古生菌來源耐熱肌氨酸氧化酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

尹正安，辛瑜，時祎，顧正華，石貴陽，張梁*

1(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

肌氨酸氧化酶(sacrosine oxidase, SOX)可催化氧化肌氨酸上的N-甲基并生成甲醛、過氧化氫和甘氨酸，在多個領(lǐng)域均有應(yīng)用。醫(yī)療上可偶聯(lián)肌酐酶和肌酸酶用于人體血液或尿液中肌酐含量的測定[1]，在食品工業(yè)上則可用于檢測葡萄酒樣品中甘油及有機酸的含量[2-3]。此外，由于SOX具備去N-甲基化的能力，使其在催化降解N-甲基類化合物方面具有潛在的應(yīng)用前景。工業(yè)廢水中的N-甲基類化合物因其化學(xué)穩(wěn)定性難以有效降解，其過度積累會對人體的神經(jīng)系統(tǒng)以及肝、腎造成嚴(yán)重?fù)p傷，同時對水生生物有毒害作用。針對該類污染，國內(nèi)外常采用物化法及生物法進(jìn)行處理[4]，但在N-甲基化合物的酶法生物降解方面仍存在較大的空白。有研究已證實某些SOX除肌氨酸以外，對其他N-甲基化合物也存在降解作用。例如，來源于Bacillussp.的SOX對N-甲基-DL-丙氨酸、N-甲基-DL-纈氨酸、N-甲基-L-亮氨酸有催化作用[5]；來源于Corynebacteriumsp.U-96的SOX對N-甲基-DL-丙氨酸、N-乙基-甘氨酸有催化作用[6]；本實驗室前期通過異源表達(dá)來自ThermomicrobiumroseumDSM 5159的TrSOX，在定點突變后證實其對含N-甲基的有機氮類農(nóng)藥西維因、呋喃丹有降解作用[7]。盡管已經(jīng)證實SOX對某些N-甲基化合物有催化降解能力，但一種來源的SOX往往只能針對為數(shù)不多的幾種底物有催化效果，所以底物譜太窄仍是限制該類酶廣泛運用的一類原因。如上述提到的Corynebacteriumsp.U-96中的SOX，除已報道的底物，對其他N-甲基氨基酸類化合物均無活性[6]。

耐熱酶的熱穩(wěn)定性好，最適反應(yīng)溫度在60 ℃以上，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中具有顯著優(yōu)勢。耐熱SOX能在常溫下進(jìn)行分離、提純和包裝運輸且可長時間保持活性，對冷卻系統(tǒng)的要求降低，從而極大地降低了能耗和成本；較高的反應(yīng)溫度可提高底物與水的相容性，能夠加快動力學(xué)反應(yīng)、提升催化效率[8]；耐熱SOX的有機溶劑耐受性往往也較強[9]，這為催化降解工業(yè)廢水中的N-甲基類化合物奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)現(xiàn)有報道，關(guān)于SOX的研究主要集中在細(xì)菌來源，如棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)、假單胞菌(Pseudomonas)、鏈霉菌(Streptomyces)、芽孢桿菌(Bacillus)和節(jié)桿菌(Arthrobacter)等微生物[10-15]，但其中大多數(shù)SOX熱穩(wěn)定性并不盡如人意，最適溫度一般低于40 ℃，高于此溫度酶活力則劇烈下降(表1)。來源于ThermomicrobiumroseumDSM5159和Bacillussp. BSD-8的SOX雖然熱穩(wěn)定性較好，能在50、60 ℃以下保持穩(wěn)定，但仍存在分離純化困難、酶活力低和可溶性表達(dá)困難等諸多問題[16-17]。相較于上述來源，古生菌大多存在于極端環(huán)境中，其體內(nèi)的酶在熱穩(wěn)定性方面具有天然優(yōu)勢，同時由于祖先序列的高度保守性，對古生菌來源的酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的解析可用做同類酶改造的重要參考[18]。

