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    代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)肌苷

    2022-12-29 12:53:02朱彥凱劉鐵重伍法清吳鶴云謝希賢
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年24期
    關(guān)鍵詞:肌苷嘌呤腺苷

    朱彥凱,劉鐵重,伍法清,吳鶴云,謝希賢*

    1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)2(天津科技大學 食品科學與工程學院,天津,300457)

    肌苷是一種嘌呤核苷,參與機體物質(zhì)代謝和能量代謝,具有重要的應用價值。在醫(yī)藥領(lǐng)域,肌苷常用于肝病、心臟病等疾病治療藥物的生產(chǎn),也用于異丙肌苷和利巴韋林等抗病毒藥物的合成。在食品領(lǐng)域,肌苷是復合鮮味劑“I+G”的重要原料。此外,肌苷還被廣泛應用在農(nóng)業(yè)、化工和營養(yǎng)保健等諸多領(lǐng)域。目前,主流的肌苷生產(chǎn)方式為微生物發(fā)酵法,該方法利用廉價的原材料,通過生物反應器的擴大培養(yǎng)得到發(fā)酵液,再經(jīng)過分離純化得到肌苷產(chǎn)品,具有高效、穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點。除此之外,酶解法與化學分解法也曾用來生產(chǎn)肌苷,但因其存在較多弊端而被淘汰。

    肌苷生物合成途徑包含3個部分(圖1):首先,葡萄糖磷酸化后形成6-磷酸葡萄糖,后者經(jīng)磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)生成5-磷酸核糖,在5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate,PRPP)合酶(PRPP synthetase,Prs)的催化下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為PRPP。接著,以PRPP、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)和一碳單位等為前體物,經(jīng)10步酶促反應生成肌苷酸(inosine monophosphate,IMP)。最后,IMP在5′-核苷酸酶的催化下生成肌苷。合成途徑冗長復雜,還受到嚴格的反饋調(diào)控,是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷的限制因素之一。另外,肌苷的直接前體物IMP存在另外兩條分支途徑,與肌苷支路競爭碳代謝流,是限制肌苷合成的另一關(guān)鍵因素。常見的肌苷工程菌株也是主要針對以上兩個方面進行構(gòu)建。首先是增強肌苷合成途徑及解除限速酶所受反饋調(diào)控。ASAHARA等[1]通過敲除枯草芽孢桿菌KMBS436的purR基因和嘌呤操縱子核糖開關(guān),解除了嘌呤合成中的反饋阻遏和轉(zhuǎn)錄衰減;又通過優(yōu)化嘌呤操縱子的啟動子序列,增強了嘌呤基因的表達,肌苷產(chǎn)量從1.8 g/L提升至6 g/L。SHIMAOKA等[2]在大腸桿菌I-9m中過表達了purFK326Q,P410W和prsD128A突變基因,解除了限速酶反饋抑制,使肌苷產(chǎn)量提高了3.6倍。另外是阻斷肌苷合成過程的競爭代謝途徑。LI等[3]通過敲除枯草芽胞桿菌BS017中的purA基因來阻斷腺苷支路,肌苷產(chǎn)量從150 mg/L提升至7.6 g/L。PEIFER等[4]通過敲除谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中的purA和guaB基因,同時阻斷了腺苷和鳥苷支路,使IMP產(chǎn)量增加了45倍。然而直接阻斷腺苷或鳥苷支路均會導致菌株營養(yǎng)缺陷[5],菌株生長緩慢,不利于產(chǎn)物生產(chǎn)。因此,適當調(diào)節(jié)腺苷和鳥苷合成支路通量,平衡菌株生長和產(chǎn)物合成,是肌苷工程菌株構(gòu)建的重點和難點。

