直投式乳酸菌發(fā)酵蘋果汁飲料工藝優(yōu)化

宋 曦，王 菲，王應(yīng)強

（隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽 745000）

慶陽位于甘肅省東部，是我國蘋果優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)之一，已形成規(guī)?；a(chǎn)、銷售模式，晝夜溫差大，日照時間長，因此慶陽蘋果各類營養(yǎng)素含量較高[1-4]。隨著蘋果種植業(yè)的發(fā)展，目前慶陽市已經(jīng)形成了“龍頭企業(yè)＋合作社＋農(nóng)戶”的生產(chǎn)模式，但蘋果采后以簡單貯藏為主，缺乏大型商業(yè)化冷庫，影響蘋果的貯藏期，產(chǎn)品損耗較大[5]。慶陽蘋果銷售以鮮果為主，非商品果主要加工成果汁，產(chǎn)品單一，且不同品種蘋果加工果汁品質(zhì)難以控制，酸度不夠，導(dǎo)致其市場競爭力較弱，所以開發(fā)新的蘋果加工產(chǎn)品，對提高果農(nóng)種植收益，豐富蘋果加工品非常重要[5-6]。

乳酸菌作為益生菌，目前在發(fā)酵果汁飲料的開發(fā)中應(yīng)用較多，通過乳酸菌發(fā)酵可以提高果汁酸度，增加果汁中功能因子含量，提高果汁營養(yǎng)價值和商品價值[7-8]。直投式乳酸菌是一類不需要活化、增殖，是可以直接投入生產(chǎn)中使用的產(chǎn)品，具有安全性高、活菌數(shù)量多等優(yōu)點，能夠縮短發(fā)酵生產(chǎn)周期，同時產(chǎn)生益生因子，提高機體免疫力，調(diào)整腸道微生態(tài)等，直投式乳酸菌在發(fā)酵泡菜中應(yīng)用較廣，在發(fā)酵蘋果汁中應(yīng)用較少[9-12]。慶陽作為蘋果產(chǎn)區(qū)，開發(fā)直投式乳酸菌發(fā)酵蘋果汁產(chǎn)品，可以豐富蘋果加工產(chǎn)品種類，增加果農(nóng)收入，提高農(nóng)產(chǎn)品的商業(yè)價值，為當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟社會發(fā)展做出貢獻。本試驗利用Design-Expert 軟件進行了Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計，優(yōu)選出最適的直投式乳酸菌發(fā)酵蘋果汁飲料的工藝條件，為生產(chǎn)發(fā)酵型蘋果汁提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蘋果汁，果汁濃度100%，經(jīng)銷商為鎮(zhèn)江泛亞進出口貿(mào)易有限公司；乳酸菌種YO-MIX883 LYO，法國丹尼克斯。

乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、水蘇糖、棉籽糖、牛皮膠原蛋白（含量99%）、玉米低聚肽、大豆分離蛋白、乳清蛋白粉，均為食品級，山東齊魯生物科技公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，200706880，美國雙杰兄弟有限公司；立式全溫振蕩培養(yǎng)箱，ZQPL-200，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；酸度計，PHS-25，上海越平科學(xué)儀器有限公司；手持糖度計，OKW-15，山東恒安電子科技有限公司；冷藏冷凍箱，BCD-206STPH，青島海爾股份有限公司。

1.2 方法

將100 mL 蘋果汁加入200 mL 經(jīng)滅菌的玻璃酸奶瓶中，添加不同的無菌碳源、氮源，在超凈工作臺上接種直投式乳酸菌發(fā)酵劑后，放置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，最終得到發(fā)酵蘋果汁飲料。

1.3 單因素試驗

1.3.1 果汁濃度對發(fā)酵蘋果汁飲料的影響

將原蘋果汁濃度設(shè)置成15%、25%、35%、45%、55%、65%的水溶液，接種0.3%直投式乳酸菌，37 ℃發(fā)酵24 h，測定pH 值，根據(jù)感官評分選出最適蘋果果汁濃度。

