基于物種特異性單一DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)的食品真實(shí)性定性鑒別技術(shù)研究進(jìn)展

陳愛亮

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

食品欺詐（Food fraud）是指企業(yè)或個(gè)人故意在食品的完整性方面欺騙他人以獲取不正當(dāng)經(jīng)濟(jì)利益的行為[1]。近年來，隨著食品工業(yè)化發(fā)展和經(jīng)濟(jì)的全球化，食品供應(yīng)鏈也越來越復(fù)雜，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，用低成本低質(zhì)量食品冒充高價(jià)值高質(zhì)量食品的食品欺詐事件頻頻發(fā)生，幾乎發(fā)生在所有的食品領(lǐng)域[2]，包括動(dòng)物類產(chǎn)品，如肉類、乳品、水產(chǎn)品、蜂蜜；植物類產(chǎn)品，如果汁、紅酒、食用油、谷物以及中藥材、植物性膳食補(bǔ)充劑、香料等。而且標(biāo)簽錯(cuò)誤率居高不下，如在意大利銷售的加工肉制品和魚片上標(biāo)簽錯(cuò)誤比例分別高達(dá)57%和42.8%[3～4]；在美國(guó)銷售的肉制品、對(duì)蝦產(chǎn)品、山羊乳制品則分別有高達(dá)35%、24.4%和80%的標(biāo)簽錯(cuò)誤率[5～7]。2020年，全球各地仍然發(fā)生了多起馬肉冒充牛肉事件。在國(guó)內(nèi)，研究人員們對(duì)來自30種不同品牌的153份烤鱈魚片樣本進(jìn)行了脫氧核糖核酸（DNA）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)58%的樣本存在被其他低值魚類冒充或標(biāo)簽錯(cuò)誤的情況[8]；對(duì)市場(chǎng)上銀鱈魚和南極犬牙魚進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)85%的產(chǎn)品存在假冒或標(biāo)簽錯(cuò)誤的情況[9]。根據(jù)美國(guó)消費(fèi)品牌協(xié)會(huì)的數(shù)據(jù)，大約10%的商業(yè)化生產(chǎn)的食品受到了食品欺詐的影響。

食品真實(shí)性鑒別（Food authentication）是指通過對(duì)食品的組成性質(zhì)等進(jìn)行分析，驗(yàn)證其是否符合其標(biāo)簽所示成分、營(yíng)養(yǎng)等信息的過程。應(yīng)對(duì)食品欺詐，執(zhí)行相關(guān)食品欺詐法規(guī)都需要食品真實(shí)性鑒別技術(shù)的支撐。近年來，一系列食品真實(shí)性鑒別技術(shù)被開發(fā)出來用于食品欺詐分析[2]，按技術(shù)原理主要分為4類，即化學(xué)方法、物理方法、蛋白質(zhì)方法和DNA方法?；瘜W(xué)方法主要通過分析食品的組成成分對(duì)食品進(jìn)行真實(shí)性鑒別，如利用色譜—質(zhì)譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)、紅外光譜和拉曼光譜技術(shù)等分析食品內(nèi)特征代謝物成分，其主要用于食品摻假、替代、稀釋、增強(qiáng)等改變食品成分組成的食品真實(shí)性鑒別分析。食品中的穩(wěn)定同位素以及礦物元素組成主要與食品產(chǎn)地有關(guān)，因此穩(wěn)定同位素和礦物元素分析技術(shù)主要用于食品產(chǎn)地的溯源鑒別。蛋白質(zhì)和DNA技術(shù)，尤其是DNA技術(shù)，主要用于食品中物種源性成分的分析，如歐洲馬肉摻假鑒別最主要應(yīng)用的技術(shù)就是DNA分析技術(shù)。

從應(yīng)用場(chǎng)景來分，這些技術(shù)又可以分為兩類，一類是需要精密儀器和復(fù)雜操作步驟的技術(shù)，主要應(yīng)用于專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室，如穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)、高分辨率核磁共振技術(shù)等。另一類是基于DNA分析的熒光定量PCR技術(shù)、基于抗原抗體的ELISA技術(shù)以及正在發(fā)展的便攜式光譜技術(shù)，這些技術(shù)更適用于普通實(shí)驗(yàn)室，甚至是現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。尤其是歐洲馬肉風(fēng)波以后，歐洲各國(guó)政府認(rèn)識(shí)到有必要開發(fā)更多的基于DNA的分析技術(shù)，并在官方實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行應(yīng)用，將DNA技術(shù)確立為驗(yàn)證食品真實(shí)性和執(zhí)行食品成分、標(biāo)簽和標(biāo)準(zhǔn)立法的常規(guī)檢測(cè)手段。本文概述了DNA分析技術(shù)在食品真實(shí)性鑒別中的重要性，綜述了物種特異性單一DNA標(biāo)記主要類型及目前常用的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)，并探討了基于物種特異性單一DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)的食品真實(shí)性鑒別技術(shù)的未來發(fā)展趨勢(shì)。

