單細胞RNA測序技術在主動脈擴張性疾病中的應用

鄭 凱，任華亮，張望德，李春民

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院 血管外科，北京 100020)

主動脈擴張性疾病是主動脈的一種病理性擴張狀態(tài)，主要包括主動脈真性動脈瘤、假性動脈瘤和主動脈夾層，其代表疾病為主動脈夾層(aortic dissection，AD)和腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)[1]。Stanford B型 AD年發(fā)病率約為 3/10萬例，20%患者未入院即死亡，Stanford A型 AD的發(fā)病率和病死率則更高[2]。40歲以上高危人群AAA的患病率為0.33%，破裂性 AAA病死率高達50%～70%，加上未及時手術的破裂性AAA，其總死亡率可高達90%[3]。

目前，主動脈擴張性疾病的治療方式主要包括手術和介入治療，手術過程復雜、風險大，對患者創(chuàng)傷大且費用較高，并無有效的藥物預防和治療措施，以至于其發(fā)生、發(fā)展機制成為當前研究的熱點問題。以往的研究基本都是反映疾病發(fā)展過程中某個時間點的靜態(tài)特征，并未從根本上揭示主動脈擴張疾病的發(fā)病機制。隨著新興技術手段的突破與應用，特別是單細胞測序技術的出現(xiàn)，為鑒定癌變細胞及其發(fā)展過程[4]、繪制組織器官發(fā)育轉錄圖譜[5]、加深對病原微生物活動過程的認知[6]提供了重要的研究途徑和方法，同樣也推動了對主動脈疾病發(fā)生發(fā)展機制更為全面而深刻的理解。

1 單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術概述

普通轉錄組(Bulk RNA)是生物組織樣品在某個時間對應的所有mRNA轉錄情況，是樣品或組織中所有細胞轉錄組表達量的平均值，即是這些細胞“整體”的表征。然而，由于細胞異質性，相同表型細胞的遺傳信息也可能存在顯著差異，很多低豐度的信息會在“整體”表征中丟失，并不能反映樣品中所有細胞或者某一群細胞的狀態(tài)，因此需要對單個細胞的或者某一群細胞的轉錄狀態(tài)進行深入的研究。 單細胞RNA測序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技術的出現(xiàn)解決了這一問題，通過細胞懸液制備、mRNA反轉錄、文庫構建和高通量測序4個步驟，以高分辨率和準確性分析給定樣本中的每個細胞的轉錄組，識別新的細胞狀態(tài)和群體，來尋找同類細胞間的表型和功能差異。

目前常用的單細胞轉錄組平臺有10xGenomics、BD Rhapsody、Fluidigm C1、Bio-Rad等，其中10xGenomics是目前最為常用的單細胞捕獲平臺，不僅能夠一次性分離并標記500～10 000個單細胞，并在單細胞水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)新的細胞類型，還能基于大量的單細胞基因表達數(shù)據，提供細胞表達特征聚類、標志物篩選、亞群表達特征分析等，是一種高效的單細胞基因表達水平檢測技術[7]。

單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術在心血管研究中的應用已較為廣泛，除了識別罕見的細胞亞群外，還可以基于每個細胞的轉錄組進行細胞軌跡分析，這在闡明祖細胞或干細胞分化過程中的細胞狀態(tài)轉變方面有重要作用。此外，scRNA-seq能夠描繪小鼠和人的重要組織的轉錄和表觀遺傳圖譜，包括心臟和冠狀動脈組織，利用這些數(shù)據集，可以評估常見心血管細胞類型的器官特異性或組織特異性，例如內皮細胞、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)和成纖維細胞等。

2 單細胞RNA測序(scRNA-seq)在主動脈疾病中的研究進展

主動脈的管壁由細胞和細胞外基質組成，在生理情況下，這些組分能提供合適的管壁順應性和彈性強度，以適應血流動力學等外部環(huán)境的改變。然而，在疾病狀態(tài)下，各組分的失衡會導致動脈壁擴張、彈性減弱，從而引起主動脈瘤、夾層或破裂。