1.3.2 碳源對發(fā)酵蘋果汁的影響

將乳糖、葡萄糖、水蘇糖、棉籽糖、蔗糖、結(jié)晶果糖按照10%的比例分別加入35%的蘋果汁中，接種0.3%乳酸菌，37 ℃發(fā)酵24 h，考察不同碳源對發(fā)酵蘋果汁品質(zhì)的影響，測定果汁pH 值，根據(jù)感官評分篩選乳酸菌發(fā)酵的最適碳源。

1.3.3 氮源對發(fā)酵蘋果汁的影響

將牛皮膠原蛋白、天然玉米低聚肽、大豆分離蛋白、乳清蛋白粉按照6%的比例分別加入濃度為35%的蘋果汁中，添加10%的葡萄糖，接種0.3%的乳酸菌，37 ℃發(fā)酵24 h，測定果汁pH 值，根據(jù)感官評分篩選乳酸菌發(fā)酵最適氮源。

1.3.4 碳源添加量對發(fā)酵果汁的影響

將乳酸菌發(fā)酵最適碳源分別按照8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%添加到發(fā)酵果汁中，接種0.3%的乳酸菌，37 ℃發(fā)酵24 h，根據(jù)感官評價確定最適的碳源添加量。

1.3.5 氮源添加量對發(fā)酵果汁的影響

將乳酸菌發(fā)酵最適氮源分別按照5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%添加到發(fā)酵蘋果汁中，接種0.3%乳酸菌，37 ℃發(fā)酵24 h，根據(jù)感官評價確定最適氮源添加量。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化工藝試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design-expert 8.0.6 分析軟件進行Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計，以感官評價值（Y）為響應(yīng)值，分別選取果汁濃度、碳源添加量、氮源添加量3 個因素，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，試驗因素水平表見表1（見下頁）。

表1 Box-Behnken 試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.5 測定指標與方法

1.5.1 還原糖含量測定

參照GB 5009.7—2016 測定食品中還原糖含量[14]。

1.5.2 果汁pH 值測定

1.5.3 感官評定

邀請8 名工作人員對乳酸菌發(fā)酵蘋果汁進行感官評價，考察指標為組織形態(tài)、香味、滋味、色澤，滿分100 分，具體評分標準如表2 所示[15]。

表2 發(fā)酵蘋果汁感官評分標準Table 2 Sensory standards for apple juice

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Origin 8.0 作圖，采用Design-expert 8.0.6 軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 果汁濃度對發(fā)酵蘋果汁品質(zhì)的影響

由表3 可知，隨著蘋果汁濃度升高，發(fā)酵蘋果汁酸度也逐漸增大，當(dāng)果汁濃度達到65%時，發(fā)酵蘋果汁pH 值為4.1，主要原因是果汁中營養(yǎng)成分越多，乳酸菌的生長越快，產(chǎn)乳酸量越多，所以酸度越大，酸的強度與其果汁的含量有顯著的關(guān)系[16]。

中國營養(yǎng)保健食品協(xié)會發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)前我國特殊食品（包括保健食品、嬰幼兒配方乳粉、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品以及嬰幼兒輔食等）年產(chǎn)值約6000億元，并保持持續(xù)增長態(tài)勢。

表3 不同蘋果汁濃度對發(fā)酵蘋果汁感官評價的影響Table 3 Sensory evaluation of fermented juice with different juice concentration

感官評價結(jié)果顯示，發(fā)酵蘋果汁的質(zhì)地、色澤和口感都會隨果汁濃度的變化而變化。隨著果汁濃度的增大，感官評價得分先增加后降低。當(dāng)蘋果汁濃度為15%、25%時，果汁含量低，發(fā)酵果汁雖然質(zhì)地透亮，但色澤較淡，不具有典型的蘋果香氣。當(dāng)果汁濃度為35%時，發(fā)酵蘋果汁的感官評分最高，為80.25。當(dāng)果汁濃度為45%、55%時，制得的產(chǎn)品有沁人心脾的蘋果香味，但發(fā)酵風(fēng)味不顯著，且存在沉積物，口感略微酸澀，果汁濃度大提高了生產(chǎn)成本。因此，在保證口感俱佳的前提下，選擇35%的蘋果汁濃度進行后續(xù)試驗。