因此，本研究以來源于古生菌ArchaeaHR32(SAMD00093782)中預(yù)測的SOX為切入點，首先對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，之后在B.subtilisWB600中表達(dá)，再通過熱處理和鎳柱親和層析的方法獲得純酶。在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征和酶動力學(xué)研究，本研究結(jié)果為深入解析來自古生菌的SOX提供翔實數(shù)據(jù)支撐，同時為利用SOX催化降解N-甲基類有害化合物奠定基礎(chǔ)。

表1 不同來源SOX酶學(xué)性質(zhì)比較Table 1 Enzymatic properties of SOX from different sources

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coliJM109、B.subtilisWB600和表達(dá)載體pMA5-Pxyl均由實驗室保存。

1.2 試劑、儀器和培養(yǎng)基

TaqDNA聚合酶、10 000 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker，TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、同源重組試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素，南京諾唯贊生物科技有限公司；肌氨酸、紅豆堿等其他底物，aladdin公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

S100D PCR儀，美國BIO-RAD公司；MOS-450圓二色光譜儀，法國Bio-Logic公司；酶標(biāo)儀，南京科麟得科學(xué)儀器有限公司；V-1200分光光度計，上海美普達(dá)儀器公司；Nano-DSC差示掃描微量熱儀，美國Waters公司；SCG蛋白純化系統(tǒng)，蘇州賽譜儀器有限公司。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，115 ℃ 滅菌20 min；TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉23.6，胰蛋白胨11.8，K2HPO49.4，KH2PO42.2，甘油5，115 ℃滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 目的蛋白序列的生物信息學(xué)分析

氨基酸序列比對：借助DNAMAN軟件對來源于古生菌ArchaeaHR和Baciliussp.的SOX氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。

信號肽分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測：使用SMART網(wǎng)站(http://smart.embl.de)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組件的分析。

理化性質(zhì)預(yù)測：使用ExPASy(https://www.expasy.org)的ProtParam和ProtScale工具對蛋白進(jìn)行等電點、分子質(zhì)量和疏水性等理化性質(zhì)分析。

三級結(jié)構(gòu)預(yù)測：通過ExPASy上的SWISS-MODEL平臺(https://swissmodel.expasy.org)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果通過VMD軟件進(jìn)行可視化。

1.3.2 基因工程菌的構(gòu)建

從NCBI網(wǎng)站上下載預(yù)測的SOX氨基酸序列(GenBank:GBD29370.1)，送生工生物工程(上海)公司按照枯草芽孢桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行序列優(yōu)化并添加6×His tag。設(shè)計含pMA5-Pxyl同源臂的引物P1 (5′-ACCTAAAAAGGAGCGATTTAATGCATCATCA-TCATCAT-3′)、P2 (5′-TTCGACCTCTAGAACGCGTTTAT-AAGAAACGACGAAGGCT-3′)，以合成的目的基因序列為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增，獲得sox基因片段。利用同源重組酶將sox片段與線性化質(zhì)粒pMA5-Pxyl連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-Pxyl-sox。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒雙酶切驗證及測序正確后轉(zhuǎn)化入宿主菌B.subtilisWB600中進(jìn)行表達(dá)。

1.3.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化與鑒定

將重組菌B.subtilisWB600/pMA5-Pxyl-sox和對照菌B.subtilisWB600/pMA5-Pxyl在含卡那霉素LB平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑選單菌落接種于15 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min的條件下培養(yǎng)12 h，以5%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL TB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)12 h后添加20 g/L木糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，2 h后下?lián)u床離心收集菌體。用20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)洗滌并重懸菌體后加入終質(zhì)量濃度為300 μg/mL 的溶菌酶，37 ℃孵育3 h后超聲破碎，上清液即為粗酶液。取100 mL粗酶液于70 ℃孵育30 min，除去大部分雜蛋白，離心取上清液過5 mL鎳柱，先用50 mmol/L咪唑洗去雜蛋白，再用120 mmol/L咪唑進(jìn)行洗脫，收集純化的酶液，超濾去除多余咪唑并將純酶濃縮?？捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，取粗酶液、熱處理后酶液及純化后酶液用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析?；厥?0% SDS-PAGE凝膠重組蛋白rSOX的單一條帶，用基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)進(jìn)行鑒定。

