氧化應(yīng)激與Nrf 2在支氣管肺發(fā)育不良中的機(jī)制研究

段蓉蓉 魯利群

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是好發(fā)于早產(chǎn)兒的難治性慢性呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為患兒生后28 d內(nèi)不能在空氣環(huán)境中維持血氧飽和度大于88%，仍需氧氣支持治療[1-2]，死亡率高達(dá)30%以上[3]。BPD的患病風(fēng)險(xiǎn)與出生時胎齡及體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)[4]，目前雖有多種治療方法，包括表面活性劑、產(chǎn)后類固醇和機(jī)械通氣等[5]，但其預(yù)后仍不良，多數(shù)BPD幸存者遺留生長發(fā)育遲緩、視網(wǎng)膜病變、學(xué)習(xí)障礙、神經(jīng)感覺障礙、肺功能障礙等[6-9]。研究[3,5-9]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和慢性炎癥是BPD的2大關(guān)鍵危險(xiǎn)因素，而核因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid-related factor 2, Nrf 2)是抗氧化系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，其通過與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)作用來控制多種抗氧化酶的表達(dá)，并可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)肺泡細(xì)胞和肺血管，對BPD患兒起到保護(hù)作用。本文就氧化應(yīng)激導(dǎo)致BPD的損傷機(jī)制、Nrf 2的激活途徑、Nrf 2介導(dǎo)的抗氧化途徑對BPD的保護(hù)作用進(jìn)行綜述如下。

1 氧化應(yīng)激在BPD中的作用機(jī)制

1.1 氧化應(yīng)激與BPD的病理改變 氧化應(yīng)激是因各種內(nèi)在或外在因素造成的活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成過量或降解減少，導(dǎo)致氧化和抗氧化防御系統(tǒng)不平衡而發(fā)生的一系列適應(yīng)性反應(yīng)[10]。ROS包括自由基和非自由基含氧分子，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡和壞死等分子反應(yīng)，其通過自由基引起的氧化應(yīng)激和氧化還原反應(yīng)失衡[11]，對細(xì)胞中的核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和膜脂等造成損害[7,12]。ROS與包括BPD在內(nèi)的許多肺部疾病的病理變化都有關(guān)，過早暴露于高氧環(huán)境和ROS中是BPD的主要危險(xiǎn)因素。BPD的病理特征是肺泡簡單化、肺微血管發(fā)育不良及肺小中血管閉塞、彈性組織增加、炎性因子增加和肺水腫[7,13-16]，主要表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性和阻塞性通氣功能障礙[7]，以及肺組織通氣損傷導(dǎo)致的肺纖維化[17]，進(jìn)而致肺功能受損、肺血管過度重構(gòu)和右心室肌肥大[13]。

1.2 氧化應(yīng)激致BPD的損傷機(jī)制 現(xiàn)有醫(yī)療發(fā)展水平下早產(chǎn)兒的生存率逐步增高，其中氧療是早產(chǎn)兒疾病治療的常用方法。氧作為一種環(huán)境刺激物，能調(diào)節(jié)肺的正常發(fā)育，但高氧環(huán)境的長期刺激會使ROS積累過量而發(fā)生氧化應(yīng)激，后者通過破壞生長因子信號傳導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)組裝、細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成等影響肺的發(fā)育[18]，甚至引起不可逆轉(zhuǎn)的肺發(fā)育異常。

