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    抗菌涂料抗菌性能的測(cè)定方法

    2022-12-29 01:52:08趙慧呂曉飛許琳董亞楠梁青丁楠
    關(guān)鍵詞:樣板活菌菌液

    趙慧 呂曉飛 許琳 董亞楠 梁青 丁楠

    (河北省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,河北石家莊 050000)

    隨著人們生活水平的不斷提高,人們對(duì)裝飾用涂料的要求也越來(lái)越高??咕苛鲜侵竿ㄟ^(guò)添加具有抗菌功能并能在涂膜中穩(wěn)定存在的抗菌劑,經(jīng)一定工藝加工后制成的具有殺菌和抑菌功能的涂料。當(dāng)抗菌涂料用于公共場(chǎng)所時(shí),能夠降低公共場(chǎng)所的細(xì)菌數(shù)量,降低交叉感染和接觸感染的幾率;用于居家環(huán)境時(shí),能有效地降低家具等物品上的細(xì)菌密度,優(yōu)化人們的居住環(huán)境。不同的抗菌劑對(duì)于抗菌涂料的抗菌性能有所不同[1,2]。

    目前,我國(guó)關(guān)于抗菌涂料抗菌性能的標(biāo)準(zhǔn)有推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21866-2008《抗菌涂料(漆膜)抗菌性測(cè)定法和抗菌效果》[3]。在此標(biāo)準(zhǔn)中,測(cè)定抗菌涂料抗菌性能的方法為定量接種細(xì)菌于待檢驗(yàn)樣板上,用貼膜的方法使細(xì)菌均勻接觸樣板,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)后,檢測(cè)樣板中的活菌數(shù)。所用菌株為致病性的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌。但是在我們的生活環(huán)境中除了致病菌還有許多其他的微生物。這些微生物如果在表面大量聚集和繁殖,既會(huì)給人們的健康和居住環(huán)境帶來(lái)很大的危害,也會(huì)造成墻面、家具等表面被侵蝕[4]。白色葡萄球菌是人類皮膚和粘膜上的一種正常細(xì)菌,在環(huán)境中廣泛存在,并且被用作環(huán)境檢測(cè)常用菌種[5],它被認(rèn)為是一種常見(jiàn)的環(huán)境菌。當(dāng)人體抵抗力降低或涉及到不正常的寄生部位時(shí),也會(huì)引起許多感染,危及人體。

    本研究采用上述方法對(duì)抗菌涂料進(jìn)行抗大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能測(cè)定,印證此方法在本實(shí)驗(yàn)室可行并且所用抗菌涂料具有很好的抗菌性能。選用在環(huán)境中常見(jiàn)的非致病菌白色葡萄球菌對(duì)抗菌涂料的抗菌性能進(jìn)行研究,確定其菌液濃度、作用時(shí)間等關(guān)鍵因素。這是白色葡萄球菌在抗菌涂料抗菌性能研究中的首次運(yùn)用,填補(bǔ)了抗菌涂料抗非致病性細(xì)菌研究的空白。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 實(shí)驗(yàn)原料和儀器

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

    抗菌涂料:立邦凈味120 竹炭抗菌無(wú)添加內(nèi)墻乳膠漆;

    空白對(duì)照涂料:立邦新時(shí)時(shí)麗亞光內(nèi)墻乳膠漆;

    大腸埃希氏菌(Escherichia coli):ATCC 25922;

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):ATCC 6538;

    白色葡萄球菌(Staphylococcus albus):ATCC 8799;

    營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:北京陸橋技術(shù)股份有限公司,稱取干粉培養(yǎng)基,按比例溶于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,分裝,經(jīng)過(guò)121℃ 15 min 高溫高壓滅菌;

    營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:北京陸橋技術(shù)股份有限公司,稱取干粉培養(yǎng)基,按比例溶于蒸餾水中,溶解,分裝,經(jīng)過(guò)121℃ 15 min 高溫高壓滅菌;

    洗脫液:0.85% NaCl 生理鹽水加入0.2%吐溫80,用0.1mol/LNaCl溶液或0.1mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0~7.2,分裝,經(jīng)過(guò)121℃ 15 min 高溫高壓滅菌;

