新型高效納米磁珠試劑盒在DNA檢測中的應用

吳 婷 李鵬飛 牛青山 梁克偉 王志鋒 馮 銳

（1 湖南警察學院刑事科學技術系 湖南 長沙 410138；2 蘇州市公安局園區(qū)分局 江蘇 蘇州 215000；3 中國刑事警察學院科研處 遼寧 沈陽 110035；4 中國刑事警察學院刑事科學技術學院 遼寧 沈陽 110035；5 新海生物公司檢驗科 江蘇 蘇州 215000；6 湖南省公安廳刑事科學技術研究所 湖南 長沙 410000）

1 引言

法醫(yī)DNA檢驗技術已成為現(xiàn)代科技在法醫(yī)學鑒定領域的主流技術，DNA-STR分型是國內外個體識別及親子鑒定的主要技術手段，一般包括樣本DNA提取，PCR擴增和電泳分型[1]。其中，樣本DNA高質量的提取是該技術的關鍵，特別是犯罪現(xiàn)場遺留樣本微量時，DNA提取回收效率更是至關重要。傳統(tǒng)的DNA提取方法大多數操作繁瑣，殘留的DNA提取試劑會抑制PCR擴增，并且回收效率有限，對于微量生物檢材的DNA提取成功率較低。在提取純化的過程中，若不能有效去除樣品中所含有的血紅素和腐植酸等PCR抑制劑，最終會抑制PCR反應的進行，直接影響效果。國內外已有許多方法應用于微量DNA的提取及純化，其中，國內實驗室目前常用的有Chelex法[2]、硅珠法[3-5]、磁珠法[6-7]、直接擴增法[8]、Microcon 100（Millipore）超濾濃縮法[9]等，其中磁珠法還有半定量作用。

Chelex法提取是最簡便的方法，實驗成本低，因而被普遍使用，但其容易受生物檢材的影響，特別是遇到微量的、含雜質多的接觸性檢材，檢測成功率不高。硅珠法提取原理是依托硅珠的吸附作用，對于微量的、含雜質的檢材效果較好。在實驗中，雖然得到的DNA比較純，但是需要反復洗脫，易造成DNA損耗，如果檢材DNA含量極少，最終會得出不能成功檢測分型的實驗結果。相比于前兩種方法，污染嚴重、含抑制劑的微量檢材采用磁珠法DNA提取量最高[10]。磁珠法提取DNA已經形成了成熟的自動化工作站，提取效率比較高，對于一般的檢材均有效，其原理是DNA在溶液中可逆性地結合在磁珠上，所以此方法關鍵在于讓DNA牢固吸附在磁珠上，如果吸附不全，DNA在洗滌過程中就會發(fā)生丟失，而樣本中可能含有某些化學試劑會影響DNA與磁珠的結合。因此，對于原始條件脆弱且量微的接觸類檢材來說，實驗結果更容易受到影響。直接擴增檢驗法雖然具有快速、簡便的特點，但仍具有一定的應用局限性。該方法適用于現(xiàn)場檢材量大的DNA快速分析，一般相對潔凈的唾液斑的“直擴”樣本成功率較高；而對于微量接觸性檢材，建議不采用直接擴增方法進行檢驗。Microcon 100過柱法不僅成本高于磁珠法，而且樣本中一些大分子雜質如纖維、染料、灰塵等，因不能濾過而被濃縮導致抑制擴增。因此，Microcon 100超濾法對接觸性DNA的提取純化應用有限，適用于污染較輕的接觸性DNA的純化濃縮[11-12]。

基于綜述，為滿足目前公安實際案件檢驗需要，急需建立一種操作步驟簡化，可有效去除PCR抑制劑，不僅適用于微量生物物證的DNA檢驗，而且適用于大批量樣本自動化操作的DNA檢測方法。本研究將從對納米磁珠嚴格篩查和提取試劑的優(yōu)化、操作步驟的簡化、DNA模板提取方法的優(yōu)化、減少抑制劑對PCR的抑制等方面，探索新型高效納米磁珠試劑盒[13]在公安實際案件DNA檢測中的應用。