1.2.1 氧化應(yīng)激致BPD II型肺泡上皮細(xì)胞死亡的機(jī)制 細(xì)胞死亡的3種主要方式包括細(xì)胞凋亡、自噬和程序性細(xì)胞壞死，3者均可被調(diào)控。程序性壞死是因特異性受體被激活后細(xì)胞穩(wěn)態(tài)破壞而引起的細(xì)胞死亡，調(diào)控壞死特異性受體的3個關(guān)鍵蛋白是受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1, RIP1)、RIP3和混合系激酶區(qū)域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein, MLKL)，3者的聯(lián)合作用可形成壞死性小體信號復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞壞死增加,且細(xì)胞壞死和ROS產(chǎn)生密切相關(guān)[19-20]。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells, AECⅡ)可調(diào)節(jié)肺組織體液穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)肺組織重塑。當(dāng)受到大量氧自由基刺激時，其細(xì)胞膜完整性被高氧相關(guān)的炎癥因子和氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物破壞，導(dǎo)致其細(xì)胞功能障礙和發(fā)生能量衰竭[21]。Han等[20]研究表明，BPD中高氧暴露后發(fā)生氧化應(yīng)激，引起RIP1、RIP3和 MLKL等促進(jìn)壞死的關(guān)鍵蛋白表達(dá)增加，從而加速肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生壞死，ROS產(chǎn)生增加，使肺組織受損。另有研究[7]認(rèn)為，高氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致AECⅡ過度凋亡并抑制其增殖，影響AECⅡ在肺組織生長、成熟、創(chuàng)傷修復(fù)過程和肺液穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中的作用，從而導(dǎo)致肺損傷，最終發(fā)展為BPD。

1.2.2 氧化應(yīng)激致BPD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的機(jī)制 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可介導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成、折疊和修飾，折疊使蛋白質(zhì)獲得其功能性三維結(jié)構(gòu)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的折疊需求增加或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受損時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則通過觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)來處理以上情況。在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞時，慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會導(dǎo)致ROS的生成增多和炎癥因子表達(dá)增加，通常會通過依賴或獨(dú)立于線粒體的途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Teng等[22]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對氧化應(yīng)激敏感，高氧引起的BPD中氧化應(yīng)激通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致ROS生成增多和炎癥反應(yīng)加重，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而損傷發(fā)育中的肺組織。

1.2.3 氧化應(yīng)激加重BPD炎癥反應(yīng)的機(jī)制 在氧化應(yīng)激的情況下，過量的ROS引起巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞過度激活，生成大量炎癥相關(guān)因子，且可引起ROS進(jìn)一步釋放[23]。因此，高氧可使多種促炎細(xì)胞因子激活，刺激肺部的腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)等炎癥因子的表達(dá)以及中性粒細(xì)胞的積累，從而損傷肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。高氧誘導(dǎo)的BPD中氧化應(yīng)激通過激活肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中依賴于還原性輔酶Ⅱ氧化酶的超氧陰離子的產(chǎn)生使炎癥加重，炎性因子的慢性增加引起肺部受損、肺泡死亡細(xì)胞增多，導(dǎo)致肺損傷[24]。因此，高氧引發(fā)的氧化應(yīng)激以及因氧化應(yīng)激加重的肺部炎癥是BPD發(fā)病的重要因素。

2 Nrf 2的抗氧化應(yīng)激作用

Nrf 2是一種具有亮氨酸拉鏈的調(diào)控抗氧化系統(tǒng)的快速反應(yīng)模塊蛋白，包含7個不同功能的Nrf 2-ECH同源結(jié)構(gòu)域(Neh1、Neh2、 Ne/3、 Ne/4、 Ne/5、 Ne/6、 Neh 7)。Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)是維持Nrf 2持續(xù)泛素化并調(diào)節(jié)其降解的蛋白，Neh2結(jié)構(gòu)域包含2個氨基酸序列，其負(fù)責(zé)與Keap1相互作用以維持Nrf 2的蛋白水平[25]。Nrf 2參與對氧化和外源性應(yīng)激的反應(yīng)、線粒體呼吸、干細(xì)胞靜止、mRNA翻譯、自噬等不同的細(xì)胞代謝過程,其介導(dǎo)200多個抗氧化酶和清除ROS蛋白的表達(dá)，這些蛋白能有效中和或解毒內(nèi)源性親電代謝物和環(huán)境毒物[12]。研究[26]顯示，Nrf 2在細(xì)胞核通過與ARE結(jié)合來調(diào)控超氧化物歧化酶、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1, HO-1)和谷胱甘肽過氧化物酶等多種提供中和外毒素的物質(zhì)或具有抗氧化應(yīng)激能力的酶的表達(dá)，促進(jìn)抗氧化反應(yīng)的發(fā)生，減輕氧化應(yīng)激造成的機(jī)體損害，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)的作用。另外，Nrf 2還可通過降低促炎因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，其介導(dǎo)的信號通路能減輕高氧導(dǎo)致的肺損傷，對損傷后肺穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)起到積極作用。