一、DNA分析技術(shù)在食品真實(shí)性鑒別中的重要性

選擇DNA分析作為食品真實(shí)性鑒別的主要技術(shù)，尤其是食品中物種源性成分鑒定的主要技術(shù)，是因?yàn)殍b別食品的成分首先需要鑒別食物是什么種類。相對(duì)于質(zhì)譜等其他具體成分分析技術(shù)而言，DNA分析技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。DNA作為生物的遺傳物質(zhì)決定了生物種屬差異，且兩個(gè)物種在進(jìn)化上距離越遠(yuǎn)，DNA差異也就越大。DNA分析技術(shù)甚至可以被用來進(jìn)行生物的個(gè)體鑒定，如畜產(chǎn)品個(gè)體溯源等。

蛋白質(zhì)、代謝物、礦物元素等容易受氣候、環(huán)境以及食品加工過程影響而發(fā)生變化，相對(duì)而言，DNA則從動(dòng)植物生長(zhǎng)到成熟到深加工制品整個(gè)食物鏈上都具有非常好的一致性和深加工熱穩(wěn)定性，而且DNA在生物體的不同部位也都完全一致，使其成為食品真實(shí)性鑒別和溯源的最佳標(biāo)志物之一[10]。

20世紀(jì)90年代初，英國(guó)農(nóng)業(yè)、漁業(yè)和食品部（MAFF）開始資助研究開發(fā)檢測(cè)食品欺詐的分析方法，其中包括應(yīng)用法醫(yī)DNA圖譜來確定食品的真實(shí)性。但直到2003年歐洲馬肉風(fēng)波發(fā)生后，才真正推動(dòng)了DNA技術(shù)在食品真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用和發(fā)展。DNA分析技術(shù)早期的應(yīng)用包括從基因序列中簡(jiǎn)單鑒定單個(gè)肉類和魚類物種，以用于食品真實(shí)性鑒別。如今DNA技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到更廣泛的食品、農(nóng)產(chǎn)品、飼料真實(shí)性分析，包括植物源性食品鑒別（如果汁摻假）、轉(zhuǎn)基因食品（GMO）鑒別、植物品種鑒定（如印度巴斯馬蒂香米鑒別）、過敏原檢測(cè)、病原微生物的檢測(cè)與鑒定等。

目前，應(yīng)用于食品真實(shí)性分析的DNA分析技術(shù)主要分為3類。第1類是基于物種特異性單一DNA標(biāo)記的核酸擴(kuò)增分析技術(shù)。這類技術(shù)主要是針對(duì)食品中不同物種類型鑒別，這些物種通?？梢院Y選到單一DNA標(biāo)記，通過PCR或者等溫?cái)U(kuò)增等方法實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單快速的鑒定。第2類是基于DNA多態(tài)性位點(diǎn)的指紋圖譜分析技術(shù)。這類技術(shù)主要針對(duì)近緣物種或者同一物種內(nèi)部不同品種進(jìn)行分析，需要依據(jù)多個(gè)DNA多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行DNA指紋圖譜分析以實(shí)現(xiàn)鑒別，主要包括微衛(wèi)星技術(shù)、單核苷酸多態(tài)性技術(shù)等。第3類是基于DNA條形碼的測(cè)序分析技術(shù)。DNA條形碼作為物種鑒別的科學(xué)依據(jù)，尤其適合用于外觀形態(tài)遭受破壞的食品物種源性成分的鑒別，而且其作為非靶向性檢測(cè)方法，結(jié)合高通量測(cè)序，在混合食品中物種成分鑒定方面愈來愈受重視。

目前，基于DNA分析的食品真實(shí)性鑒別技術(shù)主要用于食品欺詐中物種源性成分分析，由于食品欺詐行為種類方式復(fù)雜多樣，因此針對(duì)特定的食品欺詐行為選擇合適的鑒別方法成為食品真實(shí)性鑒別的挑戰(zhàn)之一，有時(shí)可能需要多種方法聯(lián)用才能確定食品的真假以及來源。

