安徽甘藍(lán)菌核病菌的致病力及其對3種殺菌劑的敏感性

張華蕊 夏智杰 宋江華 張立新*

（1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，作物有害生物綜合治理安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036；2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽合肥 230036）

甘藍(lán)（Brassica oleraceavar.capitataL.）是我國重要的蔬菜作物，營養(yǎng)豐富，適應(yīng)性及抗逆性均較強(qiáng)，在全國各地普遍種植（楊麗梅 等，2021；楊麗梅和方智遠(yuǎn)，2022）。菌核病是由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorium）引起的真菌性病害，在甘藍(lán)全生育期均可發(fā)生，發(fā)病初期產(chǎn)生水漬狀、淡褐色病斑，濕度較大時病部出現(xiàn)白色絮狀菌絲，可見黑色鼠糞狀菌核；一般導(dǎo)致甘藍(lán)減產(chǎn)5%～20%，受害嚴(yán)重的地塊減產(chǎn)可達(dá)50%以上，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重（杜磊和楊瀟湘，2016）。菌核病菌的寄主范圍非常廣泛，除了危害十字花科蔬菜以外，還可侵害茄科、豆科、葫蘆科等作物。據(jù)統(tǒng)計，核盤菌現(xiàn)已危害的植物有75 科408 種（劉佳 等，2016）。有研究表明，核盤菌種群內(nèi)存在致病性分化（孫葉爍等，2019）。國內(nèi)外對核盤菌致病力研究的報道多集中于油菜、向日葵和花椰菜等寄主植物（李沛利和葉華智，2006；孫溶溶 等，2011；許大鳳 等，2014），在甘藍(lán)上的研究鮮見報道。

近年來，安徽省甘藍(lán)產(chǎn)區(qū)菌核病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，危害越來越嚴(yán)重。目前，化學(xué)防治仍是防治菌核病的主要措施，常用的殺菌劑為苯并咪唑氨基甲酸酯類殺菌劑、二甲酰亞胺類殺菌劑和琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑。然而，部分地區(qū)已發(fā)現(xiàn)核盤菌對常用殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性（齊永霞 等，2006；匡靜 等，2011；喬廣行 等，2014；楊利娟 等，2020）。本試驗(yàn)對安徽淮南甘藍(lán)主產(chǎn)區(qū)的菌核病菌進(jìn)行了分離和致病力測定，并對3 種常用殺菌劑進(jìn)行了敏感性評估，以期為甘藍(lán)菌核病的綜合治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試甘藍(lán)品種 京豐1 號、鋼頭50、精選爭春、日本夏冠，購自河北省邢臺市大力種苗有限公司；超級春豐，購自邢臺甘之都種業(yè)有限公司；方震紫甘藍(lán)，購自鄭州方震種子有限公司；中甘11號，購自河北省邢臺市興達(dá)種業(yè)有限公司；綠玉，購自浙江神良種業(yè)有限公司；博春，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

1.1.2 供試藥劑 40%菌核凈可濕性粉劑，購自江西禾益化工股份有限公司；97%多菌靈原藥，購自先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；50%啶酰菌胺水分散粒劑，購自巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離 2020—2021 年從安徽省甘藍(lán)主產(chǎn)區(qū)（懷遠(yuǎn)縣和壽縣）的4 個菌核病發(fā)生地塊采集病株，采用組織分離法（張佳環(huán) 等，2015）進(jìn)行病原菌分離。切取發(fā)病組織病健交界處，經(jīng)75%酒精表面消毒15～30 s，0.1%升汞消毒90 s 后，無菌水洗滌3 次，然后置于PDA 平板，25 ℃黑暗培養(yǎng)；待菌落長出后進(jìn)行純化、保存。分離獲得的菌株按地區(qū)來源編號，來自懷遠(yuǎn)縣的記為HY，來自壽縣的記為SX。

將分離純化后的菌株分別接種于PDA 平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形態(tài)特征，對分離物進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定（劉婷婷 等，2016）。

1.2.2 病原菌的致病力測定 2021 年于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)種植參試9 個甘藍(lán)品種，在直徑為12 cm 的塑料花盆中裝入育苗基質(zhì)（購自淮安市中禾農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司），每盆1 株。幼苗4～6 葉期，選取健康、完整且相近葉齡的葉片采用菌絲圓片活體接種法進(jìn)行接種。使用直徑為5 mm 的打孔器在培養(yǎng)2 d 的病原菌菌落邊緣打取菌餅，將帶有菌絲的一面貼到葉片頂端距主葉脈2 cm 處；每株菌株每個品種接種3 株幼苗，每株接種3 片葉片，以接種瓊脂塊為對照。然后，置于人工氣候箱（25℃，相對濕度90%，12 h/12 h 光暗交替）內(nèi)，第5天調(diào)查植株發(fā)病情況，病情分級標(biāo)準(zhǔn)參考姚星偉等（2018）的方法。0 級，無明顯癥狀；1 級，發(fā)病葉片病斑面積占葉片面積的10%以下；2 級，發(fā)病葉片病斑面積占葉片面積的11%～30%；3 級，發(fā)病葉片病斑面積占葉片面積的31%～50%；4 級，發(fā)病葉片病斑面積占葉片面積的51%以上。

