可視化鐵離子熒光探針的合成及性能研究

余亮，江薇，江蓉，黃良芳，胡曉倩，方輝平，柯仲成,4，史建俊*，李長江,4*

1(黃山職業(yè)技術學院 醫(yī)學系，安徽 黃山，245041)2(黃山學院 化學化工學院，安徽 黃山，245041) 3(黃山學院 生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山，245041)4(黃山學院 中藥功效成分與健康技術研究中心，安徽 黃山，245041)

人體的必需微量元素中鐵的含量最高，在氧的運輸和貯存、合成細胞中色素和部分金屬酶、增強免疫功能等生理活動方面，發(fā)揮著非常重要的作用[1-2]。人體內(nèi)鐵的缺失或過量均會產(chǎn)生疾病，鐵缺失會導致血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等多個系統(tǒng)臟器的功能障礙。然而，過量的鐵也會引起組織的損壞、肝脾功能障礙、腫瘤甚至死亡等嚴重的狀況[3-8]。因此，快速、準確地檢測食品及人體中鐵的含量非常重要。與電子耦合等離子體-質(zhì)譜法(electron coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)、原子吸收光譜法(atomic absorption spectrum，AAS)、循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)等傳統(tǒng)檢測方法相比[9-13]，熒光探針操作簡單，具有良好的響應性和高靈敏度，是一種檢測金屬離子快速有效的方法[14-15]。

羅丹明類熒光染料分子經(jīng)改性后的酰胺部分能進行螺環(huán)的“開-閉”功能，閉環(huán)時分子無色且無熒光，當遇見某種金屬離子后，螺環(huán)打開呈現(xiàn)出顏色和熒光，因此作為一類很好的金屬離子熒光探針備受關注[16-17]。目前，不少新的羅丹明類熒光探針分子被研究出來，它們多用于Cu2+、Zn2+、Hg2+等的識別，且靈敏度低、抗干擾能力弱[18-19]。為得到性能良好的熒光探針分子，本文設計以羅丹明101、乙二胺和8-羥基久洛尼定為原料，合成了新型結(jié)構(gòu)的探針R[20-22]。通過研究發(fā)現(xiàn)，探針R能很好的選擇性識別Fe3+，抗干擾能力強，靈敏度高，同時其生物相容性好，熒光發(fā)射波長為610 nm，能很好的避免生物體本身的熒光影響，為進一步快速有效地檢測生物體內(nèi)Fe3+的含量提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅丹明101、乙二胺、8-羥基久洛尼定、金屬鹽(氯化物，硝酸銀除外)等試劑，阿拉丁試劑(上海)有限公司；除乙醇無水處理外，其他試劑均為分析純，實驗用水為超純凈水。

AM-400 MHz型核磁共振儀，德國Brucker公司；UV-2450紫外可見分光光度計、RF-5301PC熒光光譜儀，日本Shimadzu公司；IX71倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 探針R的合成

探針R的合成路線如圖1所示。

圖1 探針R的合成Fig.1 Continuous two-step synthesis of R

1.2.1.1N-氨乙基-羅丹明101酰亞胺的合成

100 mL茄形燒瓶中加入無水乙醇45 mL，繼續(xù)加入4.066 2 g羅丹明101，攪拌下加熱至完全溶解。隨后緩慢滴加乙二胺溶液4 mL，110 ℃回流反應。采用薄層色譜(thin-layer chromatography，TLC)實時跟蹤反應程度，待反應徹底完成后，將反應液緩慢倒入劇烈攪拌的冰水中，析出大量白色固體，減壓抽濾，并用少量無水乙醇進行淋洗，真空干燥后稱重為2.323 3 g，產(chǎn)率約為57%。

1.2.1.2 9-羰基-8-羥基久洛尼定的合成

稱取5 g 8-羥基久洛尼定于三頸燒瓶中，加入10 mLN,N-二甲基甲酰胺(N,Ndimethylformamide，DMF)，冰浴攪拌下將4.5 g三氯氧磷和10 mL DMF充分混合，倒入分液漏斗進行滴加，滴完反應30 min后，100 ℃繼續(xù)反應1.5 h，冷卻后緩慢加入25 mL冰水攪拌，減壓抽濾干燥，得綠色固體，用石油醚和乙酸乙酯1∶1進行洗脫，最終得到淡黃色晶體，稱重得4.132 1 g，產(chǎn)率約為83%。