2.1.2 碳源對發(fā)酵蘋果汁品質(zhì)的影響

碳源是微生物的6 大營養(yǎng)物質(zhì)之一，乳酸菌可以通過糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，但不同的糖利用程度不同。從表4 可以看出，與其他糖類相比，直投式乳酸菌在蘋果汁中對碳源的利用率從大到小依次為葡萄糖、棉籽糖、乳糖、蔗糖、果糖、水蘇糖，可以看出當(dāng)碳源為葡萄糖時，發(fā)酵蘋果汁的感官評分最高，其滋味和香味更容易被人接受。因此選用葡萄糖作為碳源。

表4 碳源對發(fā)酵蘋果汁的影響Table 4 Effects of carbon source on fermented apple juice

2.1.3 氮源對發(fā)酵蘋果汁品質(zhì)的影響

添加不同氮源發(fā)酵蘋果汁，結(jié)果表明添加乳清蛋白粉發(fā)酵蘋果汁酸度最大，可以達到4.43，變化最為明顯。在相同的發(fā)酵條件下，采用乳清蛋白粉進行發(fā)酵的蘋果汁具有更好的香味和滋味，感官評價得分見表5。

表5 不同氮源對發(fā)酵蘋果汁品質(zhì)的影響Table 5 Effect of different nitrogen sources on the quality of fermented apple juice

乳酸菌可以通過將不同氮源分解形成低分子的寡肽以適應(yīng)其自身的生長需求。結(jié)果表明，添加氮源有利于促進乳酸菌的生長和風(fēng)味成分的產(chǎn)生，從而使產(chǎn)品感官質(zhì)量更好[17]。乳清蛋白粉經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后可產(chǎn)生大量的功能性多肽，具有抑制血管緊張轉(zhuǎn)化酶活性、抗氧化等功能[18]。由表5 可知，添加乳清蛋白粉發(fā)酵的蘋果汁感官評分最高，具有乳香味，更容易被人們接受。因此，氮源選擇乳清蛋白粉。

2.1.4 碳源添加量對發(fā)酵果汁品質(zhì)的影響

由表6 可知，隨著葡萄糖添加量的增加，發(fā)酵蘋果汁的感官評分先增大后減小，當(dāng)添加量為12%時，發(fā)酵蘋果汁感官評分最高，為82.63 分。微生物繁殖過程中，不同碳源對果汁的發(fā)酵風(fēng)味有一定影響。感官評價結(jié)果表明乳酸菌發(fā)酵蘋果汁中以葡萄糖為碳源，添加量低時果汁發(fā)酵風(fēng)味較差，口感酸澀，添加量過高果汁過甜，酸度不夠。因此，將葡萄糖添加量設(shè)置為12%。

表6 碳源添加量對發(fā)酵果汁品質(zhì)影響Table 6 Effect of carbon source addition on the quality of fermented apple juice

2.1.5 氮源添加量對發(fā)酵果汁品質(zhì)影響

乳清蛋白粉可作為食品營養(yǎng)強化劑，本身具有獨特的牛乳香氣，控制其添加量，可為發(fā)酵果汁提供新的風(fēng)味。由表7 可以看出，隨著乳清蛋白粉含量的增加，發(fā)酵蘋果汁感官評得分逐漸降低。當(dāng)乳清蛋白粉添加量少時，發(fā)酵香味較好，這是由于果汁中的氮源適宜，有利于乳酸菌繁殖，發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)較好。當(dāng)乳清蛋白粉的含量增加時，發(fā)酵果汁色澤明顯加深，果汁更加濃稠，同時乳清蛋白粉本身具有獨有的風(fēng)味，會影響果汁整體的風(fēng)味，而乳清蛋白粉添加量低于5.0%時，果汁色澤較淡，酸度較低，整體風(fēng)味不足，所以乳清蛋白粉添加量設(shè)置為5.0%。