2 新型高效納米磁珠試劑盒設計方案

2.1 磁珠法提取DNA基礎流程的構建

綜合考慮國產磁珠的粒徑、均一度、磁珠表面修飾基團、性價比等因素，并做出相關的測評和篩選，選擇合適的納米級磁珠。建立案件生物檢材模型體系，準備采用人EDTA抗凝血細胞體系。加入高效裂解液迅速裂解血細胞釋放核酸，而后加入與DNA高效結合的超順磁珠及DNA吸附劑吸附核酸，置于磁分離器上，使溶液與磁珠分離，吸棄上清，再加入洗滌液震蕩混勻，洗去殘留的蛋白、脂質及裂解液（強PCR抑制劑），再次置于磁分離器上使溶液與磁珠分離，然后吸棄上清。重復洗滌一次后，吸棄上清65℃烘干管中殘留液體，得到純磁珠核酸復合物，加入超純水震蕩并65℃孵育15min，待磁珠上的DNA全部洗脫下來后，置于磁分離器上，分離吸取富集純化好的核酸溶液備用，也可以不經洗脫直接將磁珠核酸復合物轉移至PCR管用于擴增。

2.2 實驗方案

2.2.1 優(yōu)化樣品回收率

建立一種樣品提取回收率測試的模型。取得定量濃度的細胞液，分別加不同體積的細胞液于干凈的玻片上，用棉簽擦拭置于1.5mL EP管中，加入裂解液后經磁珠富集純化，直接轉移磁珠核酸復合物至PCR反應管，根據每組細胞數量算出理論上該有多少DNA拷貝，然后直接在PCR體系中加入與實驗組相當的DNA拷貝數作為對照組，做熒光定量檢測分析。通過優(yōu)化裂解液中的相關組分的濃度和配比，如優(yōu)化離液鹽的種類和濃度、相關表面活性劑的種類和濃度、裂解時間、洗滌液和洗脫液的組分，得到高樣品回收率。

2.2.2 優(yōu)化樣品靈敏度

建立樣品靈敏度檢測的系統(tǒng)模型。分別稀釋各不同濃度梯度的人DNA置于棉簽上放入1.5mL EP管中，再經磁珠富集純化一整套流程得到富集純化好的磁珠核酸復合物，將磁珠核酸復合物一起轉入PCR管做熒光定量PCR的模板，使用熒光定量PCR檢測分析[14]。通過優(yōu)化裂解液中的相關組分的濃度和配比、洗滌液和洗脫液的組分篩選和優(yōu)化，提高樣品提取靈敏度。

2.2.3 優(yōu)化提取時間和反應穩(wěn)定性

通過優(yōu)化提取各個步驟的時間，在不降低相關提取參數的情況下，縮短提取的時間；通過設計實驗，將提取好的DNA放置一定時間后再進行STR檢測。通過統(tǒng)計學分析，探索新型高效納米試劑盒針對DNA 保存的穩(wěn)定性。

2.2.4 樣品適用性的檢測

挑選日常案件檢測中典型的檢材，每種取一定量進行檢測。得出每種檢材的檢出率，并與其他提取方法做比較。通過案件檢測中大量實際的樣品，對具體問題予以具體分析解決。

2.3 試劑盒操作方法及注意事項

新型納米磁珠試劑盒采用具有獨特分離作用的超順磁珠和各具特色的緩沖液系統(tǒng)，試劑盒具體組成如表1所示。磁珠之所以能達到快速分離純化核酸的目的，是因為在一定條件下，特殊包被的磁珠對目的核酸具有很強的親和力，能從樣品中分離高質量高純度核酸；而當條件改變時，磁珠又能釋放吸附的核酸。整個富集純化過程不涉及有毒試劑，安全、便捷，提取的核酸可以應用到各類下游分子生物學實驗中。本試劑盒可用于提取各種人體組織細胞、動物細胞及懸液、法醫(yī)檢材，也適用于核酸自動化提取平臺。

表1 新型納米磁珠試劑盒組成

2.3.1 裂解

剪取適量擦拭過犯罪現(xiàn)場生物檢材的棉簽拭子放入1.5mL EP套管中，加入100μL Lysis buffer（裂解液）及5μL protease K（蛋白酶K）混合均勻，在恒溫金屬浴中56℃溫浴20min以上，98℃溫浴5min，然后12000rpm離心5min，將上部載體套管去除，留下底部的裂解成分，進行下一步操作。