病情指數(shù)=∑（各級病葉數(shù)×相應(yīng)級值）／（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級值）× 100

根據(jù)病情指數(shù)判定菌株的致病力，病情指數(shù)≤30，為弱致病力（WP）；30 ＜病情指數(shù)≤ 70，為中等致病力（MP）；病情指數(shù)＞ 70，為強(qiáng)致病力（HP）（孫溶溶 等，2011；姚星偉 等，2018）。

1.2.3 甘藍(lán)菌核病菌對殺菌劑的敏感性試驗(yàn) 采用菌絲生長速率法測定不同來源的代表性菌株對3 種殺菌劑的敏感性。利用丙酮將多菌靈配制成濃度為1 000 μg·mL-1母液，利用無菌水將菌核凈和啶酰菌胺配制成濃度為1 000 μg·mL-1母液，分別加入PDA 培養(yǎng)基中制成含藥培養(yǎng)基，使多菌靈的終濃度分別為0、0.01、0.05、0.25、0.50、1.00 μg·mL-1，菌核凈的終濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.10、0.50 μg·mL-1，啶酰菌胺的終濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 μg·mL-1；以等量不含藥劑的丙酮或無菌水加入PDA 培養(yǎng)基作為對照，每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)4 皿。使用內(nèi)徑為3 mm 的打孔器在培養(yǎng)3 d 后的病原菌菌落邊緣打取菌餅，分別接種到含藥PDA 培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測定菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）／（對照菌落直徑-3 mm）× 100%

使用DPS 7.05 軟件計算抑制中濃度（EC50）和毒力回歸方程，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化

對采集的甘藍(lán)菌核病病株（圖1-a）進(jìn)行病原菌分離，共得到24 株菌株，其中懷遠(yuǎn)縣純化得到15 株，壽縣得到9 株。所有分離獲得的菌株形態(tài)一致，25 ℃培養(yǎng)條件下，PDA 平板上病原菌菌絲呈白色，菌絲稀薄，3 d 后菌落基本長滿整個平板；5 d 后PDA 平板的邊緣菌絲聚集，開始形成突起，初期為白色，較小，隨后逐漸膨大，且在突出部位上出現(xiàn)水珠；7 d 后突起的顏色逐漸加深，直至變成黑色菌核，成環(huán)狀排列，菌核形狀為圓形、橢圓形及不規(guī)則形（圖1-b）。

圖1 甘藍(lán)菌核病的田間癥狀及其病原菌的菌落形態(tài)

2.2 甘藍(lán)菌核病菌的致病力測定

采用菌絲圓片活體接種法測定了24 株菌株在9 個甘藍(lán)品種上的致病力，接種后發(fā)病病斑與采樣病株田間發(fā)病癥狀一致，呈橢圓形、近圓形水漬狀褐色病斑，病健交界明顯，對照葉片均未發(fā)?。徊杉蛛x9 個甘藍(lán)品種的病原菌與原接種菌株形態(tài)相同。這表明從田間甘藍(lán)發(fā)病部位分離得到的菌株為甘藍(lán)菌核病病原菌。

由表1 可以看出，安徽省甘藍(lán)菌核病菌的致病力表現(xiàn)出明顯差異。不同菌株對同一甘藍(lán)品種的致病力不同，如博春接種不同菌株后，11 株菌株表現(xiàn)為強(qiáng)致病力，1 株菌株表現(xiàn)為中等致病力，剩余菌株表現(xiàn)為弱致病力甚至未能引起該品種發(fā)病。同一地區(qū)內(nèi)的菌株致病力也存在明顯差異，供試甘藍(lán)品種接種來自懷遠(yuǎn)縣的菌株HY4-3 的病情指數(shù)為66.67～100.00，而接種同來自懷遠(yuǎn)縣的菌株HY6-3的病情指數(shù)僅為0～33.33；對于來自壽縣的菌株，接種SXG12 的病情指數(shù)為8.33～100.00，而接種SXG8 的病情指數(shù)為0～25.00。這表明菌株的致病性分化與地理來源無明顯相關(guān)性。

