超聲-低共熔溶劑提取玉米芯黃酮的純化與活性測定

黎 莉，楊景淇，于德涵，曲 男，徐 喆，孫 悅

（綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061）

2020年，中國玉米產(chǎn)量為2.601億t，僅次于美國居于世界第二位，伴隨著玉米生產(chǎn)，每年加工玉米產(chǎn)生的附屬物——玉米芯有近7 000萬t。玉米芯中除含有大量纖維素多糖外，還含有諸如黃酮、酚類、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種活性成分。中國對玉米芯的綜合利用率不足20%，除少量用于飼料加工、食品輕工原料和造紙外，絕大多數(shù)都被焚燒或丟棄，造成資源浪費的同時還給環(huán)境帶來很大的壓力［1］。

低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DES）是由Abbott等［2］于2003年提出的一種類似于離子液體的新型溶劑，其配制簡便、易于保存、安全無毒、成本低，是一種可生物降解的環(huán)境友好型溶劑。目前，DES在生物活性成分的提取方面應用較多，更因其多種優(yōu)點而漸漸有取代傳統(tǒng)提取試劑的趨勢，表現(xiàn)出了巨大的潛力。在前期試驗中，考察并優(yōu)化了DES提取玉米芯黃酮的條件，使用DES對玉米芯黃酮進行提取，提取率較傳統(tǒng)有機試劑提取提高了45%，后續(xù)對玉米芯黃酮的純化工藝繼續(xù)進行探究，優(yōu)化玉米芯黃酮的吸附純化工藝，考察純化黃酮的抗氧化性、抑菌性和降糖性，以期為玉米芯的綜合應用提供一定的理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯，采集于黑龍江省綏化市北林區(qū)，品種為先玉335；試驗用菌種由綏化學院微生物實驗室保藏；大孔吸附樹脂購自東鴻化工有限公司；蘆丁標準品、阿卡波糖（純度＞95%），購自北京索萊寶科技有限公司；其余試劑皆為國產(chǎn)分析純，購自南京都萊生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

752型號分光光度計（上海菁華儀器有限公司）；YXQ-LS-75SⅡ型蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司）；JY92-IIDN型超聲波儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；ZD-85型恒溫振蕩器（江蘇榮華儀器制造有限公司）；HL-2型蠕動泵、玻璃層析柱（16 mm×240 mm）（上海青浦滬西儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲輔助低共熔溶劑提取玉米芯黃酮和含量測定DES制備：將氯化膽堿和乙二醇以1∶3的比例進行混合，按混合溶液體積30%的比例加入去離子水，在65～80℃的水浴中加熱攪拌，至溶液澄明為止，溶液取出冷卻至室溫，備用。

玉米芯黃酮的提取∶玉米芯烘干至恒重，粉碎后過篩，向玉米芯粉末內(nèi)按20∶1（mL∶g）液料比加入DES，充分混勻后于60℃、功率135 W條件下超聲提取20 min。提取液冷卻后以4 500 r∕min離心10 min，取上清液于旋轉蒸發(fā)儀中濃縮蒸發(fā)至無液體蒸出，蒸發(fā)后余液保存于棕色瓶中，測定黃酮溶液濃度，備用。黃酮含量的測定方法和具體操作參考文獻［3］。

1.3.2 樹脂活化將樹脂置于燒杯中，使用無水乙醇浸泡24 h至充分溶脹，去除漂浮物后濕法裝柱，樹脂柱高16 cm；樹脂經(jīng)去離子水充分洗滌后浸4%HCl 4 h，用去離子水洗至中性再浸4% NaOH 4 h，去離子水洗至中性，備用［4，5］。

1.3.3 大孔吸附樹脂的篩選利用靜態(tài)吸附和靜態(tài)洗脫篩選適宜純化玉米芯黃酮的樹脂，待選大孔吸附樹脂型號及參數(shù)見表1。

表1 大孔樹脂參數(shù)

分別稱取表1中各樹脂3.0 g（濕重），置于容量為100 mL的碘量瓶中，每瓶加入15 mL提取液，封口后在恒溫振蕩器上以50 r∕min旋轉振搖吸附24 h。抽濾，測濾液中黃酮含量，計算吸附率。濾下的樹脂用去離子水洗滌至溶液無色，于100 mL碘量瓶中加入30 mL 70%乙醇溶液，封口后繼續(xù)振搖24 h，抽濾，測定濾液中黃酮含量，計算解吸率［6，7］。每種樹脂做3個平行試驗，取平均值進行計算，根據(jù)各樹脂的吸附率和解吸率，比較、篩選最適樹脂。