    在早期研究中,主要通過誘變枯草芽孢桿菌的方式來選育肌苷工程菌株,但誘變后的菌株普遍生產(chǎn)穩(wěn)定性偏低,且易發(fā)生負向突變,不利于工業(yè)化生產(chǎn)[6]。隨著系統(tǒng)生物學的發(fā)展,運用代謝工程理論和基因編輯技術(shù)對野生型菌株進行從頭遺傳改造成為肌苷工程菌株構(gòu)建的主要方法。相比芽孢桿菌,大腸桿菌遺傳背景清晰,基因操作簡便,發(fā)酵周期較短,是發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷另一個優(yōu)良的宿主。然而,目前已有肌苷生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)效率仍然偏低,且普遍存在攜帶質(zhì)粒、營養(yǎng)缺陷等問題,增加了生產(chǎn)的成本,無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。此外,現(xiàn)有菌株的構(gòu)建策略多局限在對限速反應、分支途徑等關(guān)鍵節(jié)點進行改造,少有對肌苷代謝網(wǎng)絡的系統(tǒng)優(yōu)化。針對這些問題,本研究選擇大腸桿菌標準株作為出發(fā)菌株,采用代謝工程技術(shù),通過阻斷肌苷降解途徑、強化肌苷合成途徑、弱化腺苷合成支路、增強前體物供應及修飾肌苷轉(zhuǎn)運系統(tǒng),獲得了一株無質(zhì)粒、非缺陷型且可穩(wěn)定生產(chǎn)的肌苷工程菌株。

    圖1 肌苷生物合成途徑和本研究的改造策略Fig.1 Biosynthetic pathway of inosine and the strategies used in this study注:*表示突變體

    1 材料與方法

    1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

    表1列舉了本研究所用到的菌株及質(zhì)粒。

    表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

    引物,GENEWIZ公司;Primer STAR HS DNA、ExtaqDNA Polymerase,TaKaRa公司;2×RapidTaqMix、ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit,Vazyme公司;Plasmid Mini Kit I D6943、Gel & PCR Clean Up Kit D2000、Cycle Pure Kit D6492,Omega Bio-Tek公司。

    1.2 引物

    具體內(nèi)容見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220509.1719.012.html)。

    1.3 培養(yǎng)基

    斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5,蛋白胨10,酵母粉5,牛肉膏10,NaCl 5,瓊脂20。

    種子培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,KH2PO4·3H2O 1.2,蛋白胨3,MgSO4·7H2O 0.5,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01,MnSO4·H2O 0.01,維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12和維生素H各0.001。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母粉4,蛋白胨5,檸檬酸鈉2,KH2PO4·3H2O 2,MgSO4·7H2O 2,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02,MnSO4·H2O 0.02,維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12和維生素H各0.002。

    在INO2-4基礎上改造的菌株,培養(yǎng)基中均增添0.3 g/L腺嘌呤。

    1.4 基因編輯方法

    本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯方法[7]對大腸桿菌進行基因改造。該方法由pGRB質(zhì)粒、pREDCas9質(zhì)粒和DNA重組片段3個元件共同介導,即pGRB質(zhì)粒和DNA重組片段以電轉(zhuǎn)化的方式導入到含pREDCas9質(zhì)粒的感受態(tài)細胞中,pGRB質(zhì)粒表達出特異性gRNA來識別目的基因靶位點,pREDCas9質(zhì)粒表達出Cas9蛋白對該位點進行切割,DNA重組片段通過同源重組的方式對切割位點進行修復,最終實現(xiàn)基因的準確敲除與整合。具體步驟以整合pbuE基因為例:

    使用Primer 5軟件設計上同源臂引物yjiT-UP-S和yjiT-UP-A、插入片段引物pbuE-S和pbuE-A、下同源臂引物yjiT-DN-S和yjiT-DN-A。通過PCR擴增獲得上同源臂yjiT-UP、插入片段Ptrc-pbuE、下同源臂yjiT-DN,純化回收后再經(jīng)PCR重疊獲得DNA重組片段yjiT∶∶Ptrc-pbuE。使用Cas-Designer工具設計yjiT假基因位點切割靶序列,獲得gRNA-yjiT-S和gRNA-yjiT-A兩條單鏈。將上述單鏈退火所得雙鏈片段與線性化載體進行同源重組,再化轉(zhuǎn)至DH5α化轉(zhuǎn)感受態(tài)中,挑取陽性轉(zhuǎn)化子以獲得pGRB-yjiT質(zhì)粒。將重組片段yjiT∶∶Ptrc-pbuE和pGRB-yjiT質(zhì)粒同時電轉(zhuǎn)化至含pREDCas9質(zhì)粒的INO3-2感受態(tài)細胞中,挑取陽性轉(zhuǎn)化子并消除pGRB質(zhì)粒和pREDCas9質(zhì)粒,獲得重組菌株INO4-2。

