脫脂牛乳體系中美拉德反應產(chǎn)物對乳酸菌的增殖作用

李義恒，吳世芳，楊曉麗，朱妍麗，王瑩，郭兆斌，張衛(wèi)兵*，文鵬程*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅 蘭州，730010)

人體腸道菌群失調(diào)可能引起炎癥性腸病、結(jié)直腸癌等代謝疾病[1]。大量臨床試驗表明，攝入益生菌和益生元具有預防和治療多種人體常見病癥的功能[2]。然而，益生菌進入腸道發(fā)揮益生作用需要克服胃酸、膽鹽及各種胃腸道消化酶，同時應具備高存活率和強定植力的特性[3]。相較而言，益生元是一種不可消化的化合物，通過腸道微生物的代謝，調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和/或活性，從而對宿主產(chǎn)生有益的生理影響[4]。因此，益生元的開發(fā)和應用更具普適性。

目前被證實的益生元物質(zhì)的主要成分是不可消化的碳水化合物，例如功能性低聚糖、多糖類和天然植物提取物。SARIKAYA等[5]研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物懸浮液可以發(fā)酵利用菊粉并促進乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長；SZOTYSIK等[6]研究表明密刺薔薇提取物干粉能提高酸奶中益生菌含量。這些糖類能被益生菌特異表達的轉(zhuǎn)運體或酶結(jié)合、攝取或利用，因此能選擇性地促進益生菌的生長。然而，現(xiàn)有的益生元物質(zhì)大都不含蛋白質(zhì)來源。研究表明，蛋白質(zhì)及某些氨基酸是腸道菌群重要的氮源和生長因子，因為攝入的蛋白質(zhì)大多數(shù)被小腸吸收，導致結(jié)腸中氨基酸缺乏，從而限制益生菌的增殖[7]。2019年，SEIFERT等[8]基于化療的主動靶向性首次提出蛋白質(zhì)-寡糖美拉德反應產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)作為蛋白源益生元物質(zhì)的構(gòu)想并證明乳鐵蛋白和低聚半乳糖MRPs干粉對干酪乳桿菌具有促生長作用。因此，通過美拉德反應(Maillard reaction，MR)開發(fā)蛋白源益生元物質(zhì)是益生元研究的新方向。研究表明，乳蛋白及其多肽能顯著促進雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長，乳蛋白的降解能產(chǎn)生益生菌生長必需的氨基酸，如亮氨酸、半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸等[9]。蛋白質(zhì)被MR修飾后在胃腸中的消化性顯著降低，大部分MRPs不能被前端消化系統(tǒng)吸收而僅能被結(jié)腸微生物降解利用[10]。MR程度受還原糖濃度、溫度和時間等因素的影響。同時，在熱處理過程中乳脂肪發(fā)生脂肪氧化或分解，可能會對MR程度造成一定的影響。如果MR控制不當，5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)等危害物過量生成，MRPs會引起強烈致癌的潛在食品安全風險[11]。本研究以脫脂牛乳為原料，系統(tǒng)優(yōu)化了脫脂牛乳體系中美拉德反應產(chǎn)物(skim milk system-MRPs，SMS-MRPs)制備條件，獲得SMS-MRPs凍干粉，分析5-HMF的含量，研究其濃度對4株測試乳酸菌的生長曲線、活菌數(shù)、菌體干重和產(chǎn)酸能力的影響，系統(tǒng)分析SMS-MRPs對4株測試菌的促生效果。以期為SMS-MRPs與腸道菌群體內(nèi)試驗的開展奠定理論基礎，為評估其益生潛力提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副干酪乳桿菌L9(LactobacillusparacaseiL9)、鼠李糖乳桿菌G5(LactobacillusrhamnosusG5)、羅伊氏乳桿菌G8(LactobacillusroyiG8)、嗜熱鏈球菌Q2(StreptococcusthermophilusQ2)由甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院分離鑒定并保存；鮮牛奶，甘肅農(nóng)業(yè)大學牛奶廠；市售褐色酸乳，當?shù)爻匈徺I；MRS培養(yǎng)基、GM17培養(yǎng)基，按實驗室配方配制；無菌培養(yǎng)皿、96孔板，常德比克曼生物科技有限公司；5-HMF標準品，上海麥克林生化科技有限公司；D(+)-無水葡萄糖(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MCCWV1型乳成分分析儀，杭州麥力斯科技有限公司；SPectramax M2型酶標儀，美國美谷分子儀器有限公司；Ultimate 3000 高效液相色譜儀，美國Thermo Scientific公司；SCIENTZ-10 ND型真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-29型高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脫脂牛乳制備