式中，C1、C2和C3分別是上樣液濃度、流出液濃度、洗脫液濃度（mg∕mL）；V1、V2和V3分別是上樣液體積、流出液體積和洗脫體積（mL）。

1.3.4 玉米芯黃酮純化工藝優(yōu)化使用“1.3.3”的方法篩選出樹脂，以吸附率為評價指標，分別改變上樣濃度、上樣pH和上樣速率，考察各因素單獨變化對黃酮吸附效果的影響；樹脂吸附飽和后，再分別改變洗脫過程中洗脫液量、洗脫液濃度和洗脫液流速，以解吸率為評價指標考察上述因素變化其對吸附純化解吸效果的影響［8］。上樣流出液中黃酮殘余量達到上樣液黃酮含量的10%時認定為樹脂吸附達到飽和。每組做3次平行試驗。

1）上樣液濃度對吸附率的影響。選擇pH 5.0、流速30 mL∕h，上樣液濃度分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg∕mL進行吸附，測定其吸附率。

2）上樣液pH對吸附率的影響。黃酮類化合物結構中多含有酚羥基，會增加該類物質(zhì)在堿性溶液中的溶解性，不利于吸附，故調(diào)節(jié)上樣液顯酸性。設置上樣液pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，上樣濃度和流速分別為1.0 mg∕mL和30 mL∕h，測定其吸附率。

3）上樣流度對吸附率和效率的影響。上樣流速慢時吸附較為充分，但操作時間長；上樣流速快能有效縮短純化時間、提高效率，但容易造成吸附率下降。設置上樣液流速分別為15、30、45、60、75 mL∕h，pH 4.0、濃度1.0 mg∕mL，考察吸附效果最理想的上樣流速。

4）洗脫液濃度對解吸率的影響。XAD-2樹脂以優(yōu)化后的吸附條件吸附玉米芯黃酮至飽和，分別選擇體積分數(shù)為40%～90%（梯度10%）的乙醇溶液60 mL作洗脫液，流速90 mL∕h，計算解吸率。

5）洗脫液流速對解吸率的影響。使用70%乙醇60 mL作洗脫液，設置洗脫流速分別為60、90、120、150、180 mL∕h，計算解吸率。

6）洗脫液體積對解吸率的影響。洗脫液用量少時，可能洗脫不完全，導致一部分吸附物殘留在樹脂上；洗脫液用量過多時，又會導致洗脫后半程洗脫液中無產(chǎn)物，浪費時間。使用總量為90 mL的洗脫液進行過柱洗脫，柱下每收集10 mL洗脫液后更換容器，共收集9瓶10 mL的洗脫液，1～9號瓶對應洗脫液為10～90 mL，計算每瓶洗脫液的解吸率。

1.3.5 純化效果驗證最佳純化條件下，對玉米芯黃酮溶液進行純化，對比純化前、后溶液純度，通過檢測2種溶液濃度的變化計算純化倍數(shù)，驗證試驗操作3次，最終結果取平均值。

1.3.6 體外活性檢測

1）抗氧化能力測定。考察質(zhì)量濃度相同的純化和未純化玉米芯黃酮對DPPH·和ABTS·的清除能力的差異。

黃酮對DPPH·的清除能力測定：在具塞試管中加入濃度為0.1 mmol∕L的DPPH·乙醇溶液3.5 mL和無水乙醇0.5 mL，混勻后暗處靜置30 min，于517 nm處測定吸光度（A1）；替換上管中無水乙醇為相同體積的純化液∕粗提液，重復其他操作，吸光度記為（A2）；對照管中僅添加3.5 mL乙醇和0.5 mL純化液∕粗提液，其他操作同上，吸光度記為（A3）。對照組以維生素C溶液替換黃酮溶液［9］。

黃酮對ABTS·的清除能力測定：精密稱量ABTS 38.4 mg溶于10 mL去離子水中，再稱量過硫酸鉀13.5 mg溶于10 mL去離子水中，將二者轉移至25 mL容量瓶中用去離子水定容至刻度，遮光靜置12 h后制得ABTS母液，將ABTS母液稀釋16倍得到工作液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。具塞試管中加入ABTS工作液2 mL、無水乙醇1.5 mL、純化液∕粗提液0.5 mL，混勻后常溫靜置6 min，測定734 nm下的吸光度（A1）；替換上管中ABTS工作液為等體積的無水乙醇，其他操作不變，吸光度記為（A2）；對照管中加入無水乙醇和ABTS工作液各2 mL，其他操作同上，吸光度記為（A3）［10］。對照組以維生素C溶液替換黃酮溶液。ABTS·清除率公式為：