1.2.1.3 探針R的合成

稱取N-氨乙基-羅丹明101酰亞胺固體0.538 5 g，溶于10 mL的無水乙醇中，加熱攪拌下加入9-羰基-8-羥基久洛尼定0.226 4 g，并滴加1 mL冰醋酸，100 ℃下回流反應，溶液逐漸變黃，采用TLC實時跟蹤反應，待反應完成后，濃縮母液，冷卻后減壓抽濾，固體用少量無水乙醇淋洗，通過重結(jié)晶，最終得0.285 5 g黃色固體R，產(chǎn)率約為53%。通過分析產(chǎn)物的核磁譜圖(附圖1、附圖2，https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220905.1657.010.html，下同)和質(zhì)譜圖(附圖3)得：1H NMR(400 MHz，CDCl3，TMS)δ：7.88(m，1H)，7.68(s，1H)，7.41(m，2H)，7.06(m，1H)，6.49(s，1H)，5.99(s，2H)，3.26(m，4H)，3.15(m，8H)，3.08(dt，4H)，2.92(m，4H)，2.62(dd，4H)，2.46(m，4H)，2.04(qd，4H)，1.87(m，8H)，1.24(t，1H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3，TMS)δ：168.34，163.82，163.01，154.17，148.19，146.87，143.60，132.33，130.88，128.78，127.73，124.54，123.94，122.64，117.23，112.19，107.78，106.88，105.26，65.72，53.25，50.11，49.88，49.47，41.38，27.23，22.24，22.02，21.49，21.24，20.29 ppm。MS，m/z：731.00[M]+，理論計算值731.38。

1.2.2 溶液的配制

將NaCl、KCl、ZnCl2、CaCl2、BaCl2、FeCl3、NiCl2、CuCl2、PbCl2、MnCl2、CrCl3、CoCl2、HgCl2、AgNO3、EDTA，用1 mol/L，pH為7.3的2-[4-(2-羥乙基) -1-哌嗪基]乙磺酸緩沖溶液配制成3 mmol/L的溶液。用乙腈水溶液[V(水)∶V(乙腈)=1∶4]配制濃度為0.3 mmol/L的探針R溶液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 探針離子選擇性的研究

取15支潔凈的5 mL離心管，用移液槍移取配制好的探針R溶液250 μL、乙腈水溶液[V(水)∶V(乙腈)=1∶4] 2.7 mL于每支離心管中。取1支離心管加入50 μL超純水作為空白參比，剩下14支離心管中各自加入50 μL不同的金屬離子溶液，搖勻靜置，待反應一段時間后，觀察變化。依次測量紫外吸收和熒光發(fā)射，記錄好數(shù)據(jù)[23]。

1.2.4 探針離子干擾性的研究

經(jīng)實驗1.2.3后發(fā)現(xiàn)，加入Fe3+后探針溶液有明顯的變化。因此在實驗1.2.3的基礎上，往14支含有不同金屬離子的離心管中，分別加入50 μL Fe3+溶液，搖勻靜置，反應一段時間，觀察實驗現(xiàn)象，并依次測量紫外吸收和熒光發(fā)射，記錄好數(shù)據(jù)[24]。

1.2.5 探針靈敏度的研究

用移液槍分別移取300 μL的探針溶液于16支離心管中，然后以10 μL為梯度依次加入0～150 μL的Fe3+溶液，同樣以10 μL的梯度在上述離心管中加入2.7～2.55 mL的乙腈水溶液，保證每支離心管中溶液總體積為3 mL，搖勻靜置待反應充分后，依次測量紫外吸收和熒光發(fā)射，記錄數(shù)據(jù)。并用空白樣測出標準差σ，從而計算Fe3+的檢出限。

