松材線蟲檢測技術(shù)研究進展

李敏，葉建仁，陳鳳毛

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210037)

松材線蟲病(pine wilt disease)又稱松樹萎蔫病，其病原是松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus(Steiner ＆Buhrer) Nickle[1－2]。 松材線蟲起源于北美洲[3]，我國于1982 年首次在南京中山陵的黑松Pinus thunbergii上分離到松材線蟲[4]。 此后，松材線蟲病在我國呈持續(xù)擴散蔓延態(tài)勢，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失[5]。 隨著該病害向高緯度地區(qū)擴散，對我國高緯度、高海拔地區(qū)的松林資源威脅進一步加大[6]。40 年來，我國松材線蟲病疫情尚未得到根本性的控制。

松材線蟲病防控的首要措施是檢測與監(jiān)測。 在我國發(fā)生松材線蟲病的前20 年，疫情監(jiān)測難以真正在基層開展，不能做到及時發(fā)現(xiàn)、及早除治。 疫木控制更是因為沒有可行的快速檢測技術(shù)，人為傳播現(xiàn)象嚴(yán)重。 因此，松材線蟲的檢測鑒定工作十分重要，致力于快速、準(zhǔn)確、便捷的病害診斷技術(shù)的研究工作一直在不斷推進。

1 基于形態(tài)學(xué)特征的檢測方法

松材線蟲的形態(tài)學(xué)檢測是一種在顯微鏡下觀察和分析形態(tài)特征的傳統(tǒng)檢測方法[7]，根據(jù)線蟲的體長、尾長、尾尖突形狀、中食道球的寬度、陰門的位置以及陰門蓋的有無等特征對線蟲進行鑒定[8]。

形態(tài)學(xué)檢測方法是最基本的鑒定方法，不需要貴重的儀器與設(shè)備，投入成本相對較小。 生產(chǎn)、科研、教學(xué)單位常采用該方法。 但是，形態(tài)學(xué)鑒別也有其自身的不足，最大難點在于區(qū)分與松材線蟲同屬的其它傘滑刃線蟲，尤其是與擬松材線蟲Bursaphelenchus mucronatus的區(qū)別難度最大。 在形態(tài)學(xué)特征出現(xiàn)重疊的情況下，鑒定往往帶有主觀性。 此外，通過形態(tài)學(xué)方法幾乎難以確定幼蟲和雄成蟲的種類。 因此，形態(tài)學(xué)檢測需要檢測人員具備豐富的線蟲學(xué)專業(yè)知識背景和實踐經(jīng)驗。 形態(tài)學(xué)檢測的時間相對較長，在沒有發(fā)現(xiàn)分離樣品中存在典型雌成蟲的情況下，需要對所分離的樣品逐一觀察，有時需要培養(yǎng)至成蟲出現(xiàn)再進行鑒定。

2 基于分子生物學(xué)的檢測方法

鑒于形態(tài)學(xué)鑒定存在的不足之處，研究人員先后研發(fā)了以核酸為基礎(chǔ)的松材線蟲分子生物學(xué)檢測方法。 主要有限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、序列特異擴增區(qū)域(sequence characterized amplified region，SCAR)、巢氏PCR(nested PCR)、實時熒光定量PCR(real-time PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重組聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)等。

2.1 RFLP 技術(shù)

20 世紀(jì)80 年代Lander 等[9]最早提出將RFLP標(biāo)記方法用于區(qū)別不同物種。 由于不同物種的DNA 序列結(jié)構(gòu)不同，內(nèi)切酶的識別位點以及數(shù)目不同，其被不同種類的限制性內(nèi)切酶酶切后，所表現(xiàn)出的凝膠電泳圖譜必然會反映物種間的差異。

在松材線蟲與其近似種的區(qū)別方面，很多學(xué)者利用ITS－RFLP 技術(shù)進行了探索[10－17]。 其中發(fā)現(xiàn)DraI 酶能夠酶切松材線蟲群體，產(chǎn)生兩個長度分別約510 bp 和380 bp 的片段，而近似種擬松材線蟲群體均不能被DraI 酶切；此外，SalI 酶不能酶切松材線蟲群體，但擬松材線蟲群體均能被酶切為兩條720 bp 和220 bp 的片段。 因此，內(nèi)切酶DraI、SalI可以很好地用來區(qū)分松材線蟲與擬松材線蟲這兩個近似種。