2.3.2 結合

加入震蕩混勻的磁珠20μL混勻，加入200μL Binding buffer （結合液）在震蕩器上混勻，靜置15min待其充分結合，期間震蕩2次，確保磁珠始終處于懸浮狀態(tài)。將EP管置于磁力架上，連同磁力架一起顛倒3～4次，吸棄廢液。

2.3.3 洗滌

加入800μL wash buffer （漂洗液），振蕩均勻，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液，重復一次；吸凈管蓋及管底的殘液，65℃開蓋干燥2min。

2.3.4 洗脫

加入30μL Elution buffer（洗脫液），震蕩均勻，65℃溫浴10min。然后磁分離，小心吸取上清液作為模板，進行下游實驗。

2.3.5 注意事項

磁珠用前一定要充分混勻；每次加洗滌液后放在漩渦震蕩器上充分震蕩混勻，確保磁珠呈完全分散懸浮狀態(tài)。

3 新型高效納米磁珠試劑盒檢測效果評估實驗

3.1 實驗材料

3.1.1 主要儀器

離心機（Eppendorf，德國）、漩渦振蕩器（Eppendorf，德國）、1.5mL恒溫金屬?。‥ppendorf，德國）、 LC480熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）、1.0mm打孔器（Whatman，英國）。

3.1.2 主要試劑和耗材

1.5mL EP套管（Thermo Fisher Scientific，美國）、新型高效納米磁珠試劑盒、96孔板（BioPlastics，荷蘭）、引物（上海捷瑞公司）、擴增液Mix（蘇州新海生物科技有限公司）、血卡（Whatman，英國）。

3.2 方法及結果

3.2.1 磁珠的篩選實驗

實驗分為11組，每組重復3管，每組對應所用磁珠如下：

第1組：DynalMyOne硅烷基磁珠，Dynal Biotech ASA（挪威），產品編號和粒徑 DynalMyOne（1μm）；

第2組：安科羥基磁珠，溫州安科納米科技有限公司，產品編號和粒徑：AK1-W200（200nm）；

第3組：OMEGA，OMEGA Biotek（美國），產品編號和粒徑：M6213-00（200nm）；

第4組：百運羥基磁珠，上海百運納米科技有限公司，產品編號和粒徑：BCS（-OH）（200nm）；

第5組：百運羧基磁珠，上海百運納米科技有限公司，產品編號和粒徑：BCS（-COOH）（200nm）；

第6組：海貍羧基磁珠，蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司，產品編號和粒徑：Mag COOH（200nm～1μm）；

第7組：海貍羥基磁珠，蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司，產品編號和粒徑：Mag OH（200nm～1μm）；

第8組：MagnaMedics硅基磁珠 ，MagnaMedics（美國），產品編號和粒徑：200nm；

第9組：MagnaMedics羧基磁珠，MagnaMedics（美國），產品編號和粒徑：200nm；

第10組：奧潤微磁珠,上海奧潤微納新材料科技有限公司,產品編號和粒徑：SM1-015（200nm）；

第11組：Corning磁珠，Corning（美國），產品編號和粒徑：Axygen AxyMag（200nm）；

樣品均為同一張大血卡使用1.0mm打卡器打下來的1.0mm血卡，采用新型納米磁珠試劑盒提取，各組按不同廠家磁珠加入等質量磁珠，使用新型納米磁珠試劑盒提取純化后，均用30μL洗脫液洗脫，取2μL洗脫液作為模板，按下列程序在LightCycle 480上擴增：95℃，10min；（95℃，15s；60℃，40s）×50循環(huán)。各實驗組熒光定量Ct值及磁珠在操作中的狀態(tài)如表2所示。磁珠聚沉與貼壁對比如圖1所示。

圖1 磁珠聚沉與貼壁對比圖

表2 熒光定量Ct值及磁珠在操作中的狀態(tài)顯示

實驗結果表明，DynalMyOne磁珠能滿足實驗要求，提取DNA效率高，且磁珠不易聚沉。Corning磁珠效果同樣較好，但是貨源供應不穩(wěn)定。因此，新型納米磁珠試劑盒的磁珠選用DynalMyOne磁珠。

