不同輸精方式和有效精子數(shù)量對吉林馬情期受胎率的影響

劉曉輝，譚成成，張鵬舉，王偉霞，樸慶林，李信濤，郎洪彥

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物生物技術(shù)研究所，吉林 公主嶺 136100）

吉林馬是通過引進前蘇聯(lián)重型馬（阿爾登、蘇重挽、弗拉基米爾等）和輕型馬（頓河、蘇高血、卡巴金等）與本地馬雜交改良，經(jīng)過28年的聯(lián)合育種，于1978年成功培育出的挽乘兼用型和重挽型的新品種［1］，具有力速兼?zhèn)?、適應(yīng)性強、耐粗飼、持久力強等特性。吉林馬目前存欄量約1.5萬匹，數(shù)量急劇減少，利用優(yōu)良吉林馬種公馬精液與人工授精技術(shù)相結(jié)合是增加其繁殖數(shù)量、培育新群體的最有效方法之一。

近年來，隨著人民生活方式的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)代馬業(yè)再次興起，賽馬、休閑娛樂、肉用、乳用及生物制品的開發(fā)與利用成為馬產(chǎn)業(yè)主要的發(fā)展方向，因此，馬匹的改良與繁育變得尤為重要，亟需引進新技術(shù)與之相適應(yīng)［2-6］。子宮角深部輸精技術(shù)是將精液輸送至排卵側(cè)子宮角處，從子宮頸口至排卵側(cè)子宮角約25 cm進行適度深部輸精，可以降低輸入的有效精子數(shù)量，提高優(yōu)良種公馬利用率，加快馬群良種化進程［7，8］。張發(fā)憲［9］報道采用子宮角深部輸精技術(shù)可以顯著提高母馬的受胎率，但還缺乏比較系統(tǒng)的研究數(shù)據(jù)。本文系統(tǒng)研究不同輸精方式及不同有效精子數(shù)量對吉林馬情期受胎率的影響，以期為提高馬人工受精技術(shù)水平，加速吉林馬品種改良進程提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

種公馬來自吉林省松原市欣興牧業(yè)馬場。選擇4匹4～12歲成年吉林馬種公馬，要求其體格健康無疾病、繁殖性能良好，按《種公馬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（DBN654000∕T216—2015）要求方法飼養(yǎng)。采精時間為每年4—7月。選擇吉林馬母馬300匹，母馬年齡為4～10歲，體格健康無繁殖疾病，發(fā)情周期正常，每天保證充足的飼草、水和光照。

1.2 主要試劑及儀器

果糖、Tris、檸檬酸購自生工生物工程（上海）股份有限公司；青霉素和鏈霉素為獸用商店購買；卵黃液為實驗室自備。

離心機（型號為TDL80-2D），購自上海安亭科技儀器廠；鼓風(fēng)干燥箱（型號為PH-140A），購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；邁朗全自動精子分析儀（型號為ML-210JZ），購自南寧松景天倫生物科技有限公司；一次性輸精管（廣西蔣氏動物用品有限公司）、一次性子宮角輸精管（上海法國卡蘇科技有限公司）。

1.3 馬精液制備

1.3.1 馬精液稀釋液的配制準(zhǔn)確稱取Tris 3.028 g、檸檬酸1.692 g、果糖1.250 g，加入蒸餾水充分溶解、煮沸，室溫冷卻后，4℃保存。

1）卵黃液制備。取新鮮雞蛋，酒精棉球擦拭蛋殼表面滅菌，去除蛋清，刺破卵黃膜，收集卵黃液體。

2）馬精液稀釋液組成?；A(chǔ)液（40+10）mL卵黃液+雙抗，置于37℃水浴鍋中備用。

1.3.2 精液的采集采精時，用溫水清洗種公馬陰莖，挑選性情溫順的發(fā)情母馬做臺馬或使用假臺馬。采精人員安裝好假陰道，固定好集精杯，通過注水口灌注40℃左右的溫水，檢查密閉性，采精時保證水溫為38～40℃。待公馬爬跨時，采精人員迅速站到臺馬右后側(cè)，將陰莖導(dǎo)入假陰道內(nèi)，完成采精。采精后，將集精杯緩緩向下傾斜，打開放氣閥門，取下集精杯，迅速送至精液處理室，用滅菌紗布過濾精液并統(tǒng)計采精量。原精顏色為不透明乳白色，無異常氣味，精子活力達0.6以上，密度在1.0×109個∕mL的精液才能使用。