RFLP 是分析植物寄生線蟲種間和種下群體遺傳變異的有效工具。 但該方法所需操作步驟多，整個分析過程耗時過長，操作程序過于復(fù)雜。 此外，實驗對提取的線蟲DNA 有較高的要求，須保證DNA的純度。

2.2 PCR 技術(shù)

1)常規(guī)PCR。 Mullis 最早于1983 年提出聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)設(shè)想，1985 年P(guān)CR 技術(shù)誕生[18]。 此后，該技術(shù)成為最常用、最重要的分子生物學(xué)技術(shù)之一。DNA 的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA 在高溫時發(fā)生變性解鏈成為兩條單鏈，在低溫時兩條單鏈又可復(fù)性成為一條雙鏈。 因此，可通過溫度升降變化來控制DNA 的變性和復(fù)性，從而可實現(xiàn)某特定基因的體外復(fù)制，即PCR 技術(shù)。

PCR 技術(shù)的應(yīng)用，使植物寄生性線蟲的分子診斷和致病性的基礎(chǔ)研究發(fā)生了質(zhì)的變化。 基于序列差異的分子診斷方法已成為植物病理學(xué)的一種通用方法。 常規(guī)PCR 已廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究、種源鑒定研究和致病基因探索等領(lǐng)域。 使用PCR 技術(shù)可通過擴增特異性區(qū)域來區(qū)分形態(tài)類似的線蟲[19]，采用不同的引物進行檢測，將擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳儀驗證后可以提高線蟲鑒定的靈敏度。 與其它分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，將充分發(fā)揮PCR 在特定物種鑒定方面的作用。 該技術(shù)還可以實現(xiàn)對待測樣品的批量檢測。 PCR 檢測技術(shù)的核心是用于檢測物種的引物是否具有特異性，這需要在長期的實踐中進行檢驗。 常規(guī)PCR 檢測也需要借助凝膠電泳進行判斷，這也需要較長的時間，并非真正意義上的快速檢測。

2)巢式PCR。 常規(guī)PCR 在對模板進行擴增的過程中，引物與模板之間會出現(xiàn)非特異性配對，導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。 為提高PCR 擴增的特異性，Lee 等[20]對常規(guī)PCR 進行技術(shù)改良，發(fā)明了巢式PCR。 它是通過增加和擴增一組引物來提高PCR的特異性。 第1 對引物稱為普通PCR 引物，第2 對引物稱為巢氏引物。 首先使用普通PCR 引物進行擴增，然后針對第一次PCR 擴增產(chǎn)物使用巢氏引物進行第二次擴增，這使得第二次PCR 擴增的片段要短于第一次擴增。

2011 年，Huang 等[21]構(gòu)建了以拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ為靶點的松材線蟲特異性巢式PCR，對44 株形態(tài)特征明顯的線蟲株系進行了檢測，包括松材線蟲、擬松材線蟲、霍夫曼尼傘滑刃線蟲Bursaphelenchus hofmanni、吳氏長尾線蟲Seinura wuae、李氏長尾線蟲Seinura lii和大核滑刃線蟲Aphelenchoides macronucleatus，所有松材線蟲株系均有509 bp 擴增產(chǎn)物。該巢式PCR 體系可以檢測到50 fg 模板DNA 或一個卵大小的線蟲個體。 通過對田間線蟲侵染木材中提取的線蟲樣品分析，該方法是一種特異性強、靈敏度高的檢測方法。

巢氏PCR 的優(yōu)點是特異強，即使提取線蟲DNA 的量非常少，也能擴增特異性區(qū)域。 但如果第一次擴增發(fā)生錯誤，第二次就無法成功擴增，該方法很難同時檢測和區(qū)分多種病原物。