二、物種特異性單一DNA標(biāo)記

物種特異性單一DNA標(biāo)記是指某物種特有的一段DNA序列，其在物種間的變異程度足夠可以通過PCR擴(kuò)增等技術(shù)手段與其他物種鑒別開，即通過檢測(cè)某一個(gè)目標(biāo)DNA片段達(dá)到識(shí)別食品中某個(gè)物種成分的目的。單一DNA標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)因簡(jiǎn)單、快速、直接，成為食品真實(shí)性定性鑒別的主要手段。當(dāng)然，選用單一DNA標(biāo)記進(jìn)行鑒別的前提是能夠找到具有物種特異性的DNA片段并且通過擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)出來。

（一）線粒體DNA標(biāo)記線粒體脫氧核糖核酸（mtDNA）或植物葉綠體等細(xì)胞器DNA和核染色體DNA（nDNA）區(qū)域都已經(jīng)被用于進(jìn)行物種鑒定，但使用線粒體DNA標(biāo)記的應(yīng)用更多。原因在于：一是動(dòng)物線粒體DNA具有更強(qiáng)的種間和種內(nèi)變異性[11]， 它是單倍體非重組DNA， 呈母系遺傳[12]，突變率比核染色體DNA高5～10倍，因此容易尋找到用于鑒別不同物種甚至是近緣物種的種屬特異性DNA標(biāo)記。二是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在大量的線粒體，每個(gè)細(xì)胞中線粒體數(shù)量大概從幾百到幾千個(gè)，而核染色體上DNA靶標(biāo)的豐度則要少得多。這樣對(duì)于同樣數(shù)量的樣品，線粒體DNA更多，容易分離獲得，也就意味著更好的靈敏度，適用于量少的樣品。三是相比于核染色體DNA，線粒體DNA對(duì)溫度、壓力抗性更強(qiáng)，更穩(wěn)定、抗降解，因此更適用于長(zhǎng)期久置的樣品（如頭發(fā)、骨骼以及牙齒等）以及加熱、加壓、加工處理后的食品。

與核染色體基因組相比，線粒體基因組較小，在動(dòng)物中線粒體基因組全長(zhǎng)一般16 000 bp，因此相對(duì)容易尋找合適的物種特異性DNA標(biāo)記。目前已經(jīng)報(bào)道了許多線粒體DNA標(biāo)記被用于物種的鑒別，其中最常用的是細(xì)胞色素b（Cytb）和D-loop。Cytb是整個(gè)線粒體基因組中最保守的區(qū)段，而D-loop則是物種間變異最大的區(qū)段，因此成為物種鑒別中最常用的目標(biāo)DNA標(biāo)記。其他常用的線粒體基因組標(biāo)記還包括12S rRNA、16S rRNA、COI、ND4、ATP6、ATP8、ND5、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)等。例如，2013年馬肉風(fēng)波后，歐盟推薦的鑒別馬肉的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法選擇的目標(biāo)基因片段即為線粒體DNA（ND4基因，NADH脫氫酶亞單位4）上的87 bp片段，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該區(qū)域有足夠的變異可以將馬肉特異性擴(kuò)增，而其他哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類等動(dòng)物，以及植物類大豆、玉米、蔬菜等共46種動(dòng)物和7種植物均沒有擴(kuò)增信號(hào)。

（二）核染色體DNA標(biāo)記除了線粒體DNA，近年來也有一些核染色體DNA標(biāo)記被篩選出來用于物種的鑒別，多用于定量分析。除了篩選物種特異性DNA片段外，篩選多個(gè)物種或者所有物種通用的DNA標(biāo)記在物種鑒別中也起到非常重要的作用。這類引物有時(shí)可以作為簡(jiǎn)化多重鑒別操作的手段[13～14]，有時(shí)也可以作為檢測(cè)某一類物種的標(biāo)記片段或者作為檢測(cè)的內(nèi)參質(zhì)控手段。有時(shí)線粒體DNA無法滿足要求，需要從核染色體上尋找合適的DNA標(biāo)記。例如，為了區(qū)分動(dòng)物與植物，經(jīng)常選用動(dòng)物編碼肌球蛋白的DNA片段來對(duì)動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測(cè)，其可以用于素食食品的鑒別。

