不同食品乳化劑不穩(wěn)定性現(xiàn)象及發(fā)生機理探究

黃培文，陳林

(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州，510006)

食品級乳化劑可分為天然大分子乳化劑和小分子表面活性劑，天然大分子乳化劑主要有大豆分離蛋白、阿拉伯膠、酪蛋白酸鈉等，小分子表面活性劑主要有蔗糖酯、司盤、吐溫等[1]。目前，食品工業(yè)比較常用乳化劑有酪蛋白酸鈉、蔗糖酯。酪蛋白酸鈉(sodium caseinate, SC)是一種具有特定親水基團和疏水基團的線性蛋白[2]，具有良好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性[3]，但是由于我國奶源緊缺以及復(fù)雜的加工工藝，造成SC價格昂貴，在食品工業(yè)中很難得到廣泛的應(yīng)用。蔗糖脂肪酸酯(sugar esters, SE)是一種小分子表面活性劑，是由脂肪酸和蔗糖經(jīng)過酯化反應(yīng)化學(xué)合成的食品添加劑[4],由于親水性的蔗糖基團和親脂性的脂肪酸基團，其擁有良好的乳化性，并且具有無毒和不過敏的潛力，被人們廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域[5]。與之相比，大豆分離蛋白(soybean protein isolate, SPI)是通過在低溫條件下將豆粕中的油脂、水溶性非蛋白質(zhì)成分除去后的大豆蛋白[6]，是一種價格低廉、資源豐富、品質(zhì)優(yōu)良[7]的天然乳化劑，因其具有良好的乳化和凝膠性能[8]，受到了人們越來越多的關(guān)注。

目前，食品安全問題和食品加工技術(shù)的不斷發(fā)展，食品產(chǎn)業(yè)傾向于采用天然的乳化劑來代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)合成、成本較高的一些常用乳化劑。由于SPI具有良好的價格優(yōu)勢和潛在的乳化性能，近幾年來一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。KEERATI-U-RAI等[9]研究了大豆分離蛋白穩(wěn)定水包油乳液在75、95 ℃兩種不同溫度下加熱前后的理化性質(zhì)，結(jié)果表明加熱會引起液滴的聚集，導(dǎo)致乳液粒徑和體積黏度的增加。HUANG等[10]研究了超聲波和酸對大豆分離蛋白聚集性、結(jié)構(gòu)和乳化性能的影響，發(fā)現(xiàn)超聲和酸的協(xié)同作用可以顯著提高大豆分離蛋白的乳化性能。肖連冬等[11]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白濃度、pH、加熱溫度、NaCl濃度等因素與大豆分離蛋白的乳化性和起泡性有著密切關(guān)系。對于SPI與其他常用食品乳化劑乳化能力的差異以及在不同條件下發(fā)生不穩(wěn)定現(xiàn)象的機理差異等研究較少。鑒于此，本文在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，通過試驗確定了3種不同乳化劑(SPI、SC、SE)制備出穩(wěn)定乳液的最低質(zhì)量濃度，并在最低質(zhì)量濃度下研究了外界環(huán)境因素對其乳析、粒徑、微觀結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律，以評估SPI、SC、SE 3種食品乳化劑的乳化性能的差異，有助于對食品工業(yè)中乳化劑的選擇提供較全面的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葵花籽油，江西青龍高科油脂有限公司；SPI，山東禹王集團；SC，恒天然乳品有限公司；SE(S1170)，日本三菱；尼羅藍、尼羅紅(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，2-丙二醇(分析純)，源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FS-2可調(diào)高速勻漿機，常州國華電器有限公司；HJ-6A多頭磁力攪拌器、DF-101S集熱式磁力攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠；超高壓納米均質(zhì)機AH-NANO，ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海博泰實驗設(shè)備有限公司；FA2204B電子天平，上海天美天平儀器有限公司；Mastersizer3000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；