3)實時熒光定量PCR。 1989 年Choo 等[22]研發(fā)了實時熒光定量PCR 技術(shù)，也稱為RT －PCR 或qPCR(quantitative PCR)。 在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光染料或者帶熒光基團的探針，利用每次擴增循環(huán)后熒光信號的加倍積累，實時監(jiān)測PCR 進程，對標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而實現(xiàn)對物種未知模板初始含量的分析。

RT－PCR 已經(jīng)發(fā)展成為一種較為常用的線蟲種間鑒定方法[23－24]。 陳鳳毛 等[25]以松材線蟲的rDNA 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)為靶標(biāo)，設(shè)計了一對實時熒光定量PCR 引物和特異探針，構(gòu)建了松材線蟲實時熒光定量PCR 檢測方法。 特異引物組合F11/R11 與探針TaqMan－11 能夠較好地區(qū)分來自枯死松樹體內(nèi)的松材線蟲、擬松材線蟲、大核滑刃線蟲、霍夫曼尼傘滑刃線蟲和長尾屬Seinura線蟲。 在10 μL 的反應(yīng)體系中，能夠檢測出0.005 pg 的物種DNA 含量。表明該技術(shù)具有靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點。 RT －PCR 存在的不足主要是實驗過程相對較為耗時，且相關(guān)試劑和設(shè)備較為昂貴。

2009 年南京林業(yè)大學(xué)線蟲創(chuàng)新研究團隊在原有實時PCR 檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化高效線蟲裂解液，實現(xiàn)對松木樣本中的線蟲直接進行組織裂解釋放DNA；同時對線蟲特異性片段檢測過程、結(jié)果判讀和報告輸出等環(huán)節(jié)進行自動化設(shè)計，研制出松材線蟲專項自動化檢測系統(tǒng)。 該系統(tǒng)已在全國20 多省推廣應(yīng)用。

2.3 基于PCR 技術(shù)的分子標(biāo)記

1)RAPD 技術(shù)。 20 世紀(jì)90 年代，Williams[26]和Welsh[27]等研發(fā)了RAPD 分子標(biāo)記。 其引物是一條10 bp 的寡核苷酸單鏈隨機引物。 通常在物種的基因組中，每2 000 bp 長的序列內(nèi)約有10 個左右的反向重復(fù)序列，在兩條模板DNA 單鏈上就可能各有1 個引物的結(jié)合位點，若2 個結(jié)合位點間的序列在3 000 bp 的長度范圍之內(nèi)，便可擴增出該引物的譜帶。 通過不同的隨機引物就可以檢測到覆蓋整個基因組的位點，由此反映出該物種的真實多樣性。

RAPD 技術(shù)也曾用于線蟲檢測。 Braasch 等采用RAPD－PCR 技術(shù)對松材線蟲及其近似種擬松材線蟲的遺傳多樣性進行研究[28－31]。 Braasch 等發(fā)現(xiàn)隨機引物OPY－01、OPB－7N、OPPZ－08 能區(qū)分松材線蟲、假傘滑刃線蟲B.fraudulentus和擬松材線蟲。 陳鳳毛 等[32]研究發(fā)現(xiàn)隨機引物OPK09 與隨機引物組合OPC18 ＋OPN18 可以很好地區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲。

RAPD 所含信息量大，圖譜比較復(fù)雜，對實驗反應(yīng)體系和條件要求嚴(yán)格，擴增靈敏，重復(fù)性相對較低。 在物種鑒定(包括松材線蟲檢測)上存在一定難度。

2)SCAR 技術(shù)。 該技術(shù)是Paran 等[33]在RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新的分子標(biāo)記。 在物種特異的RAPD 片段序列上設(shè)計一對24 個堿基的互補引物，并對原來的模板DNA 擴增，特征序列擴增區(qū)域(SCARs)即被擴增檢測到。

SCAR 標(biāo)記在品種的抗病檢測、種質(zhì)鑒定等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[34－36]。 陳鳳毛 等采用SCAR 標(biāo)記構(gòu)建了松材線蟲檢測試劑盒，其檢測的靈敏度達(dá)到1/7條線蟲，并實現(xiàn)了對幼蟲的準(zhǔn)確檢測[37]。

