發(fā)新型植物源毒殺柑橘根線蟲藥劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取成熟的萬壽菊花、莖葉、根3個部位，于烘箱中85℃烘干、粉碎，陰涼黑暗處保存?zhèn)溆谩?/p>

取砂糖橘園感病果樹根際土壤，采用改良式貝曼氏漏斗法收集柑橘根線蟲備用[9]。

1.2 研究方法

1.2.1 萬壽菊花、莖葉、根粗提物的制備

分別稱取5.0 g萬壽菊花、莖葉、根的干粉，用無菌水、無水乙醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯，于超聲波機(jī)中（功率900 W，頻率40 kHz）提取30 min，常溫下提取3次，合并液體后進(jìn)行減壓抽濾，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃減壓蒸發(fā)至干，得到粗提物[10]，計(jì)算各粗提物的提取率。提取率=提取物干重/植物干粉重×100。

1.2.2 不同溶劑粗提物的毒殺線蟲率測定

取適量的粗提物用無菌水溶解，稀釋成0.000 1 mg/mL、0.001 mg/mL、0.01 mg/mL質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取提取物稀釋液3 mL于培養(yǎng)皿中（d=5 cm），加入20條線蟲，培養(yǎng)72 h，每隔24 h觀察并統(tǒng)計(jì)線蟲死亡率。對照組為3 mL無菌水中加入20條線蟲。

1.2.3 萬壽菊粗提物的活性物質(zhì)測定及其對柑橘根線蟲的毒殺能力相關(guān)性分析

分別稱量100.0 g的萬壽菊的花、莖葉、根，剪碎，放置蒸發(fā)皿中，在85℃烘箱中烘24 h至恒重，待冷卻至室溫，取出稱重并記錄。計(jì)算萬壽菊各部位的失水率和干物質(zhì)得率。取萬壽菊的花、莖葉、根干粉分別測定生物活性物質(zhì)含量，黃酮含量的測定采用分光光度法[11]，脯氨酸含量的測定采用茚三酮顯色法[12]，總糖、還原糖、多糖含量的測定采用文獻(xiàn)[13]的方法，α-三聯(lián)噻吩含量的測定采用高效液相色譜法，選用C18柱色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（90∶10），流速1.0 mL/min，檢測波長352 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL[14]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 25進(jìn)行單因素方差分析（SSR法）和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對萬壽菊的花、莖葉、根的提取效果

結(jié)果見表1。由表1可知，以相同的方法、不同的溶劑對萬壽菊的花、莖葉和根部的干粉進(jìn)行抽提，得率高低的趨勢在花、莖葉和根中表現(xiàn)相同，均為無菌水＞無水乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞石油醚。不同溶劑提取的粗提物顏色不同，無菌水粗提物是深黃色，無水乙醇的是綠色，乙酸乙酯的是黃綠色，石油醚的是淺綠色，丙酮的是綠色，說明各粗提物中所含的物質(zhì)存在差異。

表1 不同溶劑提取萬壽菊花、莖葉、根的粗提率（單位：%）

2.2 不同溶劑提取的粗提物的毒殺線蟲效果

結(jié)果見圖1至圖5。由圖1可知，萬壽菊的無菌水提取物稀釋成3個濃度，對砂糖橘園根際土壤柑橘根線蟲的毒殺效果不同，線蟲的死亡率隨提取物濃度的增加而升高，并且表現(xiàn)出時間效應(yīng)，即柑橘根線蟲死亡率隨著各濃度提取物處理時間的增加而升高。所有處理的線蟲死亡率均未超過50%。相同濃度和相同處理時間下萬壽菊根提取物的毒殺效果最高，其次是花和莖葉提取物，與對照相比，0.01 mg/mL的提取物在處理24 h時對柑橘根線蟲的相對毒殺率為10%（花、莖葉）和15%（根）。