1.3 實驗方法

1.3.1 乳狀液的制備

將SPI以1.0～50 g/L、SC以5.0～25 g/L、SE以0.1～5.0 g/L的濃度分散于去離子水中，然后于室溫下攪拌2 h使其充分水合。乳化劑溶液中加入10%(體積分數(shù))的葵花籽油，用高速勻漿機10 000 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌2 min，得到預(yù)乳液。預(yù)乳液在ATS高壓均質(zhì)機30 MPa條件下均質(zhì)3次，得到乳液樣品，用于進一步分析，篩選出穩(wěn)定乳液的最低濃度。

1.3.2 環(huán)境壓力對乳狀液穩(wěn)定性的影響

1.3.2.1 NaCl的添加對乳狀液穩(wěn)定性的影響

準確稱取一定質(zhì)量的NaCl分別添加至3種穩(wěn)定乳液樣品中，于室溫下攪拌2 h使其充分溶解，以獲得最終乳液樣品濃度為0～0.3 mol/L的NaCl。然后將乳液樣品(25 g)分別轉(zhuǎn)移到玻璃試管(內(nèi)徑22 mm，高度100 mm)中，并在分析前在室溫下儲存24 h。

1.3.2.2 熱處理對乳狀液穩(wěn)定性的影響

將3種穩(wěn)定乳液樣品(25 g)轉(zhuǎn)移到玻璃試管(內(nèi)徑22 mm，高度100 mm)中，在70～100 ℃的水浴中加熱20 min。對乳液樣品121 ℃加熱則是通過裝有乳液樣品的玻璃試管在高壓滅菌鍋中加熱20 min。在分析之前，將乳液樣品在室溫下儲存24 h。

1.3.3 乳狀液粒徑測定

用Mastersizer3000激光粒度儀測定乳狀液中液滴的粒徑d4,3。參照劉麗婭等[12]分析方法，參數(shù)設(shè)置為：分析模式-通用；進樣器名稱：Hydro LV；折射率：1.472；顆粒吸收率：0.001；分散劑：水；分散劑折射率：1.330；轉(zhuǎn)速：3 000 r/min。本文主要采用d4,3即體積加權(quán)平均直徑來表征液滴的平均粒徑大小。每個樣品重復(fù)測量3次，結(jié)果取平均值。粒徑d4,3的大小從一定程度上反映乳狀液的穩(wěn)定性，粒徑d4,3越小，表明乳狀液越穩(wěn)定。

1.3.4 乳析測定

參考劉麗婭等[12]的方法。取25 mL新鮮制備的乳液樣品置于乳析管中，通過添加0.01%(質(zhì)量分數(shù))疊氮鈉抑制微生物生長，將乳液樣品儲存在4 ℃環(huán)境下，定期對樣品進行觀察，拍照記錄乳液樣品分層的情況。

1.3.5 顯微結(jié)構(gòu)

乳狀液樣品的微觀結(jié)構(gòu)采用LSM800激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察。將制備好的乳狀液樣品，用去離子水稀釋5倍，然后用尼羅紅和尼羅藍對蛋白質(zhì)和油滴進行染色。尼羅紅用于乳液中油相的染色，當(dāng)油相被染色后，在顯微照片中呈現(xiàn)出綠色；尼羅藍用于乳液中蛋白質(zhì)染色，當(dāng)?shù)鞍妆蝗旧?，在顯微照片中呈現(xiàn)出紅色。將1 mL等分試樣放在有凹槽的載玻片上，蓋上蓋玻片，以防止液滴流動，倒置，分別使用2個激光激發(fā)源(488、633 nm)和兩個接收通道對尼羅藍和尼羅紅進行分析[13]。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

為保證實驗數(shù)據(jù)的準備性，每組實驗都進行3次平行，并將實驗數(shù)據(jù)進行誤差分析。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳化劑質(zhì)量濃度對不同乳液初始平均粒徑和穩(wěn)定性的影響