SCAR 標(biāo)記可以快速檢測大量個體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。 但該方法程序多，完成全部檢測過程需要2.5 ～3.0 h。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)

LAMP 是Notomi 等[38]研發(fā)的一種新的核酸擴增方法。 不同于PCR 僅需要設(shè)計上、下游引物，LAMP 則需要設(shè)計包括外引物、內(nèi)引物等4 ～6 條引物。 僅需要在60 ～65 ℃的恒溫下，利用具有鏈置換效應(yīng)以及識別延伸效應(yīng)的BstDNA 聚合酶，對目的片段進行大量且快速的擴增。

LAMP 技術(shù)自開發(fā)以來，已經(jīng)在國內(nèi)外醫(yī)學(xué)病原物檢測、食品安全檢測及基因芯片等方面有廣泛的應(yīng)用且效果良好，近些年也逐漸應(yīng)用到植物病原檢測領(lǐng)域[39]。 在LAMP 擴增產(chǎn)物中，添加SYBR Green I 染料，以便于對檢測結(jié)果的判讀。 目前常通過ITS 區(qū)段、β－actin 區(qū)段、果膠酸裂解酶3 基因和expansin-like 基因檢測和區(qū)分致病線蟲是否為松材線蟲[40－41]。 據(jù)Kikuchi 等[42]報道，日本開發(fā)了一種商業(yè)化的、用LAMP 方法檢測松材線蟲的試劑盒，診斷結(jié)果需要1.5 h 左右。

LAMP 操作簡單、成本低廉且設(shè)備需求不高，不需要昂貴的儀器設(shè)備即可用于具有熒光樣品的現(xiàn)場檢測。 然而LAMP 擴增的產(chǎn)物不是連續(xù)的片段，這使得克隆或在其他方面的應(yīng)用變得局限。 在高溫和長時間放大過程中，由于陽性樣品的氣溶膠交叉污染，有可能獲得假陽性樣品。 此外，通過顏色判讀結(jié)果，也存在一定誤差。

鑒于顏色判別存在的主觀差異問題，南京林業(yè)大學(xué)于2009 年在LAMP 技術(shù)基礎(chǔ)上，成功研發(fā)了CPA(crossing priming amplification) 技 術(shù)。 該 技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、易于判讀、檢測設(shè)備簡單、一次性投資低廉、易于普及等優(yōu)點。 目前已在浙江、江蘇、上海、四川、重慶、安徽、山東等7 省推廣應(yīng)用。

2.5 重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)

RPA 是TwistDx Inc 公司于2006 年開發(fā)的一項技術(shù)[43]。 該技術(shù)主要依賴于能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)重組酶T4 UvsX、單鏈結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA 聚合酶等。 重組酶與擴增引物結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體，插入雙鏈DNA 形成D －環(huán)結(jié)構(gòu)，啟動鏈置換反應(yīng)。 SSB 蛋白與解開的DNA鏈結(jié)合防止進一步被置換。 重組酶從復(fù)合體中被水解，3′端引物暴露并與DNA 聚合酶結(jié)合，DNA 開始復(fù)制延伸，2 條母鏈分離，形成2 條新的互補雙鏈DNA，從而實現(xiàn)對模板上的目標(biāo)區(qū)域進行指數(shù)式擴增。

RPA 不需要熱變性，也不需要溫控設(shè)備。 在23 ～45 ℃條件下，20 min 內(nèi)即可完成擴增過程，實現(xiàn)快速檢測目標(biāo)。 可與實時熒光檢測、側(cè)向?qū)游龊湍z電泳以及橋聯(lián)絮凝分析、比色反應(yīng)、電化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)、電化學(xué)生物傳感器、硅微環(huán)諧振器(SMR)光子檢測和表面增強拉曼散射(SERS)等檢測方法結(jié)合，以實現(xiàn)快速檢測[44]。