3.2.2 標準品回收率測試

實驗分為4組定量標準DNA樣品，分別為50μL 0.5ng/μL G1471標準DNA溶液；50μL 1ng/μL G1471標準DNA溶液；50μL 2.5ng/μL G1471標準DNA溶液；50μL 5ng/μL G1471標準DNA溶液，每組重復3管，使用新型納米磁珠試劑盒提取純化后，用50μL洗脫液洗脫，取2μL洗脫液作為模板加入23μL熒光定量擴增液。用相同的實驗設計方法改用Qiagen M48型磁珠提取試劑盒純化，最后也用50μL洗脫液洗脫，取2μL洗脫液加入23μL熒光定量擴增液。

擴增程序：95℃，10min；（95℃，15s；60℃，40s）×50循環(huán)。

標準品：1ng/μL G1471人基因組標準DNA，2ng/μL G1471人基因組標準DNA，5ng/μL G1471，10ng/μL 人基因組標準DNA，各1μL分別加入PCR反應管并各補1μL 水。實驗結果如表3所示。新型納米磁珠與M-48型磁珠對標準品回定量折線如圖2所示。

表3 針對不同濃度標準品回收率測試結果

圖2 新型納米磁珠與M-48型磁珠對標準品回定量折線圖

實驗結果表明，新型納米磁珠試劑盒具有較高的回收效率，尤其是在低拷貝模板情況下，較M-48型磁珠試劑盒回收效率更高。

3.2.3 新型納米磁珠試劑盒樣本裂解環(huán)境測試

該部分實驗主要針對不同裂解液與不同裂解溫度對新型納米磁珠試劑盒進行比較。用1.0mm的打卡器打相同血卡12個孔，打下來的12個1.0mm血卡作為測試樣品。實驗分為4組，每組3個重復。4個實驗組分別為：第1組：使用低鹽裂解液95℃，15min進行裂解；第2組：使用低鹽裂解液56℃，20min，然后98℃，5min進行裂解；第3組：使用高鹽裂解液56℃，30min，然后98℃，5min進行裂解；第4組：使用高鹽裂解液95℃，15min進行裂解。使用新型納米磁珠試劑盒進行提取純化，最后30μL洗脫，取4μL作為模板，進行PCR，PCR循環(huán)反應條件： 95℃，11min（94℃，20s；59℃，180s）×28循環(huán)60℃，10min。毛細管凝膠電泳：甲酰胺15μL + PCR擴增樣品1.5μL，實驗結果如表4所示。不同裂解環(huán)境下新型納米磁珠試劑盒STR檢測圖譜如圖3所示。

表4 不同裂解環(huán)境對新型納米磁珠試劑盒的影響

圖3 不同裂解環(huán)境下新型納米磁珠試劑盒STR檢測圖譜

實驗結果表明，新型高效納米磁珠試劑盒使用低鹽先56℃處理，再98℃處理效果提取擴增更好。

3.2.4 靈敏度測試

實驗分為兩組，編號分別為第1組和第2組，每組取10支1.5mL EP管，各裝入50μL純水。第1組EP管里加入1μL 0.5ng/μL 9948人基因組標準DNA，第2組EP管加入1μL 0.125ng/μL 9948人基因組標準DNA，預先震蕩混勻，用新型納米磁珠試劑盒提取純化后，不用洗脫液洗脫，直接65℃烘干后，使用25μL ID-Plus擴增液將磁珠全部轉移至PCR反應管進行 PCR擴增及STR分析，實驗結果如表5所示。新型納米磁珠試劑盒純化不同濃度DNA樣本后STR檢測圖譜如圖4所示。

圖4 新型納米磁珠試劑盒純化不同濃度DNA樣本后STR檢測圖譜

表5 針對不同濃度DNA新型納米磁珠試劑盒純化后RFU值

實驗結果表明，新型納米磁珠試劑盒提取DNA樣品回收靈敏度達到125pg人類基因組。

3.2.5 血紅素去除測試

實驗分為4組，編號分別為第1組、第2組、第3組、第4組，每組重復3管。第1組EP管里加入30μL 純水，第2組加入30μL 250uM血紅素，第3組加入30μL 500uM 血紅素，第4組加入30μL 1000uM血紅素。在這4組EP管中均加入1μL 10ng/μL 9947人基因組標準DNA預先震蕩混勻，用新型納米磁珠試劑盒提取純化后加入30μL 洗脫液洗脫。用相同的實驗設計方法改用M-48型磁珠試劑盒提純，洗脫液體積與上述一致。