1.2.6 探針與鐵離子反應機理的研究

在1.2.3實驗中加入Fe3+溶液的離心管中加入過量的EDTA溶液，靜置一段時間觀察溶液顏色的變化，然后測量混合溶液在最強吸收峰582 nm處的吸光度，在最大熒光發(fā)射波長610 nm處的熒光強度。然后用移液槍分別移取2.7 mL的乙腈水溶液加入11支離心管中。并以30 μL為梯度交錯加入探針R溶液和Fe3+溶液，即Fe3+溶液體積從0 μL到300 μL變化，探針R溶液對應從300 μL到0 μL的體積變化。反應一段時間后，分別測量最大吸收峰582 nm處的吸光度和最大熒光發(fā)射波長610 nm處的熒光強度變化[26]。

1.2.7 探針細胞成像的研究

在6孔板上進行HeLa細胞的培養(yǎng)，用加有10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2氛圍培養(yǎng)24 h，待細胞密度達到50%～60%后，用5 μmol/L探針R溶液進行孵育，5 h后取出用PBS溶液進行洗滌，再與10 μmol/L Fe3+溶液繼續(xù)孵育2 h，取出后用PBS溶液洗滌，在倒置熒光顯微鏡下進行觀察[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 探針的離子選擇性

圖2顯示探針R溶液在不同金屬離子加入后出現(xiàn)了顏色和熒光的變化。其中加入Fe3+的溶液顯示出明顯的玫紅色，其他溶液無肉眼可見的變化。加入Fe3+的溶液在365 nm的紫外燈光照射下，呈現(xiàn)明亮的粉紅色熒光，Al3+、Pb2+、Cr3+有極微弱的粉色熒光，其他金屬離子的溶液無明顯熒光。

A-可見光照射；B-365 nm紫外光照射圖2 加入不同金屬離子的R溶液Fig.2 R solutions after adding different metal ions

通過紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜(圖3)可知，加入Fe3+的探針溶液相對其他金屬離子有明顯的紫外吸收峰和熒光發(fā)射峰，最大紫外吸收峰為582 nm，最強熒光發(fā)射峰為610 nm，說明探針R對Fe3+具有明顯的選擇性。

A-紫外可見吸收光譜；B-熒光發(fā)射光譜圖3 不同金屬離子存在下R溶液的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜Fig.3 UV-Vis spectra and the fluorescence spectra of R under different metal ions

2.2 探針的離子干擾性

為進一步證明探針R對Fe3+的高選擇性，在2.1離子選擇性實驗中除Fe3+外的14根含其他離子的離心管中加入相同量的Fe3+溶液，靜置反應后均呈現(xiàn)出與Fe3+相同的實驗現(xiàn)象。由圖4可知，各混合體系的吸光度和熒光強度基本一致，說明探針R對Fe3+的響應不受其他金屬離子的影響，具有良好的抗干擾性。

A-可見吸收光譜；B-熒光發(fā)射光譜圖4 紫外可見吸收的靈敏度Fig.4 Sensitivity of UV-Vis spectra

2.3 探針的靈敏度

從圖5-A可以看出，隨著Fe3+濃度的升高，582 nm 處的吸光度值也在不斷的增大，取不同濃度對應的最大吸光度，繪制紫外吸收峰值，如圖5-B所示，當Fe3+濃度在40～110 μmol/L時，具有良好的線性關系，對此區(qū)間進行線性擬合得回歸方程：Y=0.019 5X-0.688 86，R2值為0.999 37。

A-不同F(xiàn)e3+濃度下R溶液的可見吸收光譜；B- R在582 nm處吸光度的線性擬合圖5 R熒光發(fā)射的靈敏度Fig.5 Sensitivity of fluorescence spectra

由圖6-A可知，當Fe3+濃度升高，610 nm處的熒光發(fā)射強度也在逐漸增強，取不同濃度對應的最大熒光強度，繪制熒光發(fā)射峰值(圖6-B)，同樣在 40～110 μmol/L，具有良好的線性關系，對此區(qū)間進行線性擬合得回歸方程：Y=6.433 02X-201.146 43，R2值為0.996 30。