另外近緣物種之間線粒體基因組非常相似，例如，歐洲野豬（Sus scrofa scrofa）和家豬（Sus scrofa domesticus）兩個(gè)物種線粒體基因組有99%的同源性（根據(jù)BLAST），而且只有一個(gè)位點(diǎn)突變，因此不能用于物種鑒定。這時(shí)可以從核染色體上尋找一些特定的性狀基因（如顏色決定基因MCR1）進(jìn)行鑒別[15～16]或者選擇DNA多態(tài)性標(biāo)記（如微衛(wèi)星位點(diǎn)）進(jìn)行鑒別[17]。

此外，線粒體數(shù)目通常在同一生物體的組織之間或來自不同個(gè)體的同一組織之間存在差異，在不同的細(xì)胞中數(shù)目也不同且高度可變，因而使得利用線粒體DNA標(biāo)記進(jìn)行食品摻假定量分析時(shí)的誤差變大。而核染色體DNA通常有更穩(wěn)定的拷貝數(shù)，不同組織、不同細(xì)胞間拷貝數(shù)一致，用來進(jìn)行食品摻假定量分析也就更為準(zhǔn)確[18～19]。目前，常用的核染色體物種鑒定DNA標(biāo)記有哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素受體（Growth hormone receptor，GHR）[18]、管家基因復(fù)制蛋白A1（Housekeeping gene replication protein A1，RPA1）[20]、核F2基因內(nèi)含子[21]、HEG1基因[22]、LHB基因[23]、藏紅花Mg-protoporphyrin monomethyl ester cyclase基因[24]、蜜蜂核基因組蜂王漿蛋白2（MRJP2）基因[25]等。另外，有些通用的核染色體單拷貝DNA標(biāo)記也被篩選出來作為摻假定量分析的參考?xì)w一化基因，例如哺乳動(dòng)物/家禽肌肉生長(zhǎng)抑制素基因[18，23]、魚通用基因a-skeletal actin[26]、魚類肌肉組織主要蛋白質(zhì)小清蛋白（Parvalbumin）的核基因內(nèi)含子[27]、魚PanI基因片段[28]等。

雖然單一DNA標(biāo)記更為簡(jiǎn)單直接，開發(fā)檢測(cè)方法也更為容易，但這類標(biāo)記主要適用于種屬的鑒別，因?yàn)樵谶M(jìn)化中已經(jīng)發(fā)展出足夠的種間變異用于區(qū)分不同的物種。很多情況下，同一種屬內(nèi)不同品種之間因?yàn)橛H緣關(guān)系較近，難以找到某單一DNA片段具有足夠的基因變異可以區(qū)分不同的品種，這時(shí)候就需要采用多個(gè)DNA標(biāo)記，一般是DNA多態(tài)性標(biāo)記來進(jìn)行食品的真實(shí)性鑒別。

三、物種特異性單一DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

目前，用于物種特異性單一DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)的技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)兩類。

（一）聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)現(xiàn)代DNA分析是建立在核酸擴(kuò)增（NAA）技術(shù)基礎(chǔ)上的，聚合酶鏈反應(yīng)則是核酸擴(kuò)增最主要的技術(shù)，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，包括第一代終點(diǎn)法PCR和第二代實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。

1.終點(diǎn)PCR法。終點(diǎn)PCR方法作為第一代PCR方法，需要依靠凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小進(jìn)行鑒定。最初物種鑒定方法都是基于終點(diǎn)PCR方法開發(fā)的，例如利用這種方法發(fā)現(xiàn)了我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)羊奶粉里摻牛奶粉的概率在25%，羊奶片的摻假率在50%[29]；利用同樣的方法在捷克羊奶酪產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)了牛奶成分摻假[30]；在埃及水牛奶鑒別中發(fā)現(xiàn)有14%完全是純牛奶，還有38%是摻假了牛奶的水牛奶[31]。終點(diǎn)法的優(yōu)點(diǎn)是擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不受限制可以從100 bp到1 000 bp，因此可以針對(duì)不同靶標(biāo)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段，在同一管中進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過電泳分離根據(jù)片段大小進(jìn)行多重檢測(cè)[32～33]。終點(diǎn)PCR方法的缺點(diǎn)是PCR完成后還需要通過凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，操作復(fù)雜。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)作為第二代PCR技術(shù)，通過摻入熒光染料或者采用熒光探針的方式，觀察熒光信號(hào)的強(qiáng)度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生，避免了傳統(tǒng)終點(diǎn)PCR方法依賴電泳觀察的繁雜操作步驟。同時(shí)，其具有半定量或者相對(duì)定量的優(yōu)點(diǎn)，而且在精密度、分析速度、靈敏度和自動(dòng)化方面也都有更好的性能，已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)、食品安全和分子診斷學(xué)中不可或缺的研究工具，也成為當(dāng)前食品真實(shí)性鑒別中最主要的技術(shù)。