本試驗測定了SPI、SC和SE在相同的均質(zhì)乳化條件下制備的乳狀液平均粒徑d4,3隨質(zhì)量濃度增加的變化，以評估分析這3種常用食品乳化劑乳化性能的差異。如圖1所示，隨著乳化劑質(zhì)量濃度的增加，SPI、SC和SE所制備乳狀液的平均粒徑d4,3逐漸減??；在分別達到一定細度后，d4,3不再隨質(zhì)量濃度的增加而有顯著變化，說明濃度對這3種乳化劑的乳化能力都有顯著影響。本試驗發(fā)現(xiàn)SPI、SC和SE所制備的乳液達到最小細度的最低質(zhì)量濃度分別為20、12、2.0 g/L，此時對應(yīng)的平均粒徑d4,3分別為(0.724±0.238)、(0.451±0.003)、(0.541±0.003) μm。通過CLSM觀察分析發(fā)現(xiàn)(圖2-a1、圖2-b1、圖2-c1)，在上述濃度下所制備的乳液中液滴粒徑細小且分布均勻，說明乳化形成的液滴已基本都被穩(wěn)定了。乳化劑的乳化能力取決于其在乳化過程中形成和穩(wěn)定細小液滴的能力[14]，因此在本試驗中3種乳化劑的乳化能力大小為：SE>SC>SPI。這一發(fā)現(xiàn)與文獻報道一致[15-16]。這些結(jié)果表明，與蛋白類乳化劑相比，小分子表面活性劑能夠在較低的濃度下制備出粒徑細小并且穩(wěn)定的乳狀液。這是因為小分子表面活性劑的吉布斯-馬蘭戈尼效應(yīng)[17]，即液滴的表面張力隨溶液中表面活性劑濃度的增加而降低(吉布斯彈性收縮)，以及界面中的表面活性分子會自動向表面張力高的位置移動(馬蘭戈尼效應(yīng))，在這種表面張力梯度的引發(fā)下，只需少量的SE即可制備出粒徑細小且穩(wěn)定的乳液。另外，SPI的乳化能力弱于SC是因為SC是線性蛋白，能夠暴露出更多的疏水基團[18]，乳化過程中可快速吸附到油水界面，而SPI主要含有β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白[19]，乳化過程中球蛋白無法迅速展開，充分覆蓋在油滴表面，因此制備出穩(wěn)定乳液所需SPI的量高于SC。

另外，SPI、SC和SE在低濃度下所制備的乳液平均粒徑都很大，但是乳液發(fā)生不穩(wěn)定現(xiàn)象的機理卻不時一樣。如圖2-a2所示，SPI乳液質(zhì)量濃度為1.0 g/L，與SPI穩(wěn)定乳液(20 g/L)相比，其粒徑分布圖發(fā)生了右移，并且觀察到液滴之間發(fā)生橋聯(lián)絮凝(圖2-a3)，而當(dāng)SC、SE質(zhì)量濃度分別為1.0、0.1 g/L時制備的乳液，通過CLSM觀察到乳液滴只發(fā)生了聚結(jié)(圖2-b3、圖2-c3)，而不存在絮凝的現(xiàn)象。這可能是因為SPI不足以包裹油滴，導(dǎo)致乳液滴的粒徑增大；并且球狀蛋白在油水界面上吸附和緩慢展開時相互交聯(lián)在一起，加上商品化SPI中含有不溶性蛋白顆粒，使蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互交聯(lián)，從而導(dǎo)致SPI乳液發(fā)生橋聯(lián)絮凝，而分子柔性較高的線性蛋白SC和小分子表面活性劑因其疏水基團能夠充分的吸附在油滴界面，當(dāng)乳化劑不足以包裹油滴時，乳液滴發(fā)生聚結(jié)。

圖1 不同乳化劑質(zhì)量濃度對乳液粒徑的影響Fig.1 Effect of different emulsifier concentration on the particle size of emulsion

a1～3分別為SPI 20 g/L油相、1.0 g/L油相、1.0 g/L水相；b1～3 分別為SC 12 g/L油相、1.0 g/L油相、1.0 g/L水相；c1～3分別為SE 2.0 g/L油相、0.1 g/L油相、0.1 g/L水相圖2 濃度對乳液粒徑分布、顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of concentration on the particle size distribution and microstructure of emulsion