Fe3+檢出限計算如公式(1)所示：

(1)

式中：σ為空白樣的標準差，k為回歸方程的斜率。結(jié)果表明，該體系中探針對Fe3+的紫外檢出限為49.2 nmol/L，熒光檢出限為135.7 nmol/L，遠低于GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》中含量(0.3 mg/L)，說明R能有效的進行食品安全等領域中Fe3+含量的檢測。

2.4 探針與鐵離子反應機理

探針R與Fe3+溶液混合發(fā)生反應后，出現(xiàn)顏色變化，且有熒光響應，如圖7所示，在582 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，而繼續(xù)加入EDTA后，靜置一段時間，混合液顏色褪去，同時熒光猝滅，582 nm處吸收峰強度明顯減弱，且該過程可逆，由此可以推斷反應機理是與羅丹明母體結(jié)構(gòu)中環(huán)內(nèi)酰亞胺的開閉環(huán)有關。探針R處于螺環(huán)狀時，溶液為淡黃色，加入Fe3+后發(fā)生絡合配位，出現(xiàn)顏色反應及熒光響應。由于EDTA與金屬離子的結(jié)合能力很強，所以當加入EDTA溶液后Fe3+被絡合，探針溶液又恢復初始的狀態(tài)。

A-可見吸收光譜；B-熒光發(fā)射光譜圖6 絡合反應的紫外可見吸收光譜Fig.6 UV- Vis spectra of complexation reaction

圖7 Fe3+以及含EDTA的Fe3+存在下R溶液的紫外可見吸收光譜Fig.7 UV-Vis spectra of R after adding Fe3+ with and without EDTA

利用等摩爾連續(xù)變化法實驗來確定金屬離子與探針的絡合比例關系。如圖8所示,當Fe3+的摩爾分數(shù)約0.33時，在582 nm處出現(xiàn)最大紫外可見光吸收峰，同時在610 nm處熒光發(fā)射峰出現(xiàn)最大值，因此不論紫外可見吸收光譜還是熒光發(fā)射光譜均表明，探針與Fe3+是以2∶1的絡合比結(jié)合，則可推測出該反應可能的反應機理如圖9所示。

A-紫外吸收；B-熒光發(fā)射圖8 R與Fe3+作用絡合比例Fig.8 Combination ratio of R and Fe3+

圖9 R與Fe3+的反應機理Fig.9 Reaction mechanism of R and Fe3+

2.5 探針的細胞成像

利用熒光成像技術研究了探針R在細胞內(nèi)的檢測能力。如圖10所示，當探針R與Fe3+溶液依次加入到細胞中進行孵育后，可以觀察到明顯的紅色熒光，說明探針R可以順利被HeLa細胞吸收，同時能與Fe3+在細胞內(nèi)進行反應，產(chǎn)生具有熒光信號的配合物R-Fe3+。

A-用R孵育的Hela細胞的相位對比圖像；B-用R孵育的Hela細胞的熒光顯微圖像；C-A-B重疊圖像;D-用R+Fe3+孵育的Hela細胞的相位對比圖像；E-用R+Fe3+孵育的Hela細胞的熒光顯微圖像；F-D-E重疊圖像圖10 R的細胞熒光成像Fig.10 Cell fluorescence imaging of R

3 結(jié)論

本實驗以羅丹明101、乙二胺和8-羥基久洛尼定為原料，合成了探針R。探針性能實驗表明，不論紫外吸收還是熒光發(fā)射，R對Fe3+均能有很好的響應，且有較強的抗干擾能力，其紫外可見光譜的檢測限為49.2 nmol/L，熒光光譜的檢測限為135.7 nmol/L，是一種能有效識別Fe3+的可視化熒光探針。EDTA實驗證明R對Fe3+的響應是通過絡合原理進行的，等摩爾連續(xù)變化法實驗確定了R與Fe3+的絡合比為2∶1。遠低于生活飲用水衛(wèi)生標準的響應度及活細胞成像，表明該探針在檢測食品、環(huán)境、生物等領域中Fe3+含量具有潛在的應用前景。