圖1 萬壽菊花、莖葉、根的無菌水提取物對柑橘根線蟲的毒殺效果

由圖2至圖5可知，萬壽菊的無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚和丙酮提取物對柑橘根線蟲的毒殺趨勢與無菌水提取物的相似，柑橘根線蟲的死亡率隨提取物濃度和時間的增加而升高，相同濃度和相同處理時間乙酸乙酯、石油醚提取的根提取物的毒殺效果最高，其次是花和莖葉提取物。與對照相比，0.01 mg/mL的提取物在處理24 h時對柑橘根線蟲的相對毒殺率表現(xiàn)為：無水乙醇提取物的線蟲相對死亡率為70%（花）、75%（莖葉）和95%（根），乙酸乙酯和石油醚提取物的線蟲相對死亡率為80%（花）、80%（莖葉）和95%（根），丙酮提取物的線蟲相對死亡率為30%（花）、30%（莖葉）和75%（根），與對照相比差異顯著。萬壽菊不同部位的乙酸乙酯和石油醚提取物在0.01 mg/mL濃度和處理72 h條件下，柑橘根線蟲被全部毒殺。不同提取試劑相比，乙酸乙酯提取物的柑橘線蟲毒殺效果最高，0.000 1 mg/mL的根提取液、0.01 mg/mL的花和莖葉提取液72 h內(nèi)線蟲死亡率達(dá)100%。0.01 mg/mL的根提取液處理24 h線蟲死亡率達(dá)到100%。相同濃度下，乙酸乙酯提取物的殺蟲用時更短。各提取物殺線蟲效果：乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物＞無水乙醇提取物＞丙酮粗提取物＞無菌水提取物。

圖2 萬壽菊花、莖葉、根的無水乙醇提取物對柑橘根線蟲的毒殺效果

圖3 萬壽菊花、莖葉、根的乙酸乙酯提取物對柑橘根線蟲的毒殺效果

圖4 萬壽菊花、莖葉、根的石油醚提取物對柑橘根線蟲的毒殺效果

圖5 萬壽菊花、莖葉、根的丙酮提取物對柑橘根線蟲的毒殺效率

2.3 萬壽菊粗提物的活性物質(zhì)及其對柑橘根線蟲的毒殺能力

結(jié)果見表2 至表6。從表2 可知，萬壽菊花的失水率＞莖葉的失水率＞根部的失水率，即萬壽菊的根獲得的干物質(zhì)最多，達(dá)到24.88%。由表3可知，不同部位，萬壽菊的各種生物活性物質(zhì)含量不同，其中黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖和多糖含量由多到少的部位依次是花＞莖葉＞根，且花中的含量與莖葉、根中的差異顯著，而α-三聯(lián)噻吩含量與之相反，表現(xiàn)為根＞花＞莖葉，且根中的含量與莖葉、花中的差異顯著。

表2 萬壽菊花、莖葉、根的干物質(zhì)率

表3 萬壽菊花、莖葉、根干粉中生物活性物質(zhì)含量

由表4、表5、表6可知，α-三聯(lián)噻吩含量多少與柑橘根線蟲死亡率之間存在顯著的正相關(guān)性（P＜0.05），萬壽菊根部的α-三聯(lián)噻吩含量最高，對應(yīng)的根提取物的柑橘根線蟲死亡率高。而黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖和多糖含量與線蟲死亡率之間成負(fù)相關(guān)，但未達(dá)到顯著水平。不同的提取方法，二者之間的相關(guān)性存在差異。

表4 處理24 h柑橘根線蟲死亡率與萬壽菊不同溶劑提取物中生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)

表5 處理48 h柑橘根線蟲死亡率與萬壽菊不同溶劑提取物中生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)

表6 處理72 h柑橘根線蟲死亡率與萬壽菊不同溶劑提取物中生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)

