潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物造模方法研究進(jìn)展

郭瑩，吳佳俊，環(huán)誠(chéng)

（陜西中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046）

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是炎癥性腸道疾?。↖BD）的一種亞型，結(jié)腸黏膜持續(xù)受免疫介導(dǎo)的炎癥和潰瘍。UC 在疾病的表型和治療反應(yīng)方面，表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性，使發(fā)病率和死亡率顯著提高。常因血性腹瀉、潰瘍、腸道炎癥、體重減輕和腹痛等癥狀，患者的生活質(zhì)量被嚴(yán)重影響。[1-2]該疾病的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前研究分析表明：宿主基因?qū)е碌倪z傳易感導(dǎo)致共生微生物的組成和結(jié)腸黏膜及上皮壁的完整性缺失[3-4]、腸道感染誘發(fā)原因：在人體血液或糞便中分別存在輪狀病毒、腸道桿菌等病原體，這些致病菌導(dǎo)致腸道發(fā)生各類(lèi)疾病[5]，人在預(yù)防或治療其他疾病時(shí)，服用抗生素，導(dǎo)致機(jī)體腸道菌群失調(diào)，最終誘發(fā)UC。

細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)：細(xì)胞若大量發(fā)生凋亡，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)受損，腸道黏膜處的重要穩(wěn)定細(xì)胞中的上皮細(xì)胞，處于增殖和凋亡混亂狀態(tài)，上皮細(xì)胞異常凋亡導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損，最終誘發(fā)UC[6]，生活習(xí)慣等因素也是造成UC 產(chǎn)生的誘因之一：長(zhǎng)期暴飲暴食，食用高膽固醇類(lèi)多油高脂食物，增加胃腸負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致人體免疫力低下，從而誘發(fā)UC[7]，以上觀點(diǎn)為UC 動(dòng)物模型打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。近年來(lái)我國(guó)UC 發(fā)病率有逐漸上升趨勢(shì)[8]，長(zhǎng)期反復(fù)地慢性腸炎有可能導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生[9-10]，因此，建立UC 動(dòng)物模型對(duì)于闡明UC 的病因和發(fā)病機(jī)制從而達(dá)到有效治愈的目的，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

至今為止已有的UC 模型大致分為自發(fā)性模型、誘發(fā)性模型和基因修飾模型。運(yùn)用各種方法建立的UC 模型也具有一定的趨向意義和研究意義。本文將從化學(xué)法、免疫法以及基因修飾模型法三方面就其原理、特點(diǎn)及應(yīng)用評(píng)價(jià)進(jìn)行綜述，以期對(duì)UC動(dòng)物模型建立提供思路。

1 化學(xué)法誘導(dǎo)的UC 模型

1.1 葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的UC 模型

DSS 具有抗止血和抗凝血功能的硫酸化多糖的聚合物。DSS 誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)腸炎機(jī)制尚且不明，有學(xué)者認(rèn)為該模型可能為DSS 影響脫氧核糖核酸（DNA）合成[11]，從而抑制上皮細(xì)胞增生，使腸黏膜屏障遭到破壞，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致固有層和黏膜下腔室暴露于腸腔內(nèi)抗原和腸道細(xì)菌中，從而誘發(fā)產(chǎn)生免疫反應(yīng)[12]。通過(guò)病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)該模型結(jié)腸腺損傷、糜爛、上皮增生和黏膜下水腫的組織學(xué)病變較顯著[13]。

造模方法：DSS 造模方法可分為自由飲用和直腸灌注，通常實(shí)驗(yàn)室采用2%至5.5%濃度[14-18]的Dss 溶液進(jìn)行造模，造模小鼠病理狀態(tài)：總體特征為腹瀉黏液便。肉眼血便，毛色暗淡，體重下降。DSS 誘導(dǎo)的 UC 組織病理學(xué)改變?nèi)Q于小鼠飲用DSS 的時(shí)間。