2.1 內皮細胞

血管內皮細胞完整的結構和功能可防止膠原纖維的降解以及彈性纖維和血管平滑肌細胞的破壞，對預防主動脈擴張有重要作用[8]。不同器官和組織的內皮細胞存在異質性，可能包含多種內皮細胞亞群，但異質性內皮細胞的種類和分子特征尚未闡明，并且血管再生或周轉的復雜性使得人們需要更好地了解內皮細胞亞群之間的相互作用，并確定控制這些過程的特定基因。單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術鑒別出3種內皮細胞亞群，證明了過渡過程中基因表達的顯著變化，并驗證了主動脈內皮的異質性以及先前提出的祖細胞與分化細胞之間的層次關系[9]。單細胞RNA測序(scRNA-seq)還識別出內皮細胞中動態(tài)調節(jié)的全套轉錄圖譜，同樣區(qū)分出小鼠主動脈中3種不同內皮細胞亞群，并發(fā)現(xiàn)不同亞群在細胞外基質產生、脂質處理和血管生成或淋巴功能方面的功能專門化[10]。

2.2 平滑肌細胞

血管平滑肌細胞(VSMCs)是主動脈中膜內的主要細胞成分，在維持主動脈收縮功能和穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。VSMCs具有調節(jié)自身表型的特性，目前有大量研究聚焦于VSMCs表型轉化的潛在分子機制。利用scRNA-seq技術分析彈性蛋白酶誘導的小鼠AAA樣本，鑒定出4種SMC亞群，并發(fā)現(xiàn)在AAA進展過程中，3個主要的SMC亞群的比例減少，而占比較少的SMC亞群增加，并伴有SMC收縮標志物的下調和促炎基因的上調，該實驗首次確定了AAA的主要血管細胞與動脈瘤相關的轉錄信號，這對于理解異質細胞在AAA中的作用具有重要意義[11]。利用scRNA-seq技術還發(fā)現(xiàn)了人升主動脈壁平滑肌細胞群體的異質性，鑒定出5種SMC相關亞群，包括收縮平滑肌細胞、應激平滑肌細胞，纖維肌細胞和兩種增殖平滑肌細胞[12]，兩實驗鑒定出不同種類的平滑肌細胞，可能是上述兩種模型在病理生理方面的內在差異的結果，其次可能與采用不同的數(shù)據分析和可視化的方法有關。以往小鼠動物實驗發(fā)現(xiàn)TGF-β 和Klf4是平滑肌細胞調制的潛在驅動因素，對馬凡綜合征(Marfan syndrome,MFS)患者主動脈根部標本進行scRNAseq，證實了人類具有類似的SMC表型調節(jié)模式，這是首次報道的來自人類MFS患者主動脈瘤組織的scRNA-seq數(shù)據[13]，未來需要更多的人類MFS樣本和非動脈瘤對照來確定主動脈瘤中最一致的調控基因。

2.3 免疫細胞

以往的研究證實，正常主動脈向病變狀態(tài)轉變的組織學環(huán)境以T、B淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞(Mφs)和肥大細胞等單核細胞浸潤為特征，其中一種最突出、最主要的細胞是巨噬細胞[14]。

最新研究發(fā)現(xiàn)了3種主要巨噬細胞亞群，包括駐留型巨噬細胞群(resident-like macrophages，RES-like macrophages)、 高表達IL-1b的炎性巨噬群和新發(fā)現(xiàn)的高表達髓系觸發(fā)受體2(Trem2)的巨噬細胞群(triggered receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2hi)。主動脈TREM2hi是首次發(fā)現(xiàn)的一種巨噬細胞亞群，其不僅在脂質處理和分解代謝過程中具有高度專門化的功能特征，而且參與破骨細胞的形成和破骨細胞功能執(zhí)行過程，預示著該細胞群可能在動脈粥樣硬化鈣化過程中起著特殊的作用[15]。

動脈粥樣硬化是在高脂血癥的背景下發(fā)展起來的一種慢性炎性反應，先前已經證明積極降脂可以促進斑塊的消退，且以巨噬細胞減少為特征。炎性反應過程的動態(tài)本質和Ly6chi單核細胞在斑塊中的作用有關，這些細胞以前只被認為對斑塊和炎性反應進展起作用，但現(xiàn)在卻顯示出抑制炎性反應的相反作用，未來可能是促進斑塊消退的一種潛在方法[16]。

研究表明泡沫巨噬細胞比內膜非泡沫巨噬細胞表達更少的炎性反應相關基因，而高表達與脂質代謝和運輸途徑相關的基因，包括膽固醇代謝和PPAR信號通路基因。相反，內膜非泡沫巨噬細胞富含參與炎性反應過程的基因，包括細胞因子-細胞因子相互作用受體、NF-κB、IL-17、TLR和TNF-α[17]。