    1.5 發(fā)酵方法

    1.5.1 搖瓶發(fā)酵

    發(fā)酵溫度為37 ℃,發(fā)酵周期為24 h,發(fā)酵過程中通過補加氨水維持pH值為7.0~7.2,初始葡萄糖耗盡后,補加600 g/L葡萄糖溶液維持發(fā)酵進行。具體操作可參考文獻[8]。

    1.5.2 發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

    發(fā)酵溫度為37 ℃,pH為7.0,溶氧(dissolved oxygen,DO)為25%~35%,接種量為20%,發(fā)酵周期為48 h。具體操作可參考文獻[8]。

    1.6 檢測方法

    采用高效液相色譜法方法[Thermo U3000,C18色譜柱,V(乙腈)∶V(0.5%三氟乙酸水溶液)=2∶98]對肌苷濃度進行檢測,設置柱溫30 ℃,流速1 mL/min,紫外檢測波長260,進樣量20 μL。

    殘?zhí)菨舛群蜕锪?OD600)測定參考文獻[8]進行。

    1.7 數(shù)據(jù)分析方法

    參考文獻[8]進行數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 肌苷合成途徑的強化

    強化合成途徑是促進產(chǎn)物積累的常用策略之一。在之前的研究中,本實驗室通過誘變篩選獲得了一株產(chǎn)鳥苷的解淀粉芽孢桿菌突變株TA208。測序結(jié)果表明[9],該菌株的嘌呤操縱子已發(fā)生突變,推測有助于解除反饋調(diào)控,提升嘌呤從頭合成酶系的表達水平。本研究首先敲除了野生型大腸桿菌MG1655的rihA、rihB、rihC、deoD、ppnP基因,以阻斷肌苷的降解,構(gòu)建了底盤菌株INO1-1。為強化肌苷合成途徑,本研究將突變株TA208的嘌呤操縱子(purEKBCSQLGMNHD)整合在底盤菌株INO1-1的yghE假基因位點,由Ptrc啟動子控制,構(gòu)建了菌株INO1-2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示,INO1-2的肌苷產(chǎn)量達到155.2 mg/L。

    PRPP和谷氨酰胺在PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶(amidophosphoribosyltransferase,PurF)催化下生成5-磷酸核糖胺和谷氨酸,是肌苷合成途徑的限速步驟,而PurF的催化活性受腺苷酸(adenosine monophosphate,AMP)和鳥苷酸(guanosine monophosphate,GMP)的協(xié)同反饋抑制[10]。據(jù)報道,大腸桿菌自身的PurF和枯草芽孢桿菌來源的PurF均可通過定點突變解除其所受反饋抑制[2,11]。于是,本研究將這兩種來源的突變基因purFecoK326Q,P410W和purFbsuD293V,K316Q,S400W分別整合至INO1-2的yeeP假基因位點,由Ptrc啟動子控制,構(gòu)建了菌株INO1-3和INO1-4。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示,INO1-4肌苷產(chǎn)量為308.3 mg/L,相比INO1-2提升98.6%;INO1-3肌苷產(chǎn)量為189.5 mg/L,相比INO1-2提升22.1%。結(jié)果表明,兩種PurF突變體的過表達均使肌苷產(chǎn)量得以提升,但突變體PurFbsuD293V,K316Q,S400W的效果更好,可顯著增強肌苷合成途徑通量,提升肌苷的產(chǎn)量。

    圖2 增強肌苷合成途徑對肌苷發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of enhancing the expression of inosine synthesis pathway on inosine fermentation注:*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)(下同)