2）抑菌活性測定。選擇金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌進行抑菌圈試驗［11］，測定玉米芯黃酮的抗菌活性。

3）降糖活性測定。將0.5 mL不同濃度的純化液∕粗提液加入25 mL血糖管中，加入0.5 mL α-淀粉酶溶液后在37℃水浴中保溫2 min，再加入37℃溫育的0.1%淀粉溶液2 mL，充分混勻后37℃反應3 min后，加入2 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑混勻，沸水浴8 min，顯色穩(wěn)定后取出流水冷卻至室溫，加去離子水至刻度，蓋緊管塞顛倒混勻后于540 nm光波下測吸光度（A1）；空白對照組用等體積的磷酸緩沖液替代黃酮溶液，吸光度記為（A2），以阿卡波糖作陽性對照［12］，計算抑制率。

所有體外活性檢測試驗均設3組平行。

2 結果與分析

2.1 線性回歸方程

繪制標準曲線測定黃酮含量，曲線回歸方程為y=0.093 1x+0.002 3，R2=0.999 3。

2.2 大孔吸附樹脂的篩選

大孔吸附樹脂篩選的結果見圖1。在考察的8種樹脂中，3種無極性樹脂和2種弱極性樹脂的吸附率值相對較高，其中弱極性吸附樹脂的吸附率稍大，但解吸率較低，表明這2種樹脂吸附后再生較其他樹脂困難；無極性樹脂的吸附率都比較接近，其中HPD-100樹脂解吸率稍低，D101樹脂的吸附率在這3種樹脂中最低，所以從效率和純化效果等因素考慮，選擇綜合效果最好的XAD-2樹脂作為玉米芯黃酮的純化樹脂。

圖1 不同大孔吸附樹脂對玉米芯黃酮的靜態(tài)吸附/解吸特性

2.3 玉米芯黃酮純化工藝優(yōu)化

2.3.1 上樣液濃度對吸附率的影響由圖2可知，上樣液濃度低時，即上樣濃度不高于1.0 mg∕mL時，吸附率維持在較高水平，隨著上樣濃度的加大，吸附率有少量的增加；再繼續(xù)加大上樣液的濃度，吸附率下降。這是因為上樣濃度較低時，樹脂吸附能力不能完全發(fā)揮，此時吸附率雖然較高，但是達到吸附飽和所用的時間更長，效率較低；而上樣濃度過高時，溶液中的雜質(zhì)會和黃酮發(fā)生吸附競爭，阻礙黃酮被吸附，導致吸附率降低，所以選擇1.00 mg∕mL作為最佳吸附濃度。

圖2 不同上樣液濃度對樹脂吸附率的影響

2.3.2 上樣液pH對吸附率的影響由圖3可見，pH 4.0時吸附率最高，為75.1%，偏離此pH吸附率都會下降。pH高于4.0時，吸附率下降可能是因為弱酸近中性環(huán)境有利于黃酮中酚羥基的解離，加強了黃酮和溶劑間的相互作用，抑制吸附；而pH過低時吸附率下降，則可能是因為黃酮結構中含有酮式羰基，在強酸環(huán)境下成烊鹽，且以離子狀態(tài)存在，從而降低吸附率。故選擇4.0為最優(yōu)pH。

圖3 不同上樣液pH對樹脂吸附率的影響

2.3.3 上樣流速對吸附率的影響由圖4可見，上樣液流速慢，上樣液和樹脂接觸時間長、黃酮有充分的時間擴散到樹脂內(nèi)部，吸附率較高；而隨著上樣液流速的加快，黃酮在層析柱中停留時間短，吸附率隨之降低，所以上樣流速選擇15 mL∕h最佳。

圖4 不同上樣流速對樹脂吸附率影響

2.3.4 洗脫液濃度對解吸率的影響由圖5可知，乙醇體積分數(shù)為70%時解吸率最高，偏離這個濃度解吸率都會下降，而且偏離的越遠，解吸率越低。原因可能是玉米芯黃酮的極性和70%乙醇溶液的極性最為接近，根據(jù)“相似物溶解相似物”原則，玉米芯黃酮在該濃度的乙醇溶液中溶解度最大，從而最易洗脫，解吸率大，故70%乙醇溶液洗脫效果最佳。