新鮮生牛乳(蛋白質(zhì)3.02%；乳糖4.55%；脂肪3.63%)(質(zhì)量分數(shù))通過4層紗布過濾除雜，然后分裝調(diào)平離心處理(5 000 r/min，4 ℃，20 min)，紗布過濾截留上層脂肪凝塊，收集下層脫脂乳(蛋白質(zhì)3.22%；乳糖4.78%；脂肪0.00%)(質(zhì)量分數(shù))，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 中間產(chǎn)物和褐變程度的測定

參考JIANG等[12]的方法完成。用蒸餾水將20 μL反應液稀釋360倍，在294 nm處測定紫外吸光值，代表中間產(chǎn)物含量；移取200 μL反應液，用蒸餾水稀釋36倍，在420 nm處測定吸光值，代表褐變程度。

1.3.3 單因素對脫脂牛乳MR程度的影響

用1 mol/L NaOH溶液調(diào)脫脂牛乳pH至9.0[13](預實驗得出此堿性環(huán)境下MR程度最優(yōu))。在反應溫度90 ℃，反應時間120 min下，考察葡萄糖質(zhì)量濃度(0、15.0、30.0、60.0、90.0 g/L)對MR程度的影響；在葡萄糖質(zhì)量濃度30.0 g/L，反應時間120 min下，考察反應溫度(80、85、90、95、100 ℃)對MR程度的影響；在葡萄糖質(zhì)量濃度30.0 g/L，反應溫度90 ℃下，考察反應時間(60、90、120、150、180 min)對MR程度的影響。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，應用Box-Behnken Design設計三因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，因素與水平的具體參數(shù)見表1。

表1 響因面優(yōu)化試驗因素水平編碼表Table 1 Codes levels and corresponding actual levels of independent variables used for response surface analysis

1.3.5 SMS-MRPs干粉制備

優(yōu)化工藝下制備脫脂牛乳反應液，待冰水冷卻后反應液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(50 ℃，45 r/min)至原體積的1/4，真空冷凍干燥處理24 h得SMS-MRPs凍干粉，密封后放入干燥器內(nèi)備用。

1.3.6 5-HFM含量的測定

參照 NY/T 1332—2007 《乳與乳制品中 5-羥甲基糠醛含量的測定 高效液相色譜法》完成生牛乳、SMS-MRPs干粉及市售褐色酸乳中5-HMF含量的測定。

1.3.7 菌種活化

移取10 mL液體培養(yǎng)基至具塞試管，密封后放入滅菌鍋滅菌(0.1 MPa，121 ℃，20 min)。待冷卻至室溫，在超凈工作臺中將200 μL脫脂乳甘油保存的菌液接入試管并密封，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h或16 h，重復上述步驟將菌液活化3代后使用。副干酪乳桿菌L9、鼠李糖乳桿菌G5和羅伊氏乳桿菌G8采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，嗜熱鏈球菌Q2采用GM17培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.8 SMS-MRPs對乳酸菌生長的影響

參考DE A M?LLER等[14]的方法并作修改。移取20 mL液體培養(yǎng)基至具塞試管，密封后放入滅菌鍋滅菌。待冷卻后，在超凈工作臺中將SMS-MRPs凍干粉按不同添加量(0、0.5、0.9、1.8、3.7、7.5、15 g/L)加入試管并渦旋溶解。分別移取10 μL菌液和250 μL 含不同濃度SMS-MRPs的液體培養(yǎng)基至96孔板，以未添加SMS-MRPs的液體培養(yǎng)基作對照；在650 nm(200～800 nm掃描得出，此波長下各濃度SMS-MRPs溶液紫外吸收較弱)下用酶標儀測吸光值，測定間隔為2 h，測前微搖30 s，測定過程中確保無雜菌污染。