目前已經(jīng)開發(fā)了多種用于動(dòng)植物源性成分鑒定的熒光定量PCR方法，常見肉類、魚類、植物物種源性鑒定的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等也都已經(jīng)發(fā)布。利用熒光定量PCR進(jìn)行物種鑒別是通過觀察熒光擴(kuò)增曲線進(jìn)行判斷，理論上，檢測(cè)到針對(duì)待測(cè)樣品的熒光探針擴(kuò)增信號(hào)被認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)，但是由于PCR方法高度靈敏，因此在實(shí)際中，經(jīng)常設(shè)定一個(gè)報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果的Ct閾值，避免潛在因?yàn)槲廴镜仍蛟斐傻募訇?yáng)性結(jié)果。

2013年馬肉風(fēng)波后，歐盟最先推薦的就是利用熒光定量PCR方法進(jìn)行牛肉中馬肉的鑒別，而且給出了具體的引物探針序列和操作方法標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（SOP），如前所述，該方法對(duì)馬肉鑒別非常特異，低至0.1%的馬肉也可以準(zhǔn)確的檢出。

3.多重PCR方法。在很多情況下，食品摻假經(jīng)常可能摻有多種可能的成分，因此需要開發(fā)多重PCR方法，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)。多重定量PCR方法主要分為3類：第1類是傳統(tǒng)PCR方法，根據(jù)不同鑒別對(duì)象擴(kuò)增后產(chǎn)生的片段大小的不同，可以通過電泳進(jìn)行鑒別[32，34～36]。第2類是通過Taqman探針法熒光定量PCR，這類方法主要依靠設(shè)計(jì)多個(gè)波長(zhǎng)的熒光探針，實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)[37～38]。第3類是染料法熒光定量PCR，也稱為熔解曲線法（High resolution melt，HRM）。不同物種DNA片段擴(kuò)增Tm值不同，通過熔解曲線進(jìn)行鑒別。例如，利用通用引物對(duì)Cytb基因148 bp片段進(jìn)行擴(kuò)增，可以同時(shí)對(duì)牛、羊、家豬、馬、穴兔、雞、野生火雞和鵪鶉肉類進(jìn)行鑒別[39]。SOARES等[40]以中華蜜蜂和意大利蜜蜂的16SrRNA基因?yàn)榘悬c(diǎn)，開發(fā)了基于高分辨率熔解分析的實(shí)時(shí)PCR方法用于兩種蜂蜜的鑒別。目前利用線粒體不同DNA標(biāo)記，已經(jīng)開發(fā)了很多多重肉類[41～44]、奶類[45]的鑒別方法。

但是基于PCR擴(kuò)增的DNA分析方法在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)遇到一些因素的限制，例如依賴復(fù)雜昂貴的熱循環(huán)儀器；復(fù)雜食品樣本在提取時(shí)會(huì)有抑制PCR擴(kuò)增的抑制劑從而影響擴(kuò)增效率等。為了解決這些問題，近年來多種基于等溫?cái)U(kuò)增的DNA分析方法被發(fā)展起來。

（二）等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等溫?cái)U(kuò)增方法不需要熱循環(huán)過程和復(fù)雜的熱循環(huán)儀器，與傳統(tǒng)的PCR方法相比，擴(kuò)增效率更高，因此擴(kuò)增時(shí)間更短。同時(shí)有研究表明，由于使用了與傳統(tǒng)Taq酶不同的、在等溫條件下擴(kuò)增的DNA聚合酶，其對(duì)復(fù)雜基質(zhì)（如食物和臨床樣本）中發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典PCR抑制劑具有更強(qiáng)的耐受性，也就意味著等溫?cái)U(kuò)增方法可以最大限度地簡(jiǎn)化樣本前處理過程[46～47]。再加上不需要昂貴復(fù)雜的熱循環(huán)儀器和擴(kuò)增時(shí)間的縮短，使得等溫?cái)U(kuò)增方法更適合于開發(fā)現(xiàn)場(chǎng)快速便攜式的鑒別方法。