取2μL洗脫液作為模板加入到23μL熒光定量PCR擴增液中進行熒光定量PCR。熒光定量PCR循環(huán)反應條件：95℃，10min；（95℃，15s；60℃，40s）×50循環(huán)。使用儀器：Roche LC480 熒光定量PCR儀。

取4μL洗脫液作為模板加入到6μL ID-plus擴增液中進行PCR。PCR循環(huán)反應條件： 95℃，11min（94℃，20s；59℃，180s）×28循環(huán)60℃，10min。毛細管凝膠電泳：甲酰胺15μL + PCR擴增樣品1.5μL。實驗結果如表6～7所示。新型納米磁珠試劑盒純化不同濃度血紅素后STR檢測圖譜如圖5所示，M-48磁珠試劑盒純化不同濃度血紅素后STR檢測圖譜如圖6所示。

圖5 新型納米磁珠試劑盒純化不同濃度血紅素后STR檢測圖譜

圖6 M-48磁珠試劑盒純化不同濃度血紅素后STR檢測圖譜

實驗結果表明，新型納米磁珠試劑盒對血紅素的去除能力等于或優(yōu)于M-48型磁珠試劑盒。

3.2.6 腐殖酸去除測試

實驗分為4組，編號分別為第1組、第2組、第3組、第4組，每組重復3管。第1組EP管里加入30μL純水，第2組加入30μL 25ng/μL腐殖酸，第3組加入30μL 50ng/μL腐殖酸，第4組加入30μL 100ng/μL腐殖酸。在這4組EP管中均加入1μL 10ng/μL 9947人基因組標準DNA預先震蕩混勻，用新型納米磁珠試劑盒提取純化后加入30μL 洗脫液洗脫，取2μL洗脫液作PCR熒光定量擴增。用相同的實驗設計方法改用M-48型磁珠試劑盒提純，洗脫液體積與上述一致。

表7 新型納米磁珠與M-48型磁珠去除血紅素后RFU值

取2μL洗脫液作為模板加入到23μL熒光定量PCR擴增液中進行熒光定量PCR。熒光定量PCR循環(huán)反應條件：95℃，10min；（95℃，15s；60℃，40s）×50循環(huán)。使用儀器：Roche LC480 熒光定量PCR儀。

取4μL洗脫液作為模板加入到6μL ID-plus擴增液中進行PCR。PCR循環(huán)反應條件：95℃，11min（94℃，20s；59℃，180s）×28循環(huán)60℃，10min。毛細管凝膠電泳：甲酰胺15μL + PCR擴增樣品1.5μL。實驗結果如表8～9所示。新型納米磁珠試劑盒純化不同濃度腐殖酸后STR檢測圖譜如圖7所示，M-48型磁珠試劑盒純化不同濃度腐殖酸后STR檢測圖譜如圖8所示。

表8 新型納米磁珠與M-48型磁珠法去除腐殖酸熒光定量Ct值

表9 新型納米磁珠與M-48型磁珠法去除腐殖酸后RFU值

圖7 新型納米磁珠試劑盒純化不同濃度腐殖酸后STR檢測圖譜

圖8 M-48型磁珠試劑盒純化不同濃度腐殖酸后STR檢測圖譜

實驗結果表明，新型納米磁珠試劑盒對腐植酸的去除能力與M-48型磁珠試劑盒相當。

3.2.7 穩(wěn)定性測試

將人類基因組模板9948 1ng/μL 分別使用新型納米磁珠試劑盒洗脫液，M-48型磁珠試劑盒洗脫液，硅珠[3]60-61洗脫液來稀釋，稀釋至樣品濃度為0.2ng/μL , 0.1ng/μL, 0.05ng/μL。樣品均存放在4攝氏℃冰箱中，分別隔0天，1天，2天，5天，10天，20天各取1μL作為模板，加入到ID plus 體系中進行擴增，每組做四個平行對照。擴增產物進行毛細管電泳。比較三者的擴增情況，實驗結果如表10～12所示。針對標準品采用三種磁珠純化方法洗脫體系的STR檢測對照圖，如圖9～14所示。