1.3.9 SMS-MRPs對活菌數(shù)的影響

參照 GB 4789.2—2016 《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》的方法。根據(jù)1.3.8選定7.5、15.0 g/L作為測試質(zhì)量濃度。移取9 mL液體培養(yǎng)基至具塞試管，密封后放入滅菌鍋滅菌。待冷卻后，在超凈工作臺中將SMS-MRPs凍干粉按7.5、15.0 g/L的添加量加入試管并渦旋溶解。移取1 mL菌液至試管混勻，以未添加SMS-MRPs的液體培養(yǎng)基作對照，密封后37 ℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長末期。取菌液梯度稀釋后，用傾注法倒平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后測算活菌數(shù)。在10-7稀釋度下，4株菌的活菌數(shù)均在適宜計數(shù)范圍。

1.3.10 SMS-MRPs對菌體干重的影響

參考XU等[15]的方法并作修改。根據(jù)1.3.8選定3.7、7.5 g/L作為測試質(zhì)量濃度。移取10 mL液體培養(yǎng)基至具塞試管，密封后放入滅菌鍋滅菌。待冷卻后，在超凈工作臺中將SMS-MRPs凍干粉按3.7、7.5 g/L的添加量加入試管并渦旋溶解。移取200 μL菌液至試管混勻，以未添加SMS-MRPs的液體培養(yǎng)基作對照，密封后恒溫振蕩培養(yǎng)(37 ℃，200 r/min)至對數(shù)生長末期，菌液離心處理(8 000 r/min，4 ℃，15 min)，棄上清液，菌體用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 8.0)重懸洗滌離心3次，冷凍干燥后稱重。

1.3.11 SMS-MRPs對菌株產(chǎn)酸能力的影響

參考張宸瑞等[16]的方法并作修改。根據(jù)1.3.8選定7.5 g/L作為測試質(zhì)量濃度。移取10 mL液體培養(yǎng)基至具塞試管，密封后放入滅菌鍋滅菌。待冷卻后，在超凈工作臺中將SMS-MRPs凍干粉按7.5 g/L的添加量加入試管并渦旋溶解。移取200 μL菌液至試管混勻，以未添加SMS-MRPs的液體培養(yǎng)基作對照，密封后恒溫振蕩培養(yǎng)(37 ℃，200 r/min)16 h，每2 h取菌液檢測酸度。

1.3.12 數(shù)據(jù)分析

上述測定至少重復3次，全部數(shù)據(jù)采用Excel 2016計算平均值和標準誤，采用SPSS 26.0完成Duncan′s顯著性分析，響應面試驗設計與分析通過Design Expert 10.0.7完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

294、420 nm處吸光值分別代表5-HMF等中間產(chǎn)物和類黑精等終產(chǎn)物的含量。由圖1-a可知，葡萄糖能顯著提高中間產(chǎn)物和類黑精的產(chǎn)量(P<0.05)，同時類黑精受葡萄糖質(zhì)量濃度的影響更明顯，呈先升高后下降的趨勢。原因是加入葡萄糖構(gòu)成了反應體系的“擁擠效應”，但濃度過高會降低反應體系的流動性[17]。葡萄糖質(zhì)量濃度為60 g/L時，中間產(chǎn)物和類黑精的產(chǎn)量均較高，故葡萄糖質(zhì)量濃度確定為60 g/L。由圖1-b可知，中間產(chǎn)物與類黑精的產(chǎn)量隨反應時間的延長整體呈顯著增加的趨勢(P<0.05)，但反應150 min時，中間產(chǎn)物降至最低點，延長至180 min，MRPs產(chǎn)量顯著增加(P<0.05)。原因是提高MR的連續(xù)性有利于中間產(chǎn)物向終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和積累。但時間過長造成能耗成本增大，故反應時間選擇120 min。如圖1-c所示，中間產(chǎn)物與類黑精的產(chǎn)量隨反應溫度的升高整體均顯著上升(P<0.05)，但反應溫度為90 ℃時，褐變程度顯著下降(P<0.05)，隨后MRPs產(chǎn)量顯著上升(P<0.05)。原因是溫度升高逐漸加劇蛋白質(zhì)向亞基或多肽解離的程度，可為葡萄糖提供更多的結(jié)合位點。反應溫度為95 ℃時，MRPs產(chǎn)量較高且平穩(wěn)上升，故反應溫度選擇95 ℃。同時，隨葡萄糖質(zhì)量濃度增大、反應時間延長和反應溫度升高，體系pH顯著下降(P<0.05)。原因是堿性環(huán)境加劇了MR，羰基消耗大量氨基，并且體系pH接近中性，使中間產(chǎn)物優(yōu)先轉(zhuǎn)化為甲酸、乙酸、羥甲基糠醛等酸性物質(zhì)[18]。該結(jié)果與倪孔巍等[13]和依勝男等[19]的研究結(jié)果類似。