目前已經(jīng)開發(fā)出基于多種原理的等溫?cái)U(kuò)增方法，如鏈置換擴(kuò)增（SDA）技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）技術(shù)、交叉引物擴(kuò)增（CPA）技術(shù)、依賴解旋酶DNA等溫?cái)U(kuò)增（HDA）技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)等。其中比較成熟且常用的技術(shù)包括LAMP技術(shù)和RPA技術(shù)。

1.LAMP技術(shù)。LAMP通常在60～65℃條件下進(jìn)行，4個(gè)內(nèi)部引物加2個(gè)外部引物在Bst DNA聚合酶的作用下，利用自動(dòng)循環(huán)鏈的位移實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA片段的快速擴(kuò)增。利用實(shí)時(shí)熒光LAMP方法，在有外引物存在的情況下，通常在15 min左右即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，30 min檢測(cè)完畢。同時(shí)由于采用了4～6條引物，賦予了其擴(kuò)增更高的特異性[48]，加上Bst酶本身對(duì)基質(zhì)干擾物的低敏感性，使其獲得了廣泛應(yīng)用。尤其是2020年LAMP技術(shù)專利過期后，該技術(shù)配套各種簡(jiǎn)易樣品前處理方法和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)裝置，被廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)領(lǐng)域。SUL等[49]開發(fā)了一種基于LAMP的針對(duì)16SrRNA基因的方法，用于肉類加工產(chǎn)品中雞肉的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，可從簡(jiǎn)易制備的樣品中直接檢測(cè)雞肉的存在，基因組靈敏度達(dá)到10 fg。利用LAMP技術(shù)還開發(fā)了鱈魚與油魚[50]，三文魚、大馬哈魚、虹鱒魚[51]，有毒蘑菇[52～54]等系列鑒別方法，并且通過將LAMP與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了多種奶產(chǎn)品的多重檢測(cè)[55]。

LAMP技術(shù)不足之處在于需要針對(duì)4～6個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物，因此引物設(shè)計(jì)過程相對(duì)復(fù)雜，同時(shí)由于多引物的存在，需要注意潛在的引物—引物非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性，需要仔細(xì)設(shè)計(jì)引物以及調(diào)整體系的引物濃度，開發(fā)起來相對(duì)PCR要復(fù)雜一些。此外，復(fù)雜的擴(kuò)增過程產(chǎn)生串聯(lián)擴(kuò)增產(chǎn)物，這限制了簡(jiǎn)單檢測(cè)方法（如瓊脂糖凝膠電泳）的使用，需要應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光等方法[56]。

2.RPA技術(shù)。RPA是一種相對(duì)較新的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其機(jī)制與PCR相似，但利用重組酶—引物復(fù)合物來識(shí)別和引發(fā)鏈位移，從而消除了對(duì)熱模板變性的需要，通過指數(shù)放大實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增，通常在20 min內(nèi)完成。同時(shí)RPA反應(yīng)溫度一般在37～42℃，對(duì)儀器的需求進(jìn)一步降低，結(jié)合新開發(fā)的實(shí)時(shí)熒光探針以及相對(duì)容易的多通道檢測(cè)，可滿足現(xiàn)場(chǎng)便攜、多種目標(biāo)快速檢測(cè)的需求。而且RPA還可以與試紙條技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)羊肉[57]、牦牛奶[58]等現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別。

3.其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。目前，其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也在食品真實(shí)性鑒別方面獲得了應(yīng)用。例如，利用CPA技術(shù)檢測(cè)肉類混合物中的羊肉物質(zhì)，其檢測(cè)限為1%（w/w）[59]。

相對(duì)于PCR技術(shù)，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)以其便于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用、對(duì)于復(fù)雜樣品基質(zhì)抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，正逐漸成為英國(guó)和歐盟食品真實(shí)性鑒別執(zhí)法中重點(diǎn)應(yīng)用的技術(shù)。新冠肺炎疫情的爆發(fā)促使現(xiàn)場(chǎng)便攜式乃至家用快速核酸檢測(cè)技術(shù)、裝備得到發(fā)展，將等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與側(cè)流層析試紙條技術(shù)[60～61]結(jié)合或者集成到微流體裝置中[62～64]，以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化、集成化，正成為等溫技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)。