1.3.4 圓二色譜(circular dichroism, CD)分析與Nano-DSC分析

將純酶液(0.2 mg/mL)置于1 mm的比色皿中，在190～250 nm下掃描，3次測量取平均值，測定rSOX各類二級結(jié)構(gòu)的含量[20]。利用Nano-DSC測定rSOX的變性溫度(Tm)和焓變值(ΔH)，緩沖液重復(fù)測定3次以平衡基線，之后取300 μL 1.0 mg/mL的rSOX放入樣品池中測定，溫度20～100 ℃，升溫速率為1 ℃/min，實驗結(jié)果用NanoAnalyze軟件分析[9]。

1.3.5 重組SOX的酶活力測定

以肌氨酸為底物，參考文獻(xiàn)[12]方法：取10 μL酶液，加入600 μL顯色液(1 mmol/L的4-氨基安替比林、6 mmol/L的苯酚、7 000 U/L的辣根過氧化物酶、20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液、pH 8.0)，混勻后加入30 μL 0.2 mol/L肌氨酸，70 ℃反應(yīng)30 min，100 ℃加熱10 min終止反應(yīng)，于500 nm處測定吸光度。酶活力單位定義為：在70 ℃，pH 8.0的條件下，將1 min反應(yīng)生成1 μmol 過氧化氫所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.3.6 重組SOX的酶學(xué)性質(zhì)表征

1.3.6.1 最適溫度及最適pH測定

在pH 7.0，0～90 ℃(間隔10 ℃)條件下，反應(yīng)30 min測定酶活力，將測得的最高酶活力定義為100%，計算不同溫度下重組酶的相對酶活力，確定最適溫度。在70 ℃條件下，分別于pH 4.0～7.0(檸檬酸-磷酸氫二鈉)、pH 7.0～9.0(Tris-HCl)、pH 9.0～10.5(碳酸鈉-碳酸氫鈉)、pH 10.5～12.0(磷酸氫二鈉-氫氧化鈉)的緩沖液中反應(yīng)30 min測定酶活力，將測得的最高酶活力定義為100%，確定最適pH。

1.3.6.2 溫度穩(wěn)定性及 pH 穩(wěn)定性測定

將rSOX于一系列不同溫度(0～90 ℃，間隔10 ℃)下孵育12 h，在最適反應(yīng)條件下測定酶活力，將測得的最高酶活力定義為100%，探究溫度穩(wěn)定性。將游離酶置于30 ℃環(huán)境下保藏，以初始酶活力為100%，每隔2 d 測1次酶活力，探究貯藏穩(wěn)定性。在4 ℃條件下，將重組酶置于pH 4.0～12.0不同緩沖液中保存12 h后于最適反應(yīng)條件下測定酶活力，將測得的最高酶活力定義為100%，考察pH穩(wěn)定性。

1.3.6.3 金屬離子和有機溶劑對酶活力的影響

在最適條件下，向反應(yīng)體系中分別加入不同金屬離子(Al3+、K+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Mg2+、Fe3+、和Ni2+)至終濃度為0.2、0.5、1.0、3.0 mmol/L。以不添加金屬離子的酶的酶活力作為100%，測定相對酶活力。將rSOX在12種lgP不同的有機溶劑中按照體積比1∶1進(jìn)行孵育，以不加有機溶劑的酶活力作為100%，分別于2、4、6 h取樣測定酶活力。

1.3.6.4 重組酶的底物特異性研究及酶動力學(xué)參數(shù)測定

將15種底物分別配制成不同濃度的溶液，在最適條件下與重組酶反應(yīng)，測定酶活力。利用Origin軟件中的Hill方程進(jìn)行非線性曲線擬合，得到Km和Vm值，并計算kcat和kcat/Km值，確定rSOX對不同底物的親和性以及催化效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白rSOX的生物信息學(xué)分析