利用scRNA-seq技術發(fā)現(xiàn)AAA中含有血源性單核細胞亞群(Mo/MU-2)、單核細胞來源的修復性巨噬細胞亞群(Mo/MU-3)、單核細胞源性炎性巨噬細胞(Mo/MU-4)和2種不同的主動脈駐留巨噬細胞(AR-Mac)亞群(Mo/MU-1和Mo/MU-5)，這5種亞群表現(xiàn)出促炎基因和抗炎基因的雙重表達[18]。通過對11例研究對象的升主動脈組織進行了scRNA-seq分析之后也分辨出5種巨噬細胞亞群，即M1-like1、M1-like2、M1-like3、M2-like1和M2-like2，因此，來自體外研究的傳統(tǒng)M1和M2二分法在闡述體內活化巨噬細胞動態(tài)程序的分子基礎方面是不夠的[12]。

流式細胞測量術不能完全闡明實際細胞亞群的復雜性，盡管特殊的白細胞亞群表達相同的主要譜系標記，但其在功能上可能是不同的。有研究應用scRNA-seq和質譜流式細胞測量技術(mass cytometry)，檢測到3個主要的B細胞亞群，闡釋了不同亞群在疾病中存在差異調節(jié)，并發(fā)現(xiàn)了預測人類的心血管事件可能性[19]。

T淋巴細胞是升主動脈組織中發(fā)現(xiàn)的最大細胞群，活化的CD4 T淋巴細胞(CD4-Active)、靜息CD4 T、調節(jié)性CD4 T淋巴細胞(CD4-Treg)表達不同的標記基因。研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化促進Treg細胞的可塑性，造成功能失調的干擾素IFNγ+Th1/Tregs的積聚，從而可能導致進一步的動脈炎性反應和動脈粥樣硬化[20]。

2.4 細胞外基質

血管壁細胞外基質(extracellular matrix,ECM)是主動脈壁內的主要非細胞成分，在維持主動脈壁的結構、彈性和應力中具有重要作用。血管細胞外基質由膠原、彈性蛋白和其他細胞外基質成分組成，如糖蛋白、無定形或可溶性蛋白多糖、生長因子和隔離在基質中的蛋白酶。細胞外基質的組分隨血管壁膜(內膜、中膜和外膜)以及整個血管樹的不同而存在差異[21]。在正常血管組織中，蛋白多糖的豐度很低，但在胸主動脈瘤和主動脈夾層組織的退行性主動脈中經常檢測到蛋白多糖的異常積聚[22]。有研究報告：通過病變主動脈的scRNA-seq，確定netrin-1是AAA中介導炎性反應和慢性細胞外基質侵蝕之間的主要信號，巨噬細胞中netrin-1的靶向缺失可以保護小鼠免受AAA的侵襲[23]。

2.5 分子調控及信號通路

在AAA的形成與進展中，存在多種細胞因子的調控機制及信號通路。先前的研究表明AKT/mTOR信號通路在內皮細胞分化血管生成以及調節(jié)細胞新陳代謝中起關鍵作用[24]。血管干細胞/祖細胞在細胞分化過程中經歷代謝重編程，AKT/mTOR依賴的糖酵解是內皮基因表達的關鍵，這些發(fā)現(xiàn)證明了c-Kit系細胞在主動脈內皮細胞更新和替換中的關鍵作用，并可能為血管疾病的治療策略提供見解[25]。

Lck/yes新型酪氨酸激酶(Lck/yes novel tyrosine kinase,LYN)是酪氨酸激酶Src家族(Src family of tyrosine kinases,SFK) 的成員，除T細胞和一些天然淋巴樣細胞外，在整個造血系統(tǒng)以及非造血細胞中均有表達。研究發(fā)現(xiàn)Lyn在調節(jié)特定的單核細胞亞群穩(wěn)態(tài)中的作用，證實LYN是控制單核細胞數(shù)量和壽命的信號通路的關鍵調節(jié)因子，也是炎性疾病的潛在治療靶點[26]。

3 問題與展望

單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術對細胞生物學的發(fā)展起到了積極的推動作用，該技術鑒定了主動脈壁的細胞亞群、揭示罕見細胞類型、全面描述細胞表型和基因型，為主動脈疾病的發(fā)生發(fā)展機制提供了更深入的理解。但目前研究多為動物實驗，人體標本較難獲取，且本身還存在對細胞存活率要求高、測序成本昂貴、缺少強大可靠的數(shù)據分析工具等限制，期待該技術未來能不斷成熟和完善，提升血管外科醫(yī)生對主動脈疾病等血管外科疾病的認識，從而實現(xiàn)該領域的精準治療。