3 Nrf 2在BPD中的保護(hù)作用

3.1 Nrf 2介導(dǎo)的抗氧化及其激活途徑

3.1.1 Keap1-Nrf 2-ARE通路 在穩(wěn)態(tài)條件下，Nrf 2位于細(xì)胞質(zhì)并與Keap1結(jié)合形成復(fù)合物，Keap1通過調(diào)節(jié)Nrf 2的降解使Nrf 2的表達(dá)始終維持在一定水平；當(dāng)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，Nrf 2與Keap1形成的復(fù)合物發(fā)生分離，Nrf 2隨后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并與ARE結(jié)合以激活一組細(xì)胞保護(hù)基因[25,27]。因此，Keap1-Nrf 2-ARE信號通路被認(rèn)為是體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路[28-29]，這一途徑涉及抗氧化防御、氧化還原平衡和解毒等多個細(xì)胞代謝過程[30]。

在Keap1-Nrf 2-ARE信號通路中，Nrf 2調(diào)控的抗氧化酶HO-1在抵御氧化因素和凋亡引起細(xì)胞組織損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HO是血紅素代謝過程中必不可少的酶，HO-1是其3種同工酶中的一種，包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的多種理化因素均可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，亦稱為誘導(dǎo)型HO[31]。HO-1是具有抗氧化應(yīng)激、減輕炎癥和抗凋亡作用的應(yīng)激蛋白，在血紅素代謝過程中將血紅素分解為亞鐵、一氧化碳和膽綠素，其中血紅素和膽綠素分別具有促氧化和ROS清除作用。研究[32]表明，在小鼠高氧肺損傷模型中，低、中劑量的依托咪酯麻醉劑可通過激活Keap1-Nrf 2-ARE通路來上調(diào)HO-1的表達(dá)，對肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管的具有保護(hù)作用；冬蟲夏草素同樣可以通過激活Nrf 2途徑來上調(diào)HO-1的表達(dá)，減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的炎癥反應(yīng)，降低肺受損的程度[23]。

3.1.2p62-Keap1-Nrf 2通路及Nrf 2的激活途徑 自噬是與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要蛋白質(zhì)降解途徑，自噬受體蛋白p62(sequestosome-1)參與細(xì)胞自噬、細(xì)胞內(nèi)信號傳遞、氧化還原反應(yīng)等過程，其關(guān)鍵作用是將泛素化的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白酶體中實(shí)行降解，ROS的積累可激活p62參與降解受損的細(xì)胞器和有害蛋白。p62是Keap1蛋白水平的調(diào)控蛋白，在穩(wěn)態(tài)情況下，p62可直接與Keap1結(jié)合，使Keap1通過自噬穩(wěn)定降解，維持在一定水平；應(yīng)激狀態(tài)下，磷酸化的p62與Keap1的結(jié)合增強(qiáng)，干擾Nrf 2的核易位[28]。