特點(diǎn)：通過(guò)DSS 劑量可以調(diào)節(jié)DSS 的誘導(dǎo)成效，為控制疾病的范圍方面提供經(jīng)驗(yàn)，但該模型易受不同批次DSS 試劑、動(dòng)物菌株、小鼠性別和局部微生物群的變異性的影響[19]。通過(guò)發(fā)現(xiàn)DSS 試劑濃度和給藥時(shí)間的差異可以產(chǎn)生不同類(lèi)型的結(jié)腸炎模型如：急性、慢性和復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎[20]，其中慢性DSS 模型比較典型，應(yīng)用C57BL/6 小鼠造模，急性給藥DSS（飲水5 天）也可誘導(dǎo)慢性結(jié)腸炎，而B(niǎo)ALB/c 小鼠卻無(wú)法達(dá)到，在C57BL/6 中，在DSS暴露的5 天周期后4 周觀察到組織病理學(xué)變化，如單核細(xì)胞浸潤(rùn)、不規(guī)則的上皮結(jié)構(gòu)和膠原的持續(xù)沉積，而B(niǎo)ALB/c 小鼠在同一時(shí)期內(nèi)已經(jīng)完全恢復(fù)[21]。由此可以得出不同品系小鼠對(duì)DSS 試劑的反應(yīng)程度有所差異。該模型優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)單、造模成功率高、可復(fù)制性好，與人類(lèi)的UC 病變相類(lèi)似，可作為一種理想的人類(lèi) UC 模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。DSS 模型被用于研究UC 病因和發(fā)病機(jī)制以及篩選對(duì) UC有治療具有潛力的天然藥物和復(fù)方合成藥劑[22]。

評(píng)價(jià)與應(yīng)用：與人類(lèi)UC 臨床特點(diǎn)較吻合，既有慢性期，又有慢性病程的急性發(fā)作。用于研究人類(lèi)UC 的急性期和緩解期的病理學(xué)表現(xiàn)特征[23]。

1.2 乙酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎

乙酸可以改變血管通透性，激活激肽，使纖維蛋白水解，從而誘發(fā)干擾凝血機(jī)制，此模型主要利用其毒性破壞結(jié)腸上皮細(xì)胞及其腸內(nèi)細(xì)菌，最終毒素侵入腸道引起急性反應(yīng)，該方法誘導(dǎo)出潰瘍性結(jié)腸炎的短暫模型[24]。

造模方法：利用直腸灌注的方法，將濃度為0.9-1.4mol/L 的乙酸溶液[25-28]進(jìn)行灌腸，注入直腸后讓藥物在直腸內(nèi)停留10-30s，使溶液充分浸潤(rùn)結(jié)直腸段，該模型成功的關(guān)鍵在于乙酸濃度的配比。

特點(diǎn)：該模型的第一份報(bào)告由MacPherson 和Pfeiffer 提出[29]，他們向大鼠直腸滴注10%-50%的乙酸10 秒鐘，然后用鹽水沖洗管腔三次。在這些大鼠中觀察到以乙酸劑量依賴(lài)性方式出現(xiàn)的彌漫性結(jié)腸炎，其組織病理學(xué)特征包括遠(yuǎn)端結(jié)腸潰瘍和隱窩異常[30]潰瘍和損傷的黏膜，其破壞有時(shí)延伸至淋巴結(jié)，在小鼠中幾天內(nèi)開(kāi)始愈合，在大鼠中幾周后開(kāi)始愈合.[31]乙酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的優(yōu)點(diǎn)是其低成本和易于給藥。

評(píng)價(jià)與應(yīng)用：模型簡(jiǎn)單易行、成本低、周期短、重復(fù)性好、成功率高適用于研究人類(lèi)UC 的急性期、炎癥介質(zhì)致炎機(jī)制及藥物治療機(jī)制，不適用于免疫機(jī)制的研究。

2 免疫法誘導(dǎo)的UC 模型

2.1 TNBS/DNBS+乙醇模型

三硝基苯磺酸（TNBS）/二硝基苯磺酸（DNBS）是一種半抗原模型，它通過(guò)直腸注入黏膜致敏劑DNBS/TNBS，在不同濃度的乙醇中稀釋從而引起疾病。其中乙醇用于有效地打破腸道屏障，使半抗原與結(jié)腸組織蛋白相互作用。蛋白質(zhì)與半抗原分子的偶聯(lián)使這些蛋白質(zhì)免疫原性，從而觸發(fā)宿主的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[32]。雖然該模型需要時(shí)間較長(zhǎng)，但一旦建立，該模型將導(dǎo)致對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸的一致局部損傷。

造模方法：將小鼠禁食24h，自由飲水，造模前用乙醚進(jìn)行麻醉，用直徑為1mm 左右針管注入，將的TNBS 乙醇溶液注入直腸，將大鼠持續(xù)倒置至30s[33]。還有使用0.6mL 終濃度為33.3%的TNBS/無(wú)水乙醇混合溶液對(duì)小鼠進(jìn)行灌腸處理[34]。

特點(diǎn)：在BALB/c 小鼠中，慢性TNBS 的特點(diǎn)是最初產(chǎn)生的是IL-12 和IFN ，但在TNBS 治療第三周后，觀察到IL-23 和IL-17 升高。在TNBS 治療第五周后，觀察IL-13 的產(chǎn)生，然后觀察TGF 的分泌和纖維化的發(fā)展[35]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了從急性和慢性接觸刺激的免疫進(jìn)展。 因此，該模型中的治療時(shí)間無(wú)疑將影響治療效果，在組織病理學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)，慢性TNBS 結(jié)腸炎的特點(diǎn)是彌漫性跨壁壞死，累及粘膜、黏膜下層和黏膜下水腫和明顯的炎癥浸潤(rùn)[36]。MPO 水平升高，提示中性粒細(xì)胞招募[35]。