2.2 MRPs制備條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應面試驗設計及回歸模型的建立

以單因素試驗結(jié)果為基礎(選取的因素水平下，中間產(chǎn)物和褐變程度整體的變化趨勢一致)，確定褐變程度作為響應值，使用Design-Expert 10.0.7軟件設計三因素三水平的響應面試驗，結(jié)果見表2。

對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到褐變程度的二次多項回歸方程為Y=0.84-0.014A-0.025B-0.031C+0.035AB-0.017AC+0.047BC-0.070A2-0.011B2-0.15C2。

a-葡萄糖質(zhì)量濃度；b-反應時間；c-反應溫度圖1 葡萄糖質(zhì)量濃度、反應時間和反應溫度對MR程度及體系pH的影響Fig.1 Effect of glucose concentration, reaction temperature， and reaction time on MR degree and system pH注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

表2 響應面優(yōu)化試驗設計及結(jié)果Table 2 Response surface optimization design and results

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression equation

2.2.2 響應面試驗設計及回歸模型的建立

響應曲面越陡表明其自變量間對響應值的影響越大。通過分析圖2可知，交互項BC的曲面弧度較陡，表明反應時間(B)和反應溫度(C)的交互作用對褐變程度的影響最顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)工藝的預測及驗證

由表4可知，通過回歸模型預測的最優(yōu)值為葡萄糖質(zhì)量濃度56.22 g/L，反應時間114.998 min，反應溫度94.774 ℃，此時褐變程度為0.848。結(jié)合實際情況，將各參數(shù)調(diào)整為葡萄糖質(zhì)量濃度60.0 g/L，反應溫度95 ℃，反應時間120 min，在此條件下重復3次試驗，得褐變吸光值為0.843，證實了該模型的可靠性。

2.3 各樣品中5-HFM含量分析

由表5可知，生牛乳、SMS-MRPs干粉及市售褐色酸乳的加標回收率分別為75.0%、98.8%、100.7%，并且這3種樣品中5-HMF含量的相對標準偏差均<5%，說明檢測結(jié)果較可靠。同時，生牛乳中的含量低于檢出限，SMS-MRPs干粉中5-HMF的含量為(8.40±0.64) mg/L，市售褐色酸乳的5-HMF含量為(10.31±0.85) mg/L。SMS-MRPs干粉中5-HMF含量低于市售褐色酸奶，同時低于兒童果汁中5-HMF強制性標準20 mg/L與建議標準5～10 mg/L[20]。因此，SMS-MRPs干粉是符合安全標準的。

a-反應時間與葡萄糖質(zhì)量濃度；b-反應溫度與葡萄糖質(zhì)量濃度；c-反應溫度與反應時間圖2 各因素交互作用對褐變程度的影響Fig.2 Effect of interaction of factors on browning degree

表4 響應面優(yōu)化結(jié)果Table 4 Response surface optimization results

表5 各樣品中5-HMF含量測定結(jié)果Table 5 Results of the determination of 5-HMF content in each sample