3 討論

本文探討了用成熟萬壽菊的不同部位，在不同提取方法和不同處理時間等條件下，提取物對砂糖橘園根際土壤的柑橘根線蟲的毒殺效果。

不同提取方法中乙酸乙酯和石油醚的提取物得率最低，但毒殺柑橘根線蟲的效果最高，其中尤以根部的最高。而柑橘根線蟲死亡率與萬壽菊提取物中的α-三聯(lián)噻吩含量顯著正相關(guān)，α-三聯(lián)噻吩屬于芳香性雜環(huán)化合物，脂溶性較強(qiáng)、水溶性較差[15]，所以不同溶劑提取的α-三聯(lián)噻吩含量不同，導(dǎo)致對柑橘根線蟲毒殺效果不同。萬壽菊中的α-三聯(lián)噻吩具有顯著的光活化殺蟲活性，在有光的環(huán)境會產(chǎn)生光分解[16]，因此α-三聯(lián)噻吩在萬壽菊干燥和提取的過程中會產(chǎn)生一定的損耗，一方面在干燥、提取和保存過程中需要避光操作，另一方面提供了利用α-三聯(lián)噻吩毒殺柑橘根線蟲的其他思路，比如間種萬壽菊和利用萬壽菊粉碎物覆蓋等方法輔助殺滅柑橘根線蟲。

為了生產(chǎn)上應(yīng)用便利，分別提取了萬壽菊花、莖葉和根3個部位的α-三聯(lián)噻吩，其中根的含量最多，將莖和葉合并提取，α-三聯(lián)噻吩的含量最少，不及花的。而闞春剛等[17]的研究結(jié)果顯示，萬壽菊莖的冷浸提取物中α-三聯(lián)噻吩的含量最高，其次為根，而葉和花中的含量極少。本文中測得萬壽菊根提取物中α-三聯(lián)噻吩的含量為14.96 mg/g，由此可以看出超聲波提取的方法優(yōu)于冷浸提取。試驗(yàn)證明，萬壽菊根的粗提物對柑橘根線蟲的毒殺效果最高，且隨著粗提物濃度的增大，對柑橘根線蟲的毒殺效果也呈升高趨勢，當(dāng)粗提物稀釋液濃度達(dá)到0.01 mg/mL時，毒殺效果可達(dá)100%。并且發(fā)現(xiàn)，萬壽菊粗提物對柑橘根線蟲的毒殺效果隨時間的延長而增強(qiáng)。

本文中黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖和多糖與線蟲的死亡率之間沒有顯著正相關(guān)關(guān)系，雖然黃酮對線蟲具有抗氧化損傷作用，多糖中可能有損傷線蟲的部分活性物質(zhì)存在，但相比萬壽菊中噻吩類化合物的作用，其可能只是存在部分的輔助作用。用成熟萬壽菊的提取物進(jìn)行小鼠急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出萬壽菊提取物是無毒的[18]，因此可作為符合現(xiàn)代環(huán)境保護(hù)條例的綠色環(huán)保植物農(nóng)藥，而對于α-三聯(lián)噻吩這一成分是否就是萬壽菊根提取物的最主要有效殺柑橘根線蟲的成分，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

砂糖橘的生產(chǎn)可以充分利用萬壽菊的生長特點(diǎn)和作用，行間間種矮生萬壽菊，既具有觀賞性，又可研究萬壽菊根部分泌物的殺線蟲作用；成熟后收獲全株，花中可以提取黃酮等生物活性物質(zhì)，并用于醫(yī)藥、食品和美容保健等行業(yè)，提供高附加值；莖和葉直接粉碎后還田，一則可以作為綠肥，二則可以輔助毒殺線蟲；根可以用于提取噻吩類化合物，制備植物源農(nóng)藥。

4 小結(jié)

在萬壽菊的花、莖葉和根中，根部粗提物對柑橘根線蟲的毒殺作用最強(qiáng)，不同提取方法中乙酸乙酯和石油醚粗提物對柑橘根線蟲毒殺效果最高。隨著粗提物濃度增大，對柑橘根線蟲的毒殺效果也有提升趨勢，當(dāng)提取物稀釋液濃度達(dá)到0.01 mg/mL 時，毒殺效果可達(dá)100%。粗提物對柑橘根線蟲的毒殺效果隨時間的延長而提升。α-三聯(lián)噻吩是毒殺柑橘根線蟲的主要有效成分之一，并在根中含量最多。黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖、多糖等生物活性物質(zhì)不是毒殺柑橘根線蟲的主要成分。