四、DNA標(biāo)記分析用于深加工食品真實(shí)性鑒別的注意事項(xiàng)

需要指出的是，利用DNA標(biāo)記進(jìn)行食品真實(shí)性鑒別，尤其是深加工食品的鑒別，選擇的DNA目標(biāo)片段不適宜過長(zhǎng)，一般應(yīng)在250 pb以內(nèi)，最好在100 bp左右。這是因?yàn)楦邷馗邏旱燃庸l件能夠?qū)NA切割成短片段，且加工越多，條件也越苛刻，DNA降解越嚴(yán)重，例如，暴露在3.2×105Pa的壓力下會(huì)產(chǎn)生大約100 bp的片段。因此，針對(duì)深加工制品，設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段宜短不宜長(zhǎng)。當(dāng)然，在生肉或一般熟肉制品中，DNA不會(huì)降解那么多，但設(shè)計(jì)短DNA片段的方法應(yīng)用更廣，無論加工程度如何，都可以進(jìn)行檢測(cè)。為了應(yīng)對(duì)DNA目標(biāo)片段被降解，還有一種辦法就是設(shè)計(jì)兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)片段進(jìn)行檢測(cè)[65～66]，因?yàn)閮蓚€(gè)目標(biāo)片段同時(shí)都被降解掉的概率非常低，從而保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

目前DNA分析技術(shù)已經(jīng)成為食品真實(shí)性鑒別的重要支撐技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于與物種成分相關(guān)的食品真實(shí)性鑒別中，最常見的是肉類、奶類、轉(zhuǎn)基因食品、果汁等產(chǎn)品鑒別，這類產(chǎn)品DNA含量豐富，因此檢測(cè)相對(duì)容易。除了這些產(chǎn)品，基于DNA的真實(shí)性分析還被用于一些深加工制品，如葡萄酒[67]、 食用油[68～70]、 蜂蜜[40]等。 當(dāng)然對(duì)于這類產(chǎn)品進(jìn)行DNA分析需要優(yōu)化DNA提取方法[70～72]，因?yàn)樵诰珶捝罴庸さ倪^程中大部分DNA被去除[69]，剩余殘存DNA也存在降解嚴(yán)重的情況。因此，宜選用小片段目標(biāo)DNA以及在葉綠體或者線粒體中高拷貝數(shù)的目標(biāo)DNA片段，例如選用高拷貝數(shù)的植物5SDNA間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)作為目標(biāo)片段進(jìn)行菜籽油、玉米油、向日葵和大豆油鑒別，甚至可以對(duì)提取的模板進(jìn)一步稀釋達(dá)到減少PCR抑制的目的[68]。

五、未來發(fā)展趨勢(shì)與展望

綜上所述，在目前應(yīng)用于食品真實(shí)性鑒別的DNA分析技術(shù)中，基于物種單一性DNA標(biāo)記擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)是最為成熟、穩(wěn)定和可靠的技術(shù)，已經(jīng)被用于各類食品物種源性成分的鑒定。而且目前已經(jīng)開發(fā)有商品化的試劑盒，含有進(jìn)行食品物種鑒別的各種試劑，大大方便了食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者以及消費(fèi)者使用。如德國(guó)BIORON Diagnostics GmbH公司和BIOTECON Diagnostics GmbH公司提供了豬肉、駱駝肉、馬肉、牛肉、雞肉、火雞肉、山羊肉、綿羊肉、驢肉、鴨肉、蝦肉和蟹肉等肉類鑒別熒光定量PCR試劑盒，可用于生熟食品以及飼料樣品鑒別。美國(guó)Eurofins GeneScan公司也開發(fā)了動(dòng)物肉類鑒別系列定量PCR試劑盒，包括牛肉與野牛肉、豬肉（包括野豬肉）、牛肉與豬肉、雞肉、火雞肉、鴨肉、鵝肉、山羊肉、綿羊肉、馬肉、水牛肉和驢肉等。國(guó)內(nèi)北京新羿生物科技有限公司與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所合作，也推出了可用于豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、馬肉、驢肉、駱駝肉等常見肉類，以及大西洋鱈魚、太平洋鱈魚、油魚、三文魚、虹鱒魚、大馬哈魚等常見水產(chǎn)品的實(shí)時(shí)熒光LAMP試劑盒產(chǎn)品。