    2.2 腺苷合成支路的弱化

    IMP到肌苷的分支途徑是肌苷合成途徑的重要組成部分,然而,IMP還存在另外兩條分支途徑,分別由腺苷酸合成酶(adenylosuccinate synthetase,PurA)和IMP脫氫酶(IMP dehydrogenase,GuaB)參與催化,向腺苷和鳥苷代謝。研究者對IMP分支代謝通量進行分析,發(fā)現(xiàn)流向腺苷支路的碳代謝流遠超流向肌苷和鳥苷支路的碳代謝流[3],是限制肌苷合成的重要因素。因此,為提升肌苷支路代謝通量,同時探究阻斷腺苷或鳥苷支路對菌體生長和生產(chǎn)的影響,本研究在INO1-4中分別單敲除與雙敲除了purA和guaB基因,依次構(gòu)建了菌株INO2-1、INO2-2和INO2-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖3所示,INO2-1、INO2-2和INO2-3的OD600值均下降至4.0左右,肌苷產(chǎn)量分別下降至75.2、33.7、98.1 mg/L。這表明腺苷和鳥苷支路的阻斷使細胞所需能量或營養(yǎng)物質(zhì)合成受限,進而嚴重影響到菌體生長與生產(chǎn)。在培養(yǎng)基中添加0.3 g/L腺嘌呤和0.3 g/L鳥嘌呤后,3個菌株的OD600值和肌苷產(chǎn)量均顯著提升。其中INO2-1的肌苷產(chǎn)量為1 180.9 mg/L,OD600值為25.1;INO2-2肌苷產(chǎn)量為445.4 mg/L,OD600值為31.2;INO2-3的肌苷產(chǎn)量為778.8 mg/L,OD600值為17.7。這表明阻斷腺苷或鳥苷支路均可促進肌苷積累,但腺苷支路的阻斷對肌苷產(chǎn)量的提升效果更加明顯;同時阻斷兩條支路代謝會使菌體內(nèi)代謝嚴重失衡,即使在添加缺陷物質(zhì)的條件下仍影響菌體生長。另外,腺苷支路的阻斷使AMP從頭合成受阻,減弱了PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶所受反饋抑制,是肌苷產(chǎn)量提升的另一原因。

    圖3 阻斷競爭代謝途徑對菌體生長和肌苷發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of blocking competing metabolic pathways on growth and inosine fermentation

    阻斷腺苷支路雖可顯著提升肌苷產(chǎn)量,但會嚴重影響菌株生長。為平衡菌株生長和產(chǎn)物合成,適當弱化而非直接阻斷腺苷支路是更加理性的選擇。研究表明,將枯草芽孢桿菌來源的PurA中第242位的脯氨酸替換為天冬酰胺,可降低53.7%的酶活力[5]。于是,本研究將INO1-4的purA基因替換為purAbsuP242N突變基因,構(gòu)建了菌株INO2-4。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖4所示,在無腺嘌呤添加的條件下,INO2-4的肌苷產(chǎn)量為810.2 mg/L,是INO2-1的10.8倍;OD600值為21.4,是INO2-1的5.4倍。在添加腺嘌呤的條件下,INO2-4的肌苷產(chǎn)量達到1 412.5 mg/L,相比INO2-1提升了19.6%;OD600值為30.3,相比INO2-1提升了20.7%。結(jié)果表明,突變體PurAbsuP242N的替換既可維持菌株一定的生長水平,又能保證足夠的肌苷支路通量,進而使肌苷產(chǎn)量和菌體OD600值均顯著提升。另外,添加腺嘌呤可使產(chǎn)量和生長提升至更高的水平。

    圖4 弱化腺苷合成支路對菌體生長和肌苷發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of weakening Adenosine synthesis branch on growth and inosine fermentation