表10 0.2ng標準品三種磁珠純化方法洗脫體系的穩(wěn)定性測試結果

表11 0.1ng標準品三種磁珠純化方法洗脫體系的穩(wěn)定性測試結果

表12 0.05ng標準品三種磁珠純化方法洗脫體系的穩(wěn)定性測試結果

圖9 0.2ng 4℃保存20天

圖10 0.1ng 4℃保存20天

圖11 0.05ng 4℃保存20天

圖12 0.05ng 4℃保存20天新型納米磁珠

圖13 0.05ng 4℃保存20天M48磁珠

圖14 0.05ng 4℃保存20天硅珠法

實驗結果表明，新型納米磁珠試劑盒洗脫液保存的模板可以在4℃條件下保存20天而仍能有效分型。新型納米磁珠洗脫液稀釋的樣品在存放20天后，擴增效果優(yōu)于其他實驗組。

3.3 新型納米磁珠試劑盒與其他磁珠類試劑盒比較

3.3.1 與M-48型磁珠試劑盒比較

取10張陳血卡，同一張血卡打6個0.8mm孔。分別標記為A1至A10，B1至B10, C1至C10, D1至D10，E1至E10，F(xiàn)1至F10；A，B，C系列30個樣品用新型納米磁珠試劑盒純化，D，E，F(xiàn)系列30個樣品用M-48型磁珠試劑盒純化。其中，A系列與D系列均用100μL 洗脫液洗脫，取4μL上清作為模板；B系列與E系列均用100μL 洗脫液洗脫，將洗脫液與磁珠混勻后取4μL作模板；C系列與F系列最后烘干后不加洗脫液，使用25μL的ID-plus擴增液轉移全部磁珠作為模板。實驗結果如表13所示。新型納米磁珠法STR檢測圖譜如圖15所示，M48型磁珠法STR檢測圖譜如圖16所示。

圖16 M48型磁珠法STR檢測圖譜

表13 新型納米磁珠與M-48型磁珠處理后RFU值

圖15 新型納米磁珠法STR檢測圖譜

實驗結果表明，新型納米磁珠試劑盒可以使用洗脫液洗脫進行擴增，也可以不洗脫將烘干后的全部磁珠轉移至PCR擴增液中進行PCR，起到富集樣本的作用。而M-48型磁珠磁珠試劑盒轉移磁珠會抑制PCR反應導致擴增失敗。

3.3.2 與國產東勝磁珠試劑盒比較

取10張陳血卡，同一張血卡打4個0.8mm孔。分別標記為A1-A10，B1-B10，C1-C10，D1-D10；A，B系列20個樣品為新型納米磁珠試劑盒純化；C，D系列20個樣品用東勝磁珠試劑盒按照其說明書步驟純化。其中A系列與C系列均用100μL洗脫液洗脫，取4μL上清作為模板；B系列與D系列均用100μL 洗脫液洗脫，將洗脫液與磁珠混勻后取4μL磁珠洗脫液混合液作模板。實驗結果如表14所示，新型納米磁珠與國產東勝磁珠試劑盒STR檢測圖譜如圖17所示。

圖17 新型納米磁珠與國產東勝磁珠試劑盒STR檢測圖譜

表14 新型納米磁珠與國產東勝磁珠純化后RFU值

實驗結果表明，新型納米磁珠試劑盒提取效果優(yōu)于國產東勝磁珠試劑盒。

4 新型高效納米磁珠試劑盒應用測試

4.1 不同常規(guī)檢材測試實驗

實驗分為4組，第1組樣品1.0mm血卡，第2組1.0mm唾液卡，第3組1mm 精斑，第4組1.0mm煙頭，每種樣品重復10個，使用TECAN自動化工作站，參照新型納米磁珠試劑盒操作說明書提取純化后，50μL 洗脫液洗脫。以相同的樣品量與洗脫體積，分別用M-48型磁珠提取試劑盒及東勝磁珠提取試劑盒提取上述樣品，按各自說明書操作，使用TECAN自動化工作站，使用同樣的洗脫液體積。

取4μL作為模板，進行PCR，PCR循環(huán)反應條件：95℃，11min（94℃，20s；59℃，180s）×28循環(huán)60℃，10min。毛細管凝膠電泳：甲酰胺15μL+ PCR擴增樣品1.5μL。實驗結果如表15所示，3種磁珠試劑盒純化后STR檢測圖譜如圖18～20所示。