用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，ArchaeaHR32中的SOX與其他古生菌來源的SOX序列一致性為45%左右，而與Baciliussp.來源的SOX一致性為34%左右，序列比對情況如圖1所示。利用SMART進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組件分析發(fā)現(xiàn)，重組蛋白rSOX包含Pfam DAO一個保守結(jié)構(gòu)域(圖2-a)，無信號肽序列。該結(jié)構(gòu)域被注釋為是各種FAD依賴性氧化酶的保守結(jié)構(gòu)域。參考文獻(xiàn)[22]方法，推測本研究中的rSOX與FAD共價結(jié)合，實驗證明向培養(yǎng)基中添加FAD的前體物質(zhì)維生素B12對rSOX酶活力的提高有促進(jìn)作用。ExPASy預(yù)測重組蛋白的分子質(zhì)量為41 792.46 Da，等電點為6.37，在酵母細(xì)胞中的半衰期>20 h，在大腸桿菌中的半衰期>10 h；根據(jù)疏水性分析結(jié)果(圖2-b)，總平均親水性為-0.183，表明該蛋白親水性尚可。以7exs.1.A(PDB ID)為模板進(jìn)行同源建模，其與rSOX的序列相似性達(dá)到51.64%，達(dá)到同源建模的要求。利用SWISS-MODEL網(wǎng)站進(jìn)行建模分析結(jié)果如圖2-c所示，模型預(yù)測rSOX具有α-螺旋，β-折疊及無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)。此外，該模型可作為后期進(jìn)行酶改造工作的重要參考。

圖1 不同來源SOX氨基酸序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment for SOX from different sources

a-rSOX保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；b-rSOX疏水性分析；c-rSOX的三級結(jié)構(gòu)模型圖2 rSOX的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測、疏水性分析和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Conserved domain prediction, hydrophobicity analysis and tertiary structure prediction of rSOX

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

按照圖3-a所示流程構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-Pxyl-sox，圖3-b為NdeⅠ 和MluⅠ 雙酶切驗證結(jié)果，泳道2可見清晰的兩條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖3-c所示，純化條帶單一，位于45 kDa偏下方，與預(yù)測理論分子質(zhì)量41 792.46 Da對應(yīng)。經(jīng)MALDI-TOF儀器分析鑒定，確認(rèn)重組蛋白為來源于ArchaeaHR32假設(shè)的肌氨酸氧化酶。以上結(jié)果表明來源于古生菌的rSOX在B.subtilisWB600中實現(xiàn)了可溶性表達(dá)且經(jīng)分離純化后獲得了純酶。經(jīng)測定，搖瓶水平rSOX的產(chǎn)量為15 mg/L，比酶活力為2.3 U/mg。值得一提的是，在本研究中曾嘗試將該蛋白在E.coliBL21(DE3)和E.coliROSETTA(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，均無法實現(xiàn)可溶性表達(dá)，且絕大部分蛋白以包涵體的形式存在，酶活力極低。類似的問題也出現(xiàn)在實驗室表達(dá)另一耐熱肌氨酸氧化酶的過程中[23]。原因可能是耐熱肌氨酸氧化酶的天然生長環(huán)境苛刻，在大腸桿菌表達(dá)體系中無法完成蛋白質(zhì)的折疊，不能形成具有酶活性的天然構(gòu)象。

a-重組質(zhì)粒構(gòu)建流程； b-重組質(zhì)粒酶切驗證(M-Marker，1-7 089 bp和1 113 bp)； c-重組蛋白rSOX的SDS-PAGE圖(1-粗酶液， 2-熱處理后酶液， 3-純酶) 圖3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)Fig.3 Construction and expression of the recombinant plasmid

2.3 rSOX的二級結(jié)構(gòu)與Tm

CD檢測結(jié)果表明重組SOX由35.0%的α-螺旋，11.1%的β-折疊，23.3% β-轉(zhuǎn)角及31.6%的無規(guī)則卷曲組成(圖4-a)。該二級結(jié)構(gòu)組成與課題組此前表達(dá)的來源于TrSOX的接近[9]，而TrSOX也具有不錯的熱穩(wěn)定性。純酶的Tm和ΔH分別為92.13 ℃和1 070 kJ/mol(圖4-b)，Tm越大表明蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越好。在已有報道中，極少有肌氨酸氧化酶的Tm能達(dá)到90 ℃以上。這說明本研究中表達(dá)的rSOX在熱穩(wěn)定性方面具有顯著優(yōu)勢。

a-rSOX的二級結(jié)構(gòu)分析;b-熱變性中點溫度(Tm)分析圖4 rSOX的二級結(jié)構(gòu)分析與熱變性中點溫度(Tm)分析Fig.4 The secondary structure and thermal denaturation (Tm) analysis of rSOX