    培養(yǎng)液:用于大腸桿菌的培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與洗脫液的比例為1/500;用于金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與洗脫液的比例為1/100;用于白色葡萄球菌的培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與洗脫液的比例為1/100;

    消毒液:70%乙醇溶液;

    覆蓋膜:聚乙烯薄膜,尺寸為(4 0±2)m m×(40±2)mm、厚度為(0.05~0.10)mm,用消毒液浸泡10 min,再用洗脫液沖洗,自然干燥;

    樣板:PVC 板,尺寸為(50±2)mm×(50±2)mm、厚度為(0.20~0.30)mm,用消毒液浸泡10 min,再用洗脫液沖洗,自然干燥。

    1.1.2 儀器設(shè)備

    隔水式恒溫培養(yǎng)箱:GHP-9270 型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;

    超凈工作臺(tái):SW-CJ-2Fb 型,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;

    立式壓力蒸汽滅菌器:BXM-75VD 型,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;

    電子天平:Scout SE-SE2001F 型,奧豪斯儀器(常州)有限公司;

    無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑90 mm;

    無(wú)菌刻度吸管或微量移液器及無(wú)菌吸頭;

    無(wú)菌鑷子;

    接種環(huán)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 樣板的制備

    A(陰性對(duì)照樣板):未涂刷任何涂料面積為50 mm×50 mm 的樣板。

    B(空白對(duì)照樣板):涂刷未添加抗菌成分的空白對(duì)照涂料面積為50 mm×50 mm 的樣板。

    C(抗菌涂料樣板):涂刷添加抗菌成分涂料的面積為50 mm×50 mm 的樣板。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

    制備大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌濃度為(5.0~10.0)×105CFU/mL 的菌懸液[6],分別滴加0.5 mL 菌懸液至A、B、C 樣板上,用無(wú)菌鑷子將覆蓋膜均勻且無(wú)氣泡地蓋在樣板上,使菌均勻接觸樣品。置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中(37±1)℃條件下24 h。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。靜置結(jié)束后分別加入20 mL 洗脫液反復(fù)沖洗樣板和覆蓋膜,混勻后稀釋并接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(37±1)℃條件下培養(yǎng)(24~48)h 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[6]。

    制備白色葡萄球菌的菌懸液,濃度分別為(5.0~10.0)×103CFU/mL、(5.0~10.0)×105CFU/mL、(5.0~10.0)×107CFU/mL,分別滴加0.5 mL 菌懸液至A、B、C 樣板上,用上述方法進(jìn)行抗菌性能實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),每個(gè)濃度做3個(gè)平行。

    制備白色葡萄球菌最適濃度的菌懸液,分別滴加0.5 mL菌懸液至A、B、C 樣板上,用無(wú)菌鑷子將覆蓋膜均勻且無(wú)氣泡地蓋在樣板上,使菌均勻接觸樣品。于無(wú)菌培養(yǎng)皿中(37±1)℃條件下分別靜置12 h、24 h、48 h。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。靜置結(jié)束后用洗脫液沖洗,稀釋后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

    抗菌率計(jì)算公式為:

    式中:R-抗菌率,單位為%;B-空白對(duì)照樣板平均回收菌數(shù),單位為CFU/片;C-抗菌涂料樣板平均回收菌數(shù),單位為CFU/片。

    2 結(jié)果

    2.1 抗大腸埃希氏菌

    選取大腸埃希氏菌菌液濃度為8.0×105CFU/mL 的菌懸液0.5 mL 至樣板上,即4.0×105CFU/片進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表1 所示。

    表1 抗大腸埃希氏菌的3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    由表1 可以得出,樣品A 的實(shí)際回收活菌數(shù)值均不小于1.0×105CFU/片,且樣品B 的實(shí)際回收活菌數(shù)值均不小于1.0×104CFU/片。而且同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合(最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值)/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0,小于0.3。符合GB/T 21866-2008 標(biāo)準(zhǔn)中的要求,實(shí)驗(yàn)有效。由上述數(shù)據(jù)可以得出此抗菌涂料抗大腸埃希氏菌的抗菌率為99.98%。

    2.2 抗金黃色葡萄球菌

    選取金黃色葡萄球菌菌液濃度為7.0×105CFU/mL 的菌懸液0.5 mL 至樣板上,即3.5×105CFU/片進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2 所示。