Cha 等[45]將便攜式光學(xué)等溫裝置(POID)，結(jié)合應(yīng)用松木中松材線蟲gDNA 的快速提取緩沖液(DAP buffer)，進一步簡化檢測程序，能在田間25 min內(nèi)完成松材線蟲病診斷，實現(xiàn)對松材線蟲的現(xiàn)場檢測。 用于檢測松材線蟲的POCD－RPA 將有助于該領(lǐng)域的流行病學(xué)調(diào)查以及木材貿(mào)易的檢疫過程。 對于沒有線蟲專業(yè)知識背景的人員而言，該檢測方法相對容易，且檢測結(jié)果比較準(zhǔn)確，但需要專用檢測設(shè)備。

3 基于蛋白的檢測方法

蛋白在生物體中起著非常關(guān)鍵的作用，如參與細(xì)胞的增殖分化、能量轉(zhuǎn)換或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。 膜蛋白的分布并不均勻，而且特定物種之間存在較大差異，因此不同物種的蛋白就相當(dāng)于一個獨特身份的“條形”碼，通過分析蛋白的表達(dá)水平和表達(dá)模式可以確定線蟲的種類和不同線蟲的種間差異[46－47]。 從樹體分離的線蟲中提取蛋白后，可通過蛋白質(zhì)序列差異分析、同工酶分析(isozyme analysis)、二維凝膠電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DGE)和蛋白飛行時間質(zhì)譜技術(shù)等較為成熟的技術(shù)手段，對線蟲進行鑒定。

3.1 雙向凝膠電泳(2-DGE)

該技術(shù)是由Farrell、Klose 以及Scheele 等人于1975 年發(fā)明[48]。 其原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同，在一個穩(wěn)定和連續(xù)的pH 梯度中進行分離和分析，具有相同等電點的蛋白質(zhì)無論分子大小，均會聚集在其特定位置；第二向則按分子量的不同，用SDS－PAGE 分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面分開。 因此，根據(jù)不同線蟲種類間所含蛋白質(zhì)分子的大小及質(zhì)荷比等差異，可用雙向凝膠電泳分離技術(shù)進行鑒定。 Fu 等從松材線蟲和擬松材線蟲中提取蛋白后，采用雙向凝膠電泳技術(shù)比較了這兩種物種間的蛋白質(zhì)表達(dá)模式，與擬松材線蟲相比，在松材線蟲中共鑒定出15 種高表達(dá)特異蛋白[49]。

雙向凝膠電泳的優(yōu)點是快速、分辨率高，同時也是唯一能夠?qū)⑸锨ХN蛋白質(zhì)同時分離和展示的技術(shù)。 其缺點也很明顯，通過分離的蛋白數(shù)量和觀察到的多態(tài)性結(jié)果取決于使用的程序和分析的樣品數(shù)量，有時很難對蛋白斑點進行區(qū)分，因為很難評估觀察到的相似或差異是真實的還是凝膠形變導(dǎo)致的，操作較為復(fù)雜。

3.2 同工酶分析

Dias 等1994 年描述了同工酶分析技術(shù)[50]。 同工酶作為一類蛋白質(zhì)，廣泛存在于生物中，其主要分離方法有電泳法、層析法、酶學(xué)法和免疫學(xué)法，其中以電泳法應(yīng)用最為廣泛[51]。 從線蟲中提取可溶性蛋白后，對其特定的同工酶進行染色，根據(jù)不同同工酶的分子結(jié)構(gòu)、活性以及免疫原性等特異性，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析法可對不同線蟲物種進行鑒定。 胡凱基等對松材線蟲和擬松材線蟲的酶電泳進行分析，結(jié)果表明其蘋果酸脫氫酶譜、纖維素酶譜和酯酶譜等有差異，但并不穩(wěn)定，只有谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶可將松材線蟲和擬松材線蟲成功區(qū)分[52]。盡管目前蘋果酸脫氫酶、超氧化物歧化酶等在線蟲蛋白檢測中被使用，但該方法操作繁瑣且費時，必須有一個已知樣品作為參考，因此使用較為受限。

3.3 蛋白飛行時間質(zhì)譜技術(shù)