因此，Nrf 2激活途徑分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，經(jīng)典途徑是Nrf 2激活的主要機(jī)制，其基礎(chǔ)是Nrf 2與Keap1的非活性復(fù)合物分離，隨后Nrf 2發(fā)生核易位；非經(jīng)典途徑則是由p62介導(dǎo)的自噬[30]。Zhao等[28]研究發(fā)現(xiàn)，自噬激動劑能夠通過抑制p62磷酸化，從而加快Keap1降解使Nrf 2核易位增多，提高Keap1-Nrf 2信號通路的活性，促進(jìn)下游抗氧化酶的表達(dá)，從而增強(qiáng)抗氧化能力，減輕BPD小鼠肺泡結(jié)構(gòu)簡單化的程度，表明p62-Keap1-Nrf 2信號通路在減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肺損傷中具有重要作用。

3.2 Nrf 2參與的其他保護(hù)途徑

3.2.1 抗炎途徑 炎癥也是BPD形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，肺泡巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生活性氧和包括IL-1β在內(nèi)的細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促炎癥細(xì)胞因子IL-1β參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展，因而IL-1β能加快BPD的發(fā)展進(jìn)程。硫氧還蛋白還原酶1是Nrf 2激活的抑制劑，在BPD的小鼠模型中，金諾芬藥物通過抑制硫氧還蛋白還原酶1來促進(jìn)脂多糖處理的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中Nrf 2的激活，結(jié)果IL-1β的表達(dá)水平降低，提示Nrf 2能通過降低IL-1β的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，減慢BPD的發(fā)展進(jìn)程[33]。

3.2.2 抗凋亡途徑 微小RNA-125b (microRNA-125b, miR-125b)是一種微小核糖核酸，由miR-125b-1和miR-125b-2組成，可避免內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激下過度凋亡，在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程中扮演著緊要角色。研究[34]證明，在A549肺癌人類肺泡上皮細(xì)胞和新生大鼠BPD模型中，Nrf 2受抑制的同時miR-125b也受到同樣的抑制，細(xì)胞凋亡明顯增加，并且Nrf 2可提高新生鼠在高氧條件下的存活率，減輕高氧誘導(dǎo)的肺泡生長抑制，這些結(jié)果均提示調(diào)控Nrf 2的下游靶點(diǎn)miR-125b，從而減少肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，有助于預(yù)防BPD的發(fā)生。

此外，PI3K/Akt通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生命歷程的重要信號通路。在應(yīng)激狀態(tài)下，蘇氨酸激酶(Akt)被激活，通過磷酸化促凋亡蛋白以避免激活細(xì)胞凋亡途徑，在促進(jìn)細(xì)胞存活方面發(fā)揮著重要作用。研究[35]認(rèn)為，Nrf 2參與的其他保護(hù)性途徑中， PI3K/Akt信號通路在肺上皮細(xì)胞Nrf 2的激活中是必要的，高氧過程中 PI3K/Akt通路被抑制，Nrf 2靶基因的表達(dá)同樣受到抑制，并伴隨肺損傷和肺部炎癥的加重，這表明激活 PI3K/Akt-Nrf 2信號通路可通過減少細(xì)胞凋亡來減輕高氧誘導(dǎo)的肺損傷和炎癥。

4 小結(jié)與展望

氧化應(yīng)激導(dǎo)致AECⅡ和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡和壞死、促炎因子的增加，以及氧化應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加，均是BPD發(fā)生的重要原因。Nrf 2作為抗氧化系統(tǒng)最主要的調(diào)控因子，通過介導(dǎo)Keap1-Nrf 2-ARE、p62-Keap1-Nrf 2和PI3K/Akt-Nrf 2等信號通路誘導(dǎo)抗氧化酶或抑制凋亡基因的表達(dá)，并通過調(diào)控抗炎反應(yīng)減輕BPD肺泡簡單化和肺微血管發(fā)育不良程度，對BPD患兒起保護(hù)作用。目前，BPD中氧化應(yīng)激引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致BPD的損傷機(jī)制、PI3K/Akt-Nrf 2通路及Nrf 2參與的抗凋亡作用均未完全闡明，相信隨著研究的不斷深入，將為Nrf 2相關(guān)抗氧化應(yīng)激治療BPD應(yīng)用于臨床提供更多理論支持。