2.2 NaCl對不同乳液穩(wěn)定性的影響

本試驗研究了NaCl的添加對SPI乳液(SPI=20 g/L)、SC乳液(SC=12 g/L)和SE乳液(SE=2.0 g/L)平均粒徑、乳析穩(wěn)定性和微觀結(jié)構(gòu)的影響。如圖3所示，隨著NaCl濃度的升高，SPI乳液的粒徑d4,3從0.678 μm增大至1.140 μm。而SC、SE穩(wěn)定乳液粒徑d4,3隨NaCl濃度的增加不發(fā)生顯著變化。然而在添加NaCl后，這3種乳化劑制備的穩(wěn)定乳液在貯藏過程中都發(fā)生了明顯的乳析現(xiàn)象。通過CLSM進一步觀察發(fā)現(xiàn)，在添加NaCl后，SPI乳液、SC乳液和SE乳液都發(fā)生了不同程度的乳液滴絮凝，這可能是因為乳液滴之間的靜電排斥作用對這3種乳液的穩(wěn)定性都有非常重要的影響，而NaCl的添加使乳化劑發(fā)生了靜電屏蔽作用，降低了乳液滴之間的靜電排斥力[20]，乳液滴因此發(fā)生聚集，并在靜置貯藏過程中出現(xiàn)乳析現(xiàn)象。在添加NaCl后，SC乳液和SE乳液發(fā)生了明顯的乳析現(xiàn)象，但是通過激光粒度分析儀所測定的乳液平均粒徑d4,3卻沒有出現(xiàn)顯著(P>0.05)變化，這一結(jié)果與文獻報道一致[21]，因為NaCl的靜電屏蔽作用只能使SC和SE乳液發(fā)生比較弱的乳液滴絮凝，這種絮凝體在激光粒度分析儀測定分析時會被樣品分散系統(tǒng)攪散，因此無法測定出絮凝體的真實大小。另一方面，值得注意的是在添加NaCl后，SPI乳液在靜置貯藏過程中發(fā)生了乳析現(xiàn)象，而且平均粒徑d4,3顯著增大，這很可能是因為SPI是大分子球蛋白，在吸附到乳液滴表面后會緩慢展開并發(fā)生構(gòu)象變化，原本位于球蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水基團暴露出來，但由于大分子蛋白的空間位阻，這些暴露的疏水基團無法吸附到油滴表面；當(dāng)乳液滴由于靜電屏蔽作用發(fā)生絮凝，乳液滴之間相互接觸，此時界面膜上暴露的蛋白疏水基團會由于疏水相互作用而緊密結(jié)合在一起，不會被激光粒度分析儀的樣品分散系統(tǒng)攪散。

圖3 NaCl濃度對乳液粒徑d4,3的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on emulsion particle size d4,3

a～c1～2分別是SPI、SC、SE乳液的乳析現(xiàn)象、CLSM圖圖4 NaCl濃度對乳析和顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on emulsion precipitation and microstructure

2.3 高溫加熱對不同乳液穩(wěn)定性的影響

本試驗研究了熱處理對SPI乳液(SPI=20 g/L)、SC乳液(SC=12 g/L)和SE乳液(SE=2.0 g/L)平均粒徑、微觀結(jié)構(gòu)的影響。隨著加熱溫度的升高，SPI乳液的粒徑d4,3從1.14 μm增大至2.86 μm。而SC、SE穩(wěn)定乳液粒徑d4,3隨溫度的增加不發(fā)生顯著變化(P>0.05)。90 ℃水浴加熱后的3種乳液通過CLSM觀察發(fā)現(xiàn)，SPI乳液發(fā)生了絮凝(圖6-a1)，并且粒徑分布圖出現(xiàn)明顯的“拖尾”現(xiàn)象，這是因為熱處理導(dǎo)致β-伴大豆球蛋白的解離，以及大豆球蛋白的有限變性[9]，變性后的SPI多肽鏈打開，有更多的疏水基團和親水基團暴露出來，乳液滴之間發(fā)生絮凝，導(dǎo)致粒徑d4,3增大。而SC、SE乳液滴則均勻分布(圖6-b1、圖6-c1)，表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性，這一發(fā)現(xiàn)與文獻報道一致[22-23]。