圖5 不同洗脫液濃度對樹脂解吸率的影響

2.3.5 洗脫液流速對解吸率的影響由圖6可知，洗脫液流速越慢，解吸率越高，因為洗脫液流速慢，能和吸附物充分接觸和溶解，洗脫充分；洗脫液流速加快后，洗脫不完全，樹脂中吸附殘留成分多，導致解吸率降低。所以，洗脫的最佳流速選擇60 mL∕h。

圖6 不同洗脫液流速對樹脂解吸率的影響

2.3.6 洗脫液體積對解吸率的影響由圖7可知，隨著洗脫操作的進行，編號靠后的洗脫液收集瓶中的黃酮含量越來越少，解吸率越來越低，7～9號收集瓶中幾乎測量不到黃酮，故選擇洗脫液體積為70 mL。

圖7 不同洗脫液用量對樹脂解吸率的影響

2.4 玉米芯黃酮純化結果驗證

將pH 4.0、濃度1.00 mg∕L的上樣液以15 mL∕h的速度流經(jīng)XAD-2大孔樹脂，待吸附飽和后用體積分數(shù)為70%的乙醇70 mL、以60 mL∕h的速度進行洗脫。經(jīng)計算，玉米芯黃酮純化液純度為粗提液純度的2.65倍，說明上述條件下，XAD-2大孔樹脂純化玉米芯黃酮工藝效果良好。

2.5 體外活性檢測結果

2.5.1 黃酮的抗氧化性純化液和粗提液對HPPH·和ABTS·的清除能力結果見圖8。由圖8可知，在測試濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，黃酮和維生素C對DHHP·的清除能力增強，同等濃度條件下，玉米芯黃酮的DPPH·清除能力不及維生素C。純化黃酮抗氧化能力明顯強于未純化黃酮，即純化能提高其抗氧化性。

圖8 玉米芯黃酮對DPPH·和ABTS·的清除能力

黃酮和維生素C對ABTS·的清除能力也隨著濃度的升高而增強，維生素C的ABTS·清除能力明顯強于黃酮；純化操作能增強黃酮對ABTS·的清除能力。

2.5.2 黃酮的抗菌能力黃酮具有廣譜抗菌作用，其對于參與試驗的3種細菌的抑菌能力結果見表2。由表1、2可知，玉米芯黃酮對3種細菌的抑制作用隨著黃酮濃度的增高而加強，其中，對枯草芽孢桿菌作用最弱，而對金黃葡萄球菌的作用最強。純化后的黃酮溶液抑菌能力有所增強。

表2 不同黃酮濃度對抑菌圈直徑的影響 （單位：mm）

2.5.3 黃酮的降糖活性測定不同濃度黃酮對α-淀粉酶的抑制能力如圖9所示。由圖9可知，純化物和阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制作用明顯高于粗提物，并且隨著濃度的增加而加強。玉米芯黃酮純化物和阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制作用接近，說明純化玉米芯黃酮和阿卡波糖的降糖能力相當。

圖9 不同濃度玉米芯黃酮對α-淀粉酶的抑制作用

3 小結

本研究主要探討了純化玉米芯黃酮的體外活性，并對玉米芯黃酮的XAD-2大孔樹脂純化工藝進行了優(yōu)化，得出結論如下：8種待選樹脂中，XAD-2樹脂對玉米芯黃酮的吸附和解吸綜合效果最佳，可以作為其純化的吸附介質(zhì)；最優(yōu)吸附條件為上樣濃度1.00 mg∕mL、上樣液pH 4.0、上樣流速15 mL∕h，最佳洗脫條件是70 mL體積分數(shù)為70%的乙醇，洗脫速度60 mL∕h，可將玉米芯黃酮純化2.65倍；玉米芯黃酮具有弱于維生素C的抗氧化性，對DPPH·和ABTS·的清除能力隨著玉米芯黃酮濃度的增加而增強，純化后抗氧化能力增強；玉米芯黃酮的抑菌效果隨濃度增加而增強，純化后的抑菌能力更強，3種試驗細菌受抑制程度為金黃葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌；體外降糖試驗表明，玉米芯黃酮對α-淀粉酶的抑制作用隨濃度加大而增強，純化黃酮和阿卡波糖有相近的降糖效果。

由以上研究結論可知，采用低共熔溶劑提取玉米芯總黃酮后利用XAD-2大孔樹脂純化，此工藝流程可行。