表7 氮源添加量對發(fā)酵果汁品質(zhì)影響Table 7 Effect of nitrogen source addition on the quality of fermented juice

2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

選取蘋果汁濃度（A）、氮源添加量（B）、碳源添加量（C）三個因素，以感官評價得分為響應(yīng)值，設(shè)計3 因素3水平響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表8（見下頁）。

表8 響應(yīng)面Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 8 Design and results of response surface Box-Behnken test

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，感官評價得分（y）對自變量果汁濃度（A）、氮源添加量（B）、碳源添加量（C）建立回歸模型，得到的方程為y=80.12+2.40A-0.29B+0.89C-0.020AB-0.15AC-0.006BC+0.038A2-1.16B2-0.87C2。

回歸模型方程方差分析結(jié)果見表9。

由表9 可知，響應(yīng)面試驗設(shè)計擬合模型呈極顯著水平（P＜0.01），且失擬項不顯著（P＞0.05），說明回歸方程預(yù)測響應(yīng)值有較好的擬合度，試驗設(shè)計準確可靠，可以用此模型分析和預(yù)測乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的工藝。在響應(yīng)值為感官評價結(jié)果的模型中，A（蘋果汁濃度）、B（氮源添加量）、C（碳源添加量）及B2、C2的交互作用對蘋果汁的感官評價有顯著的影響，AB、AC、BC 和A2對其影響不顯著。因此，影響蘋果發(fā)酵汁感官質(zhì)量的主要因素依次是蘋果汁濃度、碳源添加量、氮源添加量。

表9 響應(yīng)面試驗方差分析表Table 9 The results of variance analysis

2.2.2 因素交互作用分析

由圖1 響應(yīng)曲面圖可以直觀地看出，蘋果汁濃度和氮源添加量有較為明顯的坡度，且等高線圖呈橢圓形，交互作用顯著，果汁濃度和碳源添加量之間交互作用較為顯著，氮源添加量和碳源添加量對果汁口感影響顯著。

圖1 各因素交互作用對感官評價的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface diagram of the interaction of factors on sensory evaluation

2.2.3 驗證試驗

響應(yīng)面試驗結(jié)果得出：發(fā)酵蘋果汁最佳工藝條件為乳酸菌接種量0.3%、果汁濃度35%、氮源5.18%、碳源12.42%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h，感官評價可達到86.32。為便于試驗操作，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為接種量0.3%、果汁濃度35%、氮源5%、碳源12.5%、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時間24 h，經(jīng)過試驗感官評價后得到86.96。通過與驗證試驗結(jié)果比較，說明最終試驗結(jié)果與該回歸模型擬合度良好。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的乳酸菌發(fā)酵蘋果汁條件具有較高的精準度和可靠性。

3 結(jié)論

本研究主要是以蘋果汁為原料，對發(fā)酵蘋果汁的條件進行優(yōu)化，單因素試驗得出：當(dāng)果汁濃度為35%時，發(fā)酵果汁口感色澤俱佳；在果汁中添加5%葡萄糖，此時蘋果汁色澤呈現(xiàn)原果汁光亮，有原蘋果汁香氣，口感酸甜可口；添加12%乳清蛋白粉，果汁有乳清蛋白粉獨特的風(fēng)味，使得蘋果汁口感多元化。響應(yīng)面試驗中根據(jù)方差分析可以得出對乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的影響因素主次為果汁濃度、碳源添加量、氮源添加量。通過Box-Behnken優(yōu)化試驗，得出直投式乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的最佳工藝條件是乳酸菌接種量為0.3%、果汁濃度35%、5%乳清蛋白粉、12.5%葡萄糖，37 ℃發(fā)酵24 h，經(jīng)過驗證試驗感官評價后得到86.96 分。