2.4 MRPs對乳酸菌生長趨勢的影響

由圖3-a可知，SMS-MRPs質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，對副干酪乳桿菌L9生長的促進作用不顯著(P>0.05)，而質(zhì)量濃度達到15.0 g/L時，其OD650峰值為1.206，較對照組的OD650峰值0.521顯著上升(P<0.05)。如圖3-b所示，SMS-MRPs質(zhì)量濃度為15.0 g/L時，鼠李糖乳桿菌G5在8 h進入穩(wěn)定期，此時OD650值是1.539，較對照組14 h的OD650峰值0.626顯著上升(P<0.05)。由圖3-c可知，SMS-MRPs質(zhì)量濃度為15.0 g/L時，羅伊氏乳桿菌G8在8 h進入穩(wěn)定期，其OD650值為1.589，較對照組10 h的OD650峰值0.555顯著升高(P<0.05)。如圖3-d所示，SMS-MRPs質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，嗜熱鏈球菌Q2的OD650值已整體高于對照組，當SMS-MRPs質(zhì)量濃度為15.0 g/L時，嗜熱鏈球菌Q2的OD650峰值1.534是對照組OD650峰值0.541的近3倍(P<0.05)。結(jié)果表明，SMS-MRPs的促生長作用隨濃度的增大而顯著增強，嗜熱鏈球菌Q2對SMS-MRPs的益生刺激較敏感，且SMS-MRPs加快了鼠李糖乳桿菌G5和羅伊氏乳桿菌G8的生長速度。該結(jié)果與SEIFERT等[8]發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白水解物和半乳糖寡糖制備的MRPs干粉具有良好的模擬胃腸通過率且添加到培養(yǎng)基能顯著促進干酪乳桿菌的生長，其生長速度是單獨添加乳鐵蛋白水解物或半乳糖寡糖生長速度的2倍的研究結(jié)果相似。

2.5 活菌數(shù)的分析

由表6可知，SMS-MRPs質(zhì)量濃度為15.0 g/L時，副干酪乳桿菌L9的活菌數(shù)(1.076×109CFU/mL)較對照組的活菌數(shù)(4.53×108CFU/mL)增加1個數(shù)量級(P<0.05)，7.5 g/L的SMS-MRPs添加量對副干酪乳桿菌L9生長的促進作用不顯著(P>0.05)。鼠李糖乳桿菌G5的SMS-MRPs處理組的活菌數(shù)均高于對照組，且質(zhì)量濃度為15.0 g/L的活菌數(shù)(1.240×109CFU/mL)比對照組的活菌數(shù)(6.20×108CFU/mL)增加1個數(shù)量級(P<0.05)。羅伊氏乳桿菌G8的SMS-MRPs處理組的活菌數(shù)分別為9.13×108、1.313×109CFU/mL，均顯著高于對照組活菌數(shù)(4.83×108CFU/mL)(P<0.05)，且SMS-MRPs處理組間的活菌數(shù)差異顯著(P<0.05)。嗜熱鏈球菌Q2的SMS-MRPs處理組的活菌數(shù)分別為1.386×109、9.85×108CFU/mL(P<0.05)，較對照組的活菌數(shù)5.43×108CFU/mL均顯著增長(P<0.05)。結(jié)果表明，SMS-MRPs對4株乳酸菌的活菌數(shù)具有顯著的增殖作用，且SMS-MRPs的增殖效果隨濃度的增大而增強。該結(jié)果與JIMéNEZ-ZAMORA等[21]發(fā)現(xiàn)咖啡中不同分子質(zhì)量的MRPs成分均表現(xiàn)出益生元活性，其中質(zhì)量濃度為1、10 g/L的咖啡類黑精顯著增加了乳酸桿菌和雙岐桿菌活菌數(shù)的研究結(jié)果類似。

a-副干酪乳桿菌L9；b-鼠李糖乳桿菌G5；c-羅伊氏乳桿菌G8；d-嗜熱鏈球菌Q2圖3 SMS-MRPs對副干酪乳桿菌L9、鼠李糖乳桿菌G5、羅伊氏乳桿菌G8和嗜熱鏈球菌Q2生長的影響Fig.3 Effects of SMS-MRPs on the growth of Lactobacillus paracasei L9, Lactobacillus rhamnosus G5, Lactobacillus royi G8， and Streptococcus thermophilus Q2

表6 SMS-MRPs對4株乳酸菌活菌數(shù)的影響 單位：108 CFU/mL

2.6 菌體干重的分析

如圖4所示，SMS-MRPs質(zhì)量濃度為3.8、7.5 g/L時，副干酪乳桿菌L9、鼠李糖乳桿菌G5、羅伊氏乳桿菌G8和嗜熱鏈球菌Q2的菌體干重較對照組均顯著增大，副干酪乳桿菌L9的菌體干重分別增加了2.25倍(P<0.05)和1.55倍(P<0.05)，鼠李糖乳桿菌G5的菌體干重分別增加了1.53倍(P<0.05)和1.35倍(P<0.05)，羅伊氏乳桿菌G8的菌體干重分別增加了1.71倍(P<0.05)和1.43倍(P<0.05)，嗜熱鏈球菌Q2的菌體干重分別增加了3.13倍(P<0.05)和2.28倍(P<0.05)。同時，SMS-MRPs處理組之間菌體干重差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，乳酸菌可能具有降解利用SMS-MRPs作為碳源和氮源以促進其生長和代謝的能力。該結(jié)果與ZHANG等[22]發(fā)現(xiàn)大豆肽MRPs干粉具有顯著改善腸道菌群組成和代謝水平的能力，益生菌可以利用其作為發(fā)酵底物，提高產(chǎn)短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)細菌的豐度和多樣性，從而顯著增加SCFAs等菌體代謝物產(chǎn)量的結(jié)果類似。