2.4 rSOX的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 溫度與pH對rSOX的影響

由圖5-a可知，rSOX的最適反應(yīng)溫度為70 ℃。低溫時隨溫度上升反應(yīng)速度加快，當(dāng)溫度到達(dá)70 ℃后，隨反應(yīng)溫度的升高，rSOX構(gòu)象發(fā)生改變，酶活力下降。如圖5-b所示，rSOX在0～70 ℃孵育12 h仍保留85%以上的酶活力，80 ℃孵育12 h保留近50%的酶活力。將rSOX于30 ℃貯藏，第10天檢測到剩余80%的酶活力，第26天降至初始酶活力的50%，到達(dá)該溫度下的半衰期(圖中未展示)。上述結(jié)果進(jìn)一步說明rSOX具有十分優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，有望在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。rSOX的最適反應(yīng)pH為8.0(圖5-c)，這和已知的大多數(shù)SOX的最適pH基本一致(表1)，pH可能是通過改變底物的狀態(tài)或酶的帶電狀態(tài)從而影響酶的活力。在pH 6.0～9.0孵育12 h，rSOX保留50%以上酶活力，在pH<5.5時，酶活力幾乎完全喪失(圖5-d)，這說明rSOX適合在中性偏堿條件下保存。

a-最適溫度;b-溫度穩(wěn)定性;c-最適pH;d-pH穩(wěn)定性圖5 溫度與pH對rSOX的影響Fig.5 Effect of temperture and pH on rSOX

2.4.2 金屬離子與有機溶劑對rSOX的影響

由于肌氨酸氧化酶在使用過程中往往需要在含有機溶劑的體系中進(jìn)行反應(yīng)[2-3]，因此，考察rSOX對常用有機溶劑的耐受性很有必要。如圖6-a所示，除正丙醇、乙醇、二甲基甲酰胺對酶活力有比較明顯的抑制外，其他有機溶劑對酶活力的影響均較小，即使隨著孵育時間的延長，酶活力下降幅度也不大。SOX對lgP值大的有機溶劑如環(huán)己烷、甲苯、異辛烷等耐受能力較強，原因可能是極性有機溶劑能夠溶解大量的水并可剝?nèi)ッ副匦杷瘜訉?dǎo)致酶失活，相應(yīng)的，疏水性有機溶劑較少能除去酶的必需水化層，因而對酶活力活影響不大[24]。同時酶動力學(xué)研究表明大部分有機溶劑的存在對rSOX的Km影響不大，即有機溶劑不太能夠影響rSOX對底物的親和性。以上結(jié)果表明rSOX耐受有機溶劑的能力較強，這為其在有機相中進(jìn)行催化反應(yīng)、拓寬應(yīng)用情景提供了可能。由圖6-b可知，不同金屬離子對酶活力的影響不同，不同濃度的同種金屬離子對酶活力的影響也不同。其中Co2+的加入使酶活力大大降低，終濃度為3.0 mmol/L Al3+、Fe3+、Zn2+的加入幾乎使酶完全失活；Mn2+、Fe3+對酶活力也有一定的抑制作用，且離子濃度越高對酶活力的抑制越顯著；0.2 mmol/L的Mg2+、Al3+、Ca2+、Ni2+和0.5 mmol/L的K+、Zn2+則對rSOX有激活作用，相對酶活力最高可達(dá)到135.5%，其中的Ca2+激活作用最強，且激活作用隨著離子濃度的升高逐漸減小。上述現(xiàn)象可能是由于rSOX發(fā)揮催化作用需要輔因子FAD的參與，而金屬離子對酶活力的激活效應(yīng)可能與其在電子傳遞方面發(fā)揮作用有關(guān)[25]。

a-有機溶劑對rSOX的影響;b-金屬離子對rSOX的影響圖6 有機溶劑及金屬離子對rSOX的影響Fig.6 Effect of organic solvent and metal ion on rSOX