但是目前大部分熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，DNA提取步驟復(fù)雜，一般還需要在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，但無論生鮮食品還是熟制食品，其容易腐敗變質(zhì)的特性都需要現(xiàn)場(chǎng)快速的食品真實(shí)性鑒別方法，以不影響食品銷售等活動(dòng)。如前所述，近年來針對(duì)物種特異性單一DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)的熒光定量PCR技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在便攜快速檢測(cè)方面都取得了很大的進(jìn)步。尤其是全球新冠疫情促進(jìn)了現(xiàn)場(chǎng)乃至家用核酸快速檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)，這些技術(shù)也被平移到食品真實(shí)性鑒別領(lǐng)域，提高了食品物種源性成分鑒定的效率。這其中首先是DNA快速提取方法，各種DNA快速提取液的出現(xiàn)，避免了常規(guī)磁珠或膜柱法洗滌洗脫等多步驟操作，食品樣品中加入裂解液，簡(jiǎn)單裂解后即可取上清液用于后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。其次在擴(kuò)增方面，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)如LAMP或者RPA技術(shù)等顯現(xiàn)出了比熒光定量PCR更適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的前景。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要復(fù)雜昂貴的熱循環(huán)儀器，便于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，同時(shí)沒有升變溫、變性、復(fù)性的過程，擴(kuò)增效率更高，實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)可在30 min完成擴(kuò)增，而實(shí)時(shí)熒光R PA更快，可在20min內(nèi)完成擴(kuò)增。而且這兩種擴(kuò)增技術(shù)都采用了實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)法，邊反應(yīng)邊檢測(cè)，無需后續(xù)電泳或其他方法，結(jié)合快速DNA提取，基本上可以在30 min左右實(shí)現(xiàn)從提取到擴(kuò)增檢測(cè)全過程。近年來，LAMP及RPA技術(shù)還和微流控芯片、納米材料以及生物傳感器結(jié)合，開發(fā)了更加自動(dòng)化、集成化、便攜式的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)裝置，更進(jìn)一步提高了檢測(cè)的效率，其中等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和試紙條技術(shù)相結(jié)合，具有快速簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在食品真實(shí)性鑒別中顯示出良好的應(yīng)用前景[73～74]。

另外一個(gè)重要的問題就是定量和非靶向分析的問題。雖然本文只綜述了目前基于DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)的食品真實(shí)性定性鑒別方法，但是定量分析對(duì)食品摻假鑒別來說尤為重要。主要是因?yàn)槟壳盎趩我籇NA標(biāo)記的核酸擴(kuò)增方法靈敏度非常高，基本上1%甚至0.1%都能檢測(cè)出來。而這種含量很低的情況很多是由于和其他種類食品共用生產(chǎn)線，沒有清洗干凈而發(fā)生的無意沾染現(xiàn)象，并不是蓄意摻假。因此，為了更好的監(jiān)管和執(zhí)法，避免假陽(yáng)性的情況，需要對(duì)食品摻假進(jìn)行定量分析。除了定量，還有一個(gè)需要解決的問題是非靶向分析，即在食品摻假物種未知的情況下，可以對(duì)食品所包含的種類進(jìn)行鑒定，避免因?yàn)閾郊傥锓N未知無法檢測(cè)，出現(xiàn)假陰性的情況。目前已經(jīng)開發(fā)了一些基于DNA分析的食品摻假定量分析和非靶向分析方法，如熒光定量PCR、數(shù)字PCR、DNA條形碼、高通量測(cè)序技術(shù)等，但這些技術(shù)還不是非常成熟，處于發(fā)展完善之中。

除了商品化試劑盒促進(jìn)應(yīng)用，進(jìn)一步開發(fā)現(xiàn)場(chǎng)便攜式技術(shù)以及定量和非靶向分析方法之外，食品真實(shí)性鑒別與原來食品安全檢測(cè)相比，屬于一個(gè)比較新的領(lǐng)域，在標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面還需要進(jìn)一步加強(qiáng)。雖然我國(guó)已經(jīng)在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中制定了一系列食品、飼料物種源性成分的熒光定量PCR鑒定方法，但目前還不能形成體系，不能滿足市場(chǎng)檢測(cè)需求。同時(shí)作為參考物質(zhì)的食品真實(shí)性鑒別用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)樣品，市面上還幾乎沒有，因此也需要盡快研制常見食品種類的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)，提高鑒定的準(zhǔn)確性，最后形成一套比較完整的食品真實(shí)性鑒別技術(shù)體系。