進一步研究了添加0.15 mol/L NaCl條件下，熱處理對3種穩(wěn)定乳液粒徑、微觀結(jié)構(gòu)的影響，以評估經(jīng)過靜電屏蔽作用后，3種乳液的熱穩(wěn)定性差異。如圖5所示，SPI乳液粒徑d4,3從1.14 μm增大至2.17 μm，SC乳液、SE乳液的粒徑d4,3均沒有顯著變化(P>0.05)。在鹽離子存在下，通過CLSM觀察到，與未加熱的乳液對比，90 ℃水浴加熱導(dǎo)致3種乳液絮凝加劇(圖6-a3、圖6-b3、圖6-c3)。這是因為乳液滴靜電屏蔽作用后，加熱引起SPI原有的四級結(jié)構(gòu)被破壞，并導(dǎo)致亞基的解離，多肽鏈之間的相互作用，導(dǎo)致乳液絮凝的程度增大；另外，SPI、SC這些蛋白類乳化劑在油水界面會形成具有黏彈性的界面膜[24]，所以乳液滴不容易破裂而發(fā)生聚結(jié)，而SE乳液是因為小分子表面活性劑在乳化過程中產(chǎn)生馬蘭戈尼效應(yīng)，并且其空間位阻小[20]，加熱使液滴間的布朗運動速度加快，在加熱過程中液滴之間相互碰撞加劇而加速絮凝。

圖5 一定離子強度下溫度對乳狀液粒徑d4,3的影響Fig.5 Effect of temperature on particle size d4,3of emulsion under certain ionic strength

圖6 溫度、NaCl對乳狀液顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of temperature and NaCl on microstructure of emulsion

3 結(jié)論

本文研究SPI和2種常用乳化劑(SC、SE)制備的乳液在不同濃度、離子強度、溫度條件下對粒徑、乳析、微觀結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：

(1)SPI質(zhì)量濃度為20 g/L，SC質(zhì)量濃度為12 g/L，SE質(zhì)量濃度為2.0 g/L均可以制備穩(wěn)定的乳液，說明3種乳化劑的乳化能力依次為：SE>SC>SPI；并且在低濃度下，SPI乳液主要發(fā)生橋聯(lián)絮凝，而SC、SE乳液則以聚結(jié)為主。

(2)由于受到靜電屏蔽作用，3種穩(wěn)定乳液在不同濃度的NaCl存在下，都發(fā)生了乳析；并且NaCl對液滴的靜電屏蔽作用只能使SC和SE乳液發(fā)生比較弱的乳液滴絮凝，這種絮凝體無法通過激光粒度分析儀測定出真實大小，需要結(jié)合乳析和微觀結(jié)構(gòu)進行觀察分析；而SPI的球蛋白會在液滴表面緩慢展開并發(fā)生構(gòu)象變化，使蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間交聯(lián)在一起，導(dǎo)致絮凝體更大，不會被激光粒度分析儀的樣品分散系統(tǒng)攪散。

(3)90 ℃水浴加熱使SPI構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致多肽鏈相互交聯(lián)在一起，導(dǎo)致SPI乳液發(fā)生了絮凝，而SC、SE乳液熱穩(wěn)定性較好。SPI乳液靜電屏蔽作用后，90 ℃水浴加熱會導(dǎo)致SPI構(gòu)象變化并且球蛋白在油水界面緩慢展開，使更多的疏水基團暴露并發(fā)生疏水相互作用，導(dǎo)致絮凝加劇，表明SPI乳液在環(huán)境壓力下對抗聚結(jié)的穩(wěn)定性好。