1.3.3 精液的稀釋用全自動精子分析儀對試驗精液進行活力和密度檢測。對試驗馬精子密度和精子活力計算后進行稀釋，使其分別含有10×108、5×108、2×108、1×108、0.75×108、0.5×108、0.25×108、0.125×108個不同有效精子數(shù)量，分裝后備用。

1.4 輸精方法

由熟練掌握輸精技術(shù)的人員進行人工輸精，A組采用子宮體常規(guī)輸精，將輸精管過子宮頸口，進行子宮體輸精，見圖1。B組采用子宮角深部輸精，子宮角深部輸精是將精液輸送至排卵側(cè)子宮角處約25 cm，進行適度深部輸精，見圖2。

圖1 子宮體常規(guī)輸精部位

圖2 子宮角深部輸精部位

1.5 試驗設(shè)計

通過直腸檢查法檢測母馬發(fā)情狀況，每天進行一次發(fā)情排卵鑒定。將發(fā)情母馬隨機分為2組，A組為子宮體常規(guī)輸精組（n=150），B組為子宮角深部輸精組（n=150）。A組繼續(xù)分為A1組（n=30，輸精量30 mL含10×108個有效精子數(shù)）、A2組（n=30，輸精量20 mL含5×108個有效精子數(shù)）、A3組（n=30，輸精量10 mL含2×108個有效精子數(shù)）、A4組（n=30，輸精量5 mL含1×108個有效精子數(shù)）、A5組（n=30，輸精量2 mL含0.5×108個有效精子數(shù)）；B組繼續(xù)分為B1組（n=30，輸精量5 mL含1×108個有效精子數(shù)）、B2組（n=30，輸精量3 mL含0.75×108個有效精子數(shù)）、B3組（n=30輸精量2 mL含0.5×108個有效精子數(shù)）、B4組（n=30，輸精量1 mL含0.25×108個有效精子數(shù)）、B5組（n=30輸精量0.5 mL含0.125×108個有效精子數(shù)）。

1.6 統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 子宮體一次輸精有效精子數(shù)量對吉林馬情期受胎率的影響

由表1可知，采用子宮體輸精方式一次輸精不同有效精子數(shù)量進行人工授精后，根據(jù)吉林馬母馬情期受胎率統(tǒng)計情況，試驗A1、A2組比A3組情期受胎率稍有提高，但差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)有效精子數(shù)量是A3組的50%（A4組）和25%（A5組）時，母馬情期受胎率分別降低了20.35和33.37個百分點，差異顯著（P＜0.05）。這說明子宮體一次輸精有效精子數(shù)在2.0×108～10.0×108個時并不影響母馬的情期受胎率，但降低到0.5×108～1.0×108個時顯著影響母馬的情期受胎率。

表1 子宮體一次輸精不同有效精子數(shù)量母馬情期受胎率

2.2 子宮角一次輸精有效精子數(shù)對吉林馬情期受胎率的影響

由表2可知，采用子宮角輸精方式一次輸精不同有效精子數(shù)量進行人工授精后，根據(jù)吉林馬母馬情期受胎率統(tǒng)計情況，試驗B1、B2組比B3組情期受胎率稍有提高，但差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)有效精子數(shù)量是B3組的50%（B4組）和25%（B5組）時，吉林馬母馬情期受胎率分別降低了15.62和24.97個百分點，差異顯著（P＜0.05）。這說明子宮角一次輸精有效精子數(shù)在0.50×108～1.00×108時并不影響母馬的情期受胎率，但降低到0.125×108～0.250×108時顯著影響母馬的情期受胎率。