圖18 常規(guī)檢材新型納米磁珠試劑盒純化后STR檢測圖譜

表15 3種磁珠試劑盒純化后檢測RFU值

實驗結果表明，新型納米磁珠試劑盒在上述4種檢材中使用自動化工作站提取效果優(yōu)于其他兩種試劑盒。

4.2 實際案件不同擦拭檢材測試實驗

實際案件擦拭物作為樣品，使用TECAN自動化工作站，參照新型納米磁珠試劑盒操作說明書提取純化后，30μL洗脫液洗脫。取4μL作為模板，進行PCR，PCR循環(huán)反應條件：95℃，11min（94℃，20s；59℃，180s）×28循環(huán)60℃，10min。毛細管凝膠電泳：甲酰胺15μL + PCR擴增樣品1.5μL，實驗結果如表16所示。實驗結果表明，實際案件微量生物檢材檢出效果良好。

表16 新型納米磁珠試劑盒對實際案件擦拭物的檢驗效果

圖19 常規(guī)檢材M-48磁珠試劑盒純化后STR檢測圖譜

圖20 常規(guī)檢材國產東勝磁珠試劑盒純化后STR檢測圖譜

5 結論

（1）通過對不同DNA提取試劑盒進行了靈敏度、樣品回收率、抗腐植酸、血紅素等PCR抑制劑的能力、樣品回收后的穩(wěn)定性、帶磁珠擴增對微量DNA的檢測比較，結果表明：①新型高效納米磁珠試劑盒具有較高的回收效率，尤其是在低拷貝模板情況下，較M-48型磁珠回收效率更高；②新型高效納米磁珠試劑盒可以對至少125pg的人基因組DNA進行提取純化并進行擴增分型；③新型高效納米磁珠試劑盒對血紅素、腐殖酸等抑制劑的去除能力與M-48型磁珠試劑盒相當，都能去除大量的PCR抑制劑；④新型高效納米磁珠試劑盒對煙蒂、血斑、精斑等常規(guī)檢材40份的檢出率達到100%；⑤新型高效納米磁珠試劑盒對樣品回收后DNA保存穩(wěn)定性高，4℃下存放1個月能夠有效檢出；⑥新型高效納米磁珠試劑盒能夠適用于自動化工作站大批量、快速操作；⑦新型高效納米磁珠試劑盒通過25μL帶磁珠擴增體系實現(xiàn)對微量DNA的高檢出率，能將所有提取到的DNA完全進行PCR擴增，極大地提高了檢出率。

（2）具備自主知識產權，成本可控，可進一步推廣至全國范圍內法醫(yī)檢測市場，以及生物、醫(yī)療研發(fā)機構，具有良好的社會效益和廣闊的市場前景。目前，公安系統(tǒng)提取生物物證DNA廣泛采用磁珠法，一方面，主要采用進口試劑，如Qiagen公司生產的M-48磁珠提取試劑盒及Qiacube硅膜提取試劑，均為公安實戰(zhàn)中使用較為廣泛的純化試劑盒。但在實際應用中，進口試劑盒操作步驟繁瑣、耗時較長，相關的設備和耗材均為進口配套產品，高昂的檢測成本也限制了其在經濟欠發(fā)達地區(qū)日常案件中的應用。另一方面，主要是國產的磁珠DNA提取試劑盒，如東勝磁珠試劑盒、博坤磁珠試劑盒。在實際應用中，國產試劑又存在DNA提取回收率低，磁珠上DNA不容易完全釋放、質量不穩(wěn)定等問題。通過對市面上11種知名廠家的優(yōu)質基礎納米磁珠進行篩選，優(yōu)化試劑，成功研制出了具有高回收效率的新型納米磁珠試劑盒，并且該試劑盒可以通過轉移全部磁珠的方法進行擴增，極大地提高了對微量案件檢材的檢出率。新型高效納米磁珠試劑盒已在一些公安機關實驗室日常的案件檢驗中使用，并取得了良好的檢驗效果。

（3）帶磁珠擴增體系實現(xiàn)對微量DNA的高檢出率，同時可用于處理大批量樣本，滿足自動化操作的需要。傳統(tǒng)的DNA提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機溶劑提取及乙醇沉淀等步驟，不但操作繁瑣，而且DNA提取中所用的去垢劑裂解、蛋白酶、有機溶劑等殘留試劑抑制PCR擴增，降低DNA檢出率；大批量樣本檢測過程中，繁雜的操作步驟也會增加樣本間交叉污染的風險。通過研究新型納米磁珠對樣本DNA進行富集，采用25μL帶磁珠擴增體系，不僅能有效地擴增微量檢材DNA，同時通過優(yōu)化磁珠法提取DNA操作步驟，簡便易行且適合機器語言，可滿足自動化操作的需要，可以同時處理大批量樣本，工作效率大大提升。