圖4 SMS-MRPs對4株乳酸菌菌體干重的影響Fig.4 Effect of SMS-MRPs on dry weight of four lactic acid bacteria

2.7 產(chǎn)酸能力的分析

由圖5可知，副干酪乳桿菌L9、鼠李糖乳桿菌G5和羅伊氏乳桿菌G8的SMS-MRPs處理組發(fā)酵液的pH較對照組未顯著降低(P>0.05)，而嗜熱鏈球菌Q2的SMS-MRPs處理組發(fā)酵液的pH發(fā)酵6 h以后極顯著地低于對照組(P<0.01)。結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌Q2能降解SMS-MRPs產(chǎn)生酸性物質(zhì)，4株乳酸菌代謝SMS-MRPs產(chǎn)酸的能力存在差異，該結(jié)果與DELGADO-ANDRADE等[23]發(fā)現(xiàn)腸道微生物可以發(fā)酵利用MRPs及其不同分子質(zhì)量的組分來顯著提高甲酸、醋酸、丙酸和丁酸等酸性物質(zhì)代謝水平的結(jié)果相似。同時，劉欣等[24]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌生成酸性代謝產(chǎn)物的種類和含量比例，與細菌種屬遺傳穩(wěn)定性相關，并且不同乳酸菌發(fā)酵液中酸性物質(zhì)的代謝量與乳酸菌的生長能力無直接相關性。綜上，MRPs含有某些具備益生元效應的聚合物(類黑精等)，其可以被結(jié)腸微生物作為碳源和氮源，促進乳酸菌生長，調(diào)節(jié)SCFAs的產(chǎn)生方式，發(fā)揮MRPs的益生元活性，但MRPs的復雜性導致其益生元活性不穩(wěn)定[25]。所以，SMS-MRPs對腸道菌群的益生元效應還需進一步驗證，應深入研究體內(nèi)環(huán)境下SMS-MRPs與腸道菌群的量效、構(gòu)效、組效及相互作用機制。

a-副干酪乳桿菌L9；b-鼠李糖乳桿菌G5；c-羅伊氏乳桿菌G8；d-嗜熱鏈球菌Q2圖5 SMS-MRPs對副干酪乳桿菌L9、鼠李糖乳桿菌G5、羅伊氏乳桿菌G8和嗜熱鏈球菌Q2產(chǎn)酸能力的影響Fig.5 Effect of SMS-MRPs on acid production of Lactobacillus paracasei L9, Lactobacillus rhamnosus G5, Lactobacillus royi G8, and Streptococcus thermophilus Q2注：#表示同一時間不同處理組間差異顯著(P<0.05)，##表示同一時間不同處理組間差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化得出，脫脂牛乳體系中MR褐變程度的最優(yōu)工藝參數(shù)是葡萄糖質(zhì)量濃度60.0 g/L，反應時間120 min和反應溫度95 ℃，此條件下SMS-MRPs積累最多且SMS-MRPs干粉中5-HMF的含量符合安全標準。SMS-MRPs添加量為7.5 g/L時，4株菌的菌體干重均顯著大于對照組，僅嗜熱鏈球菌Q2的產(chǎn)酸能力極顯著提高。SMS-MRPs添加量為15.0 g/L時，4株菌的活菌數(shù)均顯著增加，鼠李糖乳桿菌G5和羅伊氏乳桿菌G8的生長速度顯著提升。SMS-MRPs表現(xiàn)出優(yōu)良的增菌效果，乳酸菌降解利用SMS-MRPs能不同程度地促進其生長和代謝能力。SMS-MRPs具備開發(fā)為一種蛋白源益生元物質(zhì)的潛在價值。