2.4.3 rSOX的底物特異性和酶動力學(xué)參數(shù)分析

表2列出了經(jīng)Hill方程非線性擬合后得到的rSOX對不同底物的酶動力學(xué)參數(shù)。rSOX對肌氨酸的Km值為1.17 mmol/L，低于表1中所列的絕大部分SOX的Km，表現(xiàn)出對肌氨酸更強的親和性。此外，所有底物中rSOX對N-甲基-L-丙氨酸Km最小、kcat/Km最大，分別為0.35 mmol/L和215.12 L/(mmol·min)，rSOX對N-甲基-L-丙氨酸具有最強的親和性與最高的催化效率。從表2可以看出，rSOX對包括N-甲基-L-天冬氨酸、L-脯氨酸、高脯氨酸和有生物毒害作用的紅豆堿等在內(nèi)的9種N-甲基類化合物均具有催化活性，底物譜較為寬泛，但對于非N-甲基氨基酸類化合物如西維因和N-甲基吡咯烷酮則不具有催化活性。同時發(fā)現(xiàn)rSOX對D型底物幾乎不顯示活性，而對N-甲基-L型底物表現(xiàn)出明顯的手性選擇性(>100)。在此，底物特異性和酶動力學(xué)研究均表明rSOX的底物譜較廣、手性選擇性強，使其未來在化合物的手性拆分和降解N-甲基類有毒害物質(zhì)方面具備潛在利用價值。

表2 rSOX對不同底物的酶動力學(xué)參數(shù)Table 2 Catalytic kinetic constants of SOX for different substrates

3 結(jié)論

肌氨酸氧化酶在臨床診斷和食品工業(yè)領(lǐng)域雖已有應(yīng)用，但熱穩(wěn)定性不高、底物譜窄依然是限制其拓展應(yīng)用領(lǐng)域的重要因素。本研究中，我們首先對來源于古生菌ArchaeaHR32的新型肌氨酸氧化酶做了生物信息學(xué)分析，獲得了分子質(zhì)量、疏水性、結(jié)構(gòu)域等基本信息，之后在B.subtilisWB600中實現(xiàn)了該酶的可溶性表達(dá)，經(jīng)熱處理和鎳柱親和層析獲得了純酶。酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果顯示，重組蛋白rSOX的最適溫度為70 ℃，Tm和ΔH分別為92.13 ℃和1 070 kJ/mol，80 ℃下半衰期為12 h，30 ℃下半衰期為26 d，表現(xiàn)出極好的熱穩(wěn)定性。同時發(fā)現(xiàn)，rSOX的最適pH值為8.0，Ca2+、K+、Al3+和Mg2+的添加對酶活力有明顯促進(jìn)作用，對多數(shù)有機溶劑表現(xiàn)出較強的耐受性。此外還發(fā)現(xiàn)rSOX對多種N-甲基氨基酸類底物均具有催化作用，底物譜寬泛，且對N-甲基-L型底物表現(xiàn)出顯著的手性選擇性。溫和條件下的去N-甲基化反應(yīng)在化學(xué)上一直是個難題[9]，古生菌來源的rSOX所具備的上述這些顯著性特征將推進(jìn)酶法去N-甲基化的相關(guān)研究。

同時我們要看到，對rSOX的研究還存在一些問題，如可溶性表達(dá)量低滿足不了大規(guī)模應(yīng)用的需求、針對非N-甲基氨基酸類底物不顯催化活性，今后的研究將著重解決上述2個問題。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系出發(fā)，通過定點突變的方法對某些關(guān)鍵位點的氨基酸進(jìn)行更改可有效解決可溶性表達(dá)差、催化活性低的問題[9,26]。后續(xù)擬在前期構(gòu)建好的rSOX的三級結(jié)構(gòu)模型(圖2-c)的基礎(chǔ)上，嘗試對rSOX的關(guān)鍵位點進(jìn)行理性改造以達(dá)到我們的預(yù)期效果。此外可考慮通過發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝優(yōu)化的方法提高rSOX的產(chǎn)量，本研究中使用的培養(yǎng)基為常見的TB培養(yǎng)基，并且尚未對發(fā)酵條件如誘導(dǎo)劑添加量、誘導(dǎo)溫度等進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后rSOX的產(chǎn)量有望再上一個臺階。