該技術(shù)是一種精確測定物種蛋白質(zhì)質(zhì)量的新型技術(shù)，又稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization － time of flight mass spectrometry，MALDI － TOF MS)，由Karas 等于1987 年發(fā)明[53]，其原理是將不同物種或種群間蛋白質(zhì)譜中產(chǎn)生的特定峰作為生物標(biāo)記來鑒定不同物種。 Fu 等[49]通過雙向凝膠電泳比較了松材線蟲和擬松材線蟲的蛋白表達(dá)，并使用MALDITOF/TOF 對強度出現(xiàn)差異的15 個蛋白斑點進行了分析，鑒定出松材線蟲特有的蛋白。 雙向凝膠電泳技術(shù)和蛋白飛行質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用為線蟲分類提供了一個強有力的工具，但其結(jié)果會受到諸多因素的影響，包括蛋白的提取方法、雙向凝膠電泳結(jié)果的質(zhì)量以及儀器的操作準(zhǔn)確性等，線蟲的不同齡期和生長條件也會導(dǎo)致表達(dá)譜的變化[54]。

4 展望

松材線蟲形態(tài)鑒定是基本的方法，是其他檢測方法的基礎(chǔ)。 鑒于形態(tài)鑒定的缺點而研發(fā)高效率的各種分子檢測方法，面臨的最核心問題就是檢測的準(zhǔn)確性。 多種近似種以及超大樣本量對研發(fā)分子檢測技術(shù)具有決定性作用。 準(zhǔn)確性還取決于后期實踐檢測過程中的不斷檢驗。 目前，南京林業(yè)大學(xué)建有國內(nèi)唯一的松樹寄生線蟲蟲株資源庫，也是國內(nèi)外松樹寄生線蟲蟲株數(shù)量最多的蟲株資源庫，收集有全國各疫區(qū)松材線蟲蟲株資源，其中松材線蟲蟲株460 個，擬松材線蟲蟲株110 個，其他松樹寄生線蟲蟲株140 個。 該蟲株資源庫為松材線蟲分子生物學(xué)檢測方法的研發(fā)提供了堅實的支撐。

20 世紀(jì)末期，RFLP、RAPD、SCAR 等技術(shù)，對推動松材線蟲種類鑒定起到了積極作用，但由于這些技術(shù)存在復(fù)雜性、重復(fù)性、操作程序和檢測時間等問題，沒有真正在生產(chǎn)實際上廣泛應(yīng)用。

2006 年，我國研發(fā)出的松材線蟲分子檢測技術(shù)成功應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，并在全國推廣應(yīng)用。 尤其是2009 年研發(fā)出松材線蟲自動化分子檢測鑒定技術(shù)，實現(xiàn)了松材線蟲病分子檢測技術(shù)在我國各省市縣的推廣和普及化，依靠該檢測技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)方法，基本解決了我國松材線蟲病檢疫和監(jiān)測過程中的鑒定技術(shù)難題[55－56]。

近年來興起的LAMP、POCD －RPA 等檢測方法，在檢測便利性、檢測時間、檢測成本等方面都具有較大的優(yōu)勢。 但這些方法還需要在生產(chǎn)實踐中繼續(xù)檢驗。 基于蛋白質(zhì)的方法為今后物種鑒定提供了一種可期待的研究方向。 但確定蛋白表達(dá)模式需要繁瑣的實驗步驟，提取的蛋白也比較容易降解，這可能會影響判斷的準(zhǔn)確性，這也是該方法難以大量應(yīng)用的主要原因。

在松材線蟲病感染初期，樹體基本沒有病癥顯現(xiàn)，無法精準(zhǔn)判斷林間樹體是否感病，通過傳統(tǒng)分子生物學(xué)檢測方法和基于蛋白的檢測方式判斷林中疫木較為困難；一旦植物感病晚期相關(guān)癥狀開始出現(xiàn)時，基本已無法治療。 因此，在松材線蟲病侵染初期未顯現(xiàn)癥狀的松林同樣需要快速檢測和治療，未來可通過基于樹體外觀癥狀、線蟲形態(tài)學(xué)、DNA 以及蛋白的檢測方法與化學(xué)或物理檢測方式(如感染松材線蟲病的標(biāo)志性揮發(fā)性氣體、樹體外觀光譜學(xué)分析或樹體導(dǎo)電率差異等)相結(jié)合，以實行快速有效的檢測。