表2 子宮角一次輸精不同有效精子數(shù)量母馬情期受胎率

2.3 不同輸精方式對吉林馬情期受胎率的影響

由表3可知，吉林馬母馬子宮角深部輸精平均情期受胎率（69.80%）顯著高于子宮體常規(guī)輸精受胎率（45.78%）（P＜0.05）。采用子宮角深部輸精能顯著提高吉林馬母馬情期受胎率，顯著降低一次輸精有效精子數(shù)量，提高種公馬精液利用效率，具有重大的生產(chǎn)意義。

表3 不同輸精方式吉林馬母馬情期受胎率

3 討論

關(guān)于輸精有效精子數(shù)量的研究，在驢［10］、牛［11］、羊［12］、豬［13］等已有報道，但關(guān)于馬一次輸精有效精子數(shù)量的研究目前國內(nèi)還無報道。本研究結(jié)果表明，10×108個和5×108個有效精子數(shù)量組的吉林馬母馬情期受胎率略高于2×108個有效精子數(shù)量，說明增加有效精子數(shù)量，可以提高母馬的受胎率，但差異并不顯著。當(dāng)有效精子數(shù)量減少至1×108個和0.5×108個時，母馬情期平均受胎率分別下降了20.35、33.37個百分點。Oliveria等［14］研究了有效精子數(shù)量對母驢情期受胎率的影響，發(fā)現(xiàn)在子宮體輸精的情況下，輸入的有效精子數(shù)量為10×108個時受胎率為73%，當(dāng)有效精子數(shù)量減少至5×108個時受胎率則下降到40%，與本試驗結(jié)果有一定差距，可能是驢人工輸精需要比馬更多的有效精子數(shù)量才能保證受胎率。在子宮角深部輸精試驗中，同樣驗證了此結(jié)果。

Oliveria等［15］研究了冷凍精液不同輸精方式對母驢情期受胎率的影響，結(jié)果子宮體輸精方式情期受胎率為0%，而子宮角輸精方式情期受胎率為28.26%。楊莉等［16］研究了新鮮精液不同輸精方式對母驢情期受胎率的影響，結(jié)果表明子宮體輸精方式情期受胎率為33.33%，而子宮角輸精方式情期受胎率為45.16%。付靜濤等［17］研究了常規(guī)輸精和深部輸精對馬情期受胎率的影響，結(jié)果子宮角深部輸精情期受胎率為65.72%，而子宮體常規(guī)輸精情期受胎率為56.13%，說明子宮角深部輸精能顯著提高母馬情期受胎率。本試驗結(jié)果說明，與子宮體常規(guī)輸精相比，子宮角深部輸精能顯著提高母馬的情期受胎率。這一結(jié)果可能與輸精的部位有關(guān)，深部輸精將精液輸送至子宮角前1∕3處，使精液快速到達子宮角，從而快速與卵子結(jié)合，完成受精過程，進而提高了母馬的受胎率。

種公馬的使用年限一般為12～15年，在使用年限內(nèi)應(yīng)該更好地發(fā)揮其使用效率，最大限度提高種公馬的繁殖力。隨著現(xiàn)代馬業(yè)的迅速發(fā)展，馬冷凍精液的使用越來越受到關(guān)注，冷凍精液的使用使種公馬的繁殖能力大大提高［18］，采用冷凍精液人工授精技術(shù)，一匹種公馬一年可以配種達萬匹以上。如果把每一劑量凍精有效精子數(shù)量從現(xiàn)在的（1～2）×108個降低至0.5×108個，凍精產(chǎn)量就能提高50%，如果每匹種公馬年平均生產(chǎn)凍精20 000劑，通過降低有效精子數(shù)量，一年可多生產(chǎn)凍精10 000劑，大大提高優(yōu)良種公馬的使用效率。

4 結(jié)論

子宮體常規(guī)輸精一次有效精子數(shù)達2×108個以上或子宮角深部輸精一次有效精子數(shù)達0.5×108個以上，吉林馬母馬情期受胎率可達60.00%以上；采用子宮角深部輸精方式能顯著提高吉林馬母馬的情期受胎率，對吉林馬乃至整個馬業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。