表1 甘藍(lán)菌核病菌對不同甘藍(lán)品種的致病性

2.3 甘藍(lán)菌核病菌對3 種殺菌劑的敏感性

2.3.1 對菌核凈的敏感性 由表2 可知，參試甘藍(lán)菌核病菌菌株對菌核凈的EC50值范圍為0.055 4～0.137 7 μg·mL-1；其中，菌株HY4-3 的EC50值最大，是EC50值最小的菌株SXG1 的2.49倍。參考匡靜等（2011）、喬廣行等（2014）的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)EC50值小于5.0 μg·mL-1，則認(rèn)為菌株對藥劑具有敏感性。表明本試驗(yàn)中的參試菌株對菌核凈較敏感。

表2 甘藍(lán)菌核病菌對菌核凈的敏感性

2.3.2 對多菌靈的敏感性 由表3 可知，參試甘藍(lán)菌核病菌菌株對多菌靈的EC50值范圍為0.037 1～0.104 2 μg·mL-1；其中，菌株SXG12 的EC50值最大，是EC50值最小的菌株SXG8 的2.81倍。表明參試菌株對多菌靈較敏感。

表3 甘藍(lán)菌核病菌對多菌靈的敏感性

2.3.3 對啶酰菌胺的敏感性 由表4 可知，參試甘藍(lán)菌核病菌菌株對菌核凈啶酰菌胺的EC50值范圍為0.074 4～0.187 0 μg·mL-1；其中，菌株HY4-1的EC50值最大，是EC50值最小的菌株SXG3 的2.51倍。表明參試菌株對啶酰菌胺較敏感。

表4 甘藍(lán)菌核病菌對啶酰菌胺的敏感性

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用菌絲圓片活體接種法測定了來自安徽省2 個地區(qū)的24 株甘藍(lán)菌核病菌菌株對9 個甘藍(lán)品種的致病力，結(jié)果顯示安徽省甘藍(lán)菌核病菌的致病力表現(xiàn)出明顯差異，不同菌株對同一甘藍(lán)品種的致病力不同，同一地區(qū)內(nèi)的菌株致病力也存在明顯差異，但菌株的致病性分化與地理來源無明顯相關(guān)性。李沛利和葉華智（2006）在對油菜菌核病菌致病性分化研究時發(fā)現(xiàn)，油菜菌核病菌致病性存在強(qiáng)弱差異，致病性分化與寄主來源關(guān)系不大；劉佳等（2016）對黑龍江地區(qū)向日葵菌核病菌致病性分化研究表明，不同菌株之間致病力存在顯著差異，測試菌株與地理來源無明顯聯(lián)系，這與本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的甘藍(lán)菌核病菌菌株的致病性分化與來源地區(qū)無關(guān)趨于一致。另外，本試驗(yàn)中參試的甘藍(lán)品種大多數(shù)為目前安徽地區(qū)推廣的品種，對菌核病的抗病性信息不明，今后仍需進(jìn)一步開展不同甘藍(lán)品種對菌核病的抗性篩選，以及甘藍(lán)菌核病菌的致病力差異分析。

多菌靈屬于苯并咪唑類殺菌劑，因其殺菌譜廣、內(nèi)吸性強(qiáng)、防病效果好而得到廣泛應(yīng)用，但其作用位點(diǎn)單一，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。目前已有安徽、北京、江蘇等地區(qū)報道油菜等作物的菌核病菌對多菌靈產(chǎn)生了抗藥性（齊永霞 等，2006；匡靜 等，2011；喬廣行 等，2014）。菌核凈屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，已被廣泛應(yīng)用于控制油菜菌核病，但隨著該藥劑的推廣使用，部分地區(qū)的油菜菌核病菌逐漸出現(xiàn)抗藥性（石志琦 等，2000）。啶酰菌胺是目前使用范圍最廣、用量最大的琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑，天津地區(qū)報道蔬菜菌核病菌對啶酰菌胺出現(xiàn)了抗藥性（楊利娟 等，2020）。本試驗(yàn)采用菌絲生長速率法測定了安徽甘藍(lán)菌核病菌代表性菌株對多菌靈、菌核凈和啶酰菌胺的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參試菌株對3 種殺菌劑的敏感性均較高，未發(fā)現(xiàn)有抗藥性的菌株；其中對多菌靈敏感性最高，EC50值范圍為0.037 1～0.104 2 μg·mL-1；對菌核凈和啶酰菌胺的EC50值分別為0.055 4～0.137 7 μg·mL-1和0.074 4～0.187 0 μg·mL-1。這表明當(dāng)前安徽省甘藍(lán)菌核病菌還未對常規(guī)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，建議在生產(chǎn)上使用多菌靈時與其他殺菌劑搭配使用，能夠有效控制甘藍(lán)菌核病。