    表2 抗金黃色葡萄球菌的3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    由表2 可以得出,樣品A 的實(shí)際回收活菌數(shù)值均不小于1.0×105CFU/片,且樣品B 的實(shí)際回收活菌數(shù)值均不小于1.0×104CFU/片。而且同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合(最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值)/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0,小于0.3。符合GB/T 21866-2008 標(biāo)準(zhǔn)中的要求,實(shí)驗(yàn)有效。由上述數(shù)據(jù)可以得出此抗菌涂料抗金黃色葡萄球菌的抗菌率為99.96%。

    由以上實(shí)驗(yàn)可以證明實(shí)驗(yàn)所用方法在本實(shí)驗(yàn)室可行,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有效;本實(shí)驗(yàn)選用的抗菌涂料抗大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的性能大于99.9%,抗菌性能優(yōu)良。

    2.3 抗白色葡萄球菌

    此抗菌涂料抗白色葡萄球菌性能的方法研究從菌液濃度和作用時(shí)間兩個(gè)關(guān)鍵因素來(lái)考慮。

    2.3.1 不同菌液濃度

    分別選取白色葡萄球菌菌液濃度為6.0×103CFU/mL、7.2×105CFU/mL、6.8×107CFU/mL 三個(gè)濃度的菌懸液0.5 mL滴加至樣板上,即3.0×103CFU/片、3.6×105CFU/片、3.4×107CFU/片進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3 所示。

    由表3 可以看出,當(dāng)菌液濃度為6.0×103CFU/mL 即3.0×103CFU/片時(shí),涂刷抗菌涂料的C 樣板回收菌很少,幾乎沒(méi)有,不成規(guī)律,無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算抗菌率。

    表3 不同菌液濃度抗白色葡萄球菌的3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    當(dāng)菌液濃度為6.8×107CFU/mL 即3.4×107CFU/片時(shí),同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合(最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值)/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0.43,大于0.3。這說(shuō)明空白對(duì)照樣品的3 次平行實(shí)驗(yàn)誤差大,涂在抗菌涂料上面誤差也會(huì)很大,此數(shù)據(jù)被認(rèn)為是不可信的。

    當(dāng)菌液濃度為7.2×105CFU/mL 即3.6×105CFU/片時(shí),涂刷抗菌涂料的C 樣板菌數(shù)在平板上分布均勻,比較平行。且同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合(最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值)/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0,小于0.3。經(jīng)過(guò)計(jì)算得出抗菌率為99.97%。

    因此,白色葡萄球菌的最適菌液濃度為7.2×105CFU/mL即3.6×105CFU/片。

    2.3.2 不同作用時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    分別選取12 h、24 h、48 h 三個(gè)不同的作用時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了防止取出樣板時(shí)溫度變化影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),選用三次完全獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)不同作用時(shí)間的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。

    表4 不同作用時(shí)間抗白色葡萄球菌的3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    由表4 可以看出,當(dāng)菌液在樣板上培養(yǎng)12 h 后將菌液洗脫下來(lái)并計(jì)數(shù),明顯的可以看出涂刷抗菌涂料的C 樣板回收菌數(shù)比較多,抗菌率為98.2%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),菌液在樣板上培養(yǎng)24 h 后洗下計(jì)數(shù),抗菌率有了明顯的提高,達(dá)到99.7%。但是隨著時(shí)間進(jìn)一步的延長(zhǎng),菌液在樣板上培養(yǎng)48 h后洗下計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照和空白對(duì)照回收的菌數(shù)都比較少,推測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),菌種自然衰亡現(xiàn)象發(fā)生,并且同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合(最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值)/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0.67,大于0.3。推測(cè)自然衰亡造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不平行。因此,白色葡萄球菌的最佳作用時(shí)間為24 h。

    3 結(jié)束語(yǔ)

    本實(shí)驗(yàn)在確定實(shí)驗(yàn)所用涂料的抗菌性能優(yōu)良,實(shí)驗(yàn)室方法可行的前提下,首次提出選用在環(huán)境中常見(jiàn)的非致病菌白色葡萄球菌對(duì)抗菌涂料的抗菌性能進(jìn)行研究,確定其菌液濃度為7.2×105CFU/mL,作用時(shí)間為24 h。填補(bǔ)了抗菌涂料抗非致病性細(xì)菌研究的空白。

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