2.2 噁唑酮模型

噁唑酮（4-乙氧基甲基-2-苯基噁唑-5-酮）是一種經(jīng)典的觸覺(jué)劑，歷史上用于研究皮膚中的延遲型過(guò)敏反應(yīng)，將半抗原噁唑酮和乙醇直腸內(nèi)給藥于小鼠動(dòng)物導(dǎo)致急性結(jié)腸炎。

造模方法：將昆明小鼠暴露腹部皮膚涂抹l%OXZ(100%乙醇溶劑）0.2 mL 致敏重復(fù)進(jìn)行2 天，5 天后將0.5%OXZ(50%乙醇溶劑）0.1 mL 緩慢注入小鼠肛門(mén)[37-38]。

特點(diǎn)：這種疾病的特征是T 輔助（Th）2 型免疫反應(yīng)，白細(xì)胞介素（IL）-4 和IL-5 產(chǎn)生顯著增加，伴有體重減輕、腹瀉、潰瘍和大腸上皮細(xì)胞丟失[39]。因此，它類(lèi)似于潰瘍性結(jié)腸炎，而不是其他IBD 亞型，使其與三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎（Th1 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)）不同，后者更接近于CD。自然殺傷T 細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子，主要是IL-13，也與噁唑酮誘導(dǎo)的結(jié)腸炎誘導(dǎo)密切相關(guān)[40]許多研究利用噁唑酮誘導(dǎo)的結(jié)腸炎來(lái)測(cè)試潰瘍性結(jié)腸炎的疾病病理學(xué)研究和治療干預(yù)[41]。

3 潰瘍性結(jié)腸炎的轉(zhuǎn)基因和基因敲除動(dòng)物模型

3.1 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型

T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型是由T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞所產(chǎn)生的慢性結(jié)腸炎模型[42]純化CD4+CD34RB 的過(guò)繼轉(zhuǎn)移至幼稚的T 細(xì)胞進(jìn)入同步宿主，缺乏T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的小鼠，幼稚的T 細(xì)胞可以在腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移到受體小鼠[43]，在腸道抗原暴露的驅(qū)動(dòng)下，幼稚T 細(xì)胞未經(jīng)抑制的激活、分化和擴(kuò)張最終導(dǎo)致結(jié)腸炎。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞與幼稚T 細(xì)胞一起轉(zhuǎn)移可以抑制該疾病[42]。

特點(diǎn)：對(duì)該模型小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的組織病理學(xué)檢查揭示了UC 的許多特征，包括上皮細(xì)胞增生、多形核白細(xì)胞（PMN）和單核白細(xì)胞浸潤(rùn)、隱窩膿腫和上皮細(xì)胞侵蝕、硬膜外炎癥，以及Th1 和/或Th17 細(xì)胞的發(fā)育，因此該模型通常被描述為適合于CD 治療的評(píng)估[44]。該模型中的疾病已被證明依賴(lài)于IL-23 和IFN 介導(dǎo)產(chǎn)生，在藥理抑制或遺傳消融技術(shù)作用下，發(fā)現(xiàn)其中任意一種細(xì)胞因子都能抑制結(jié)腸炎的發(fā)生[45]。

4 結(jié)論

綜上所述，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越復(fù)雜的UC 動(dòng)物模型出現(xiàn)，研究人員可以依照各種模型的優(yōu)缺點(diǎn)和研究方向，合理選擇動(dòng)物模型去研究，就目前而言沒(méi)有單一的結(jié)腸炎小鼠模型被證明可以預(yù)測(cè)UC 的臨床特征與結(jié)果。因?yàn)樵S多因素可能導(dǎo)致小鼠與人類(lèi)的脫節(jié)，包括生理學(xué)上的先天差異、慢性疾病與模擬慢性小鼠的生命時(shí)間、人類(lèi)與近交系小鼠的疾病異質(zhì)性以及藥物和代孕物之間的藥理學(xué)差異。由于基因修飾模型技術(shù)要求高喂養(yǎng)及繁殖條件嚴(yán)格，目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用于UC 研究相對(duì)較少，但是基因修飾模型是有望今后有所突破的研究熱點(diǎn)?；瘜W(xué)法誘導(dǎo)的急性慢性模型，其成本低、可控程度較其他方法顯著，雖然只能反應(yīng)UC 的某些方面的特點(diǎn)，但依然是目前研究者使用最多的方法。