綜上所述，新型高效納米磁珠試劑盒出色的樣品回收率、PCR抑制劑去除能力、樣品回收后DNA保存的穩(wěn)定性，已經超越DNA實驗室傳統(tǒng)常規(guī)的磁珠純化試劑盒。新型高效納米磁珠試劑盒成本可控，檢測效率高且穩(wěn)定，可以極大地提高疑難檢材的檢出率，尤其是針對微量生物物證檢材具有很好的檢測效果，可為偵查辦案提供有力的證據。

6 不足與展望

（1）對于目前市面上常用的磁珠類型，本研究僅從市面上常用的11種磁珠篩選出滿足試劑盒要求的磁珠類型——DynalMyOne，該磁珠不易聚沉且提取DNA效率高。未來可進一步探究每種磁珠大小和結構組成，得出磁珠大小與結構對DNA提取檢測效率影響的原因，進而深入探索適用于公安實踐中不同檢材DNA純化的磁珠種類，將試劑盒做全做細做精，做到“關鍵核心技術牢牢掌握在自己手中”，加快公安科技創(chuàng)新，全面實現(xiàn)試劑盒國產自主化。

（2）本研究沒有進行檢材預處理方式對試劑盒純化效果影響的探討。未來可以考慮針對檢材材質進行分類，如光滑客體、粗糙客體、滲透性客體、非滲透性客體等，并設置幾種合理的預處理方式，如剪取法、擦拭法、粘取法、吸附法[15]等，再利用新型高效納米磁珠試劑盒進行純化比較STR檢測效果，得出針對某類檢材使用新型高效納米磁珠試劑盒進行純化之前最合適的預處理方式，全面提高微量生物物證DNA檢測率和成功率。

（3）新型高效納米磁珠試劑盒用于檢測陳舊性微量生物物證的實際案例較少。本研究中涉及實際案例生物物證檢材種類相對簡單、常規(guī)，未來可進一步開展相關模擬實驗，尤其是對于陳舊性的微量生物物證展開技術攻堅，針對不同種類的檢材模擬陳舊性檢材保存時長和環(huán)境進行實驗，探索適用于不同陳舊性生物檢材種類、保存時長及保存環(huán)境的純化試劑盒，針對陳舊性生物檢材提前優(yōu)選預處理方式和DNA提取純化方法，做到DNA精準純化，提高陳舊性疑難生物物證DNA檢測成功率。

（4）針對PCR 抑制劑的去除實驗，本研究主要探討了血紅素及腐殖酸兩大主要抑制劑的去除效果，實際案件中的抑制劑種類繁雜多樣，未來可進一步模擬實際案件中常見的PCR抑制劑環(huán)境，探討新型納米磁珠試劑盒針對如鐵銹、油污、染料、果酸等抑制劑的去除效果。

（5）針對磁珠核酸提取的實驗步驟，可以深入優(yōu)化現(xiàn)有的自動化實驗平臺。微流控芯片由于其集成化和低消耗的特點，在PCR核酸提取實驗中得以廣泛運用，在磁珠法核酸提取微流控系統(tǒng)上使用超聲振動微混合器對磁珠生物混合液進行混合，利用超聲振動的能量集中、頻率高的優(yōu)點，提高磁珠的混合效率，縮減混合時間，從而加快核酸提取效率。搭建基于運用超聲振動微混合器的磁珠法核酸提取微流控系統(tǒng)的自動化實驗平臺無疑是一個優(yōu)化方向[16]。

（6）本研究中多個實驗均涉及DNA標準品的使用，分別為標準品回收率測試使用0.5ng/μL G1471標準DNA溶液；靈敏度和穩(wěn)定性測試使用0.5ng/μL 9948人基因組標準DNA；血紅素和腐殖酸去除實驗使用10ng/μL9947標準DNA溶液。盡管使用了3種不同廠家標準品，但對于同一類型的實驗采用的是同一種標準品，對于最終實驗結果的影響相對較小。但今后的實驗中應盡量避免類似情況，控制單一變量，將影響因素控制到最小。