    2.3 增強前體物PRPP的供應

    增強前體物的供應有利于將代謝流持續(xù)導入目標產(chǎn)物合成途徑,促進產(chǎn)物的積累。PRPP是嘌呤合成的重要前體物,其合成酶編碼基因prs的表達受到嘌呤阻遏物(DNA-binding transcriptional repressor,PurR)的反饋阻遏[12],同時Prs的催化活性受到腺苷二磷酸(adenosine-5′-diphosphate,ADP)和鳥苷二磷酸(guanosine-5′-diphosphate,GDP)的反饋抑制[10]。為解除反饋調(diào)控,本研究首先敲除了INO2-4的purR基因,構(gòu)建了菌株INO3-1。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖5所示,INO3-1的肌苷產(chǎn)量為1.6 g/L,與INO2-4相比提升了14.3%,OD600值沒有明顯變化。據(jù)報道,在大腸桿菌的Prs中引入D128A位點突變[2]和在解淀粉芽孢桿菌的Prs中引入N120S和L135I位點突變[13],均可解除PRPP合酶所受反饋抑制。因此,本研究在INO3-1中的gapC位點分別整合了prsecoD128A與prsbazN120S,L135I突變基因,由Ptrc啟動子控制,構(gòu)建了菌株INO3-2和INO3-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖5所示,INO3-2的肌苷產(chǎn)量達到3.1 g/L,與INO3-1相比提升了93.8%,而INO3-3的肌苷產(chǎn)量沒有提升。這表明突變體PrsecoD128A的過表達有效增強了PRPP的供應,進而提升了肌苷的產(chǎn)量。

    2.4 肌苷轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的改造

    產(chǎn)物在胞內(nèi)積累過多會給細胞帶來代謝負擔,也會引起產(chǎn)物介導的反饋抑制,需要及時排到胞外。為促進肌苷外排,本研究在INO3-2的yjiT位點整合了大腸桿菌來源的nepI基因[14]和解淀粉芽孢桿菌來源的pbuE基因[15],由Ptrc啟動子控制,構(gòu)建了菌株INO4-1和INO4-2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6所示,INO4-2的肌苷產(chǎn)量為3.9 g/L,相比INO3-2提升了25.8%;OD600值為35.2,相比INO3-2提升了16.7%;INO4-1的肌苷產(chǎn)量和OD600值均無明顯提升。這表明異源轉(zhuǎn)運蛋白的引入有效提升了菌體對肌苷的外排能力,同時緩解細胞內(nèi)代謝負擔,促進了菌體生長。為進一步提升肌苷產(chǎn)量,本研究在INO4-2的ilvG及ylbE位點分別整合了pbuE基因的雙拷貝及三拷貝,由Ptrc啟動子控制,構(gòu)建了菌株INO4-3與INO4-4。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,INO4-3的肌苷產(chǎn)量為4.5 g/L,相比INO4-2提升了15.4%;INO4-4的肌苷產(chǎn)量沒有提升。這表明兩個拷貝的pbuE基因已最大化菌體對肌苷的外排能力。另外,nupC[16]、nupG[16]、ydhC[17]和xapB[16]基因也編碼肌苷轉(zhuǎn)運蛋白,可將肌苷從胞外攝取到胞內(nèi)。于是本研究分別敲除了INO4-3的nupC、nupG、ydhC和xapB基因,構(gòu)建了菌株INO4-5、INO4-6、INO4-7與INO4-8。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6所示,INO4-5的肌苷產(chǎn)量為5.0 g/L,與INO4-3相比提升了11.1%,其余菌株的肌苷產(chǎn)量均沒有提升。這表明nupC基因所編碼的轉(zhuǎn)運蛋白是參與肌苷攝取的主要透性酶,敲除該基因可減弱菌體對肌苷的吸收。

    圖5 增強PRPP供應對肌苷發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of enhancing the supply of PRPP on inosine fermentation

    2.5 工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵測試

    為測試菌株INO4-5的發(fā)酵性能,本研究5 L發(fā)酵罐中進行了分批補料發(fā)酵。當葡萄糖質(zhì)量濃度低于2 g/L時,開始流加800 g/L的葡萄糖。發(fā)酵結(jié)果如圖7所示,菌株在發(fā)酵初期生長緩慢,20 h后OD600值達到最高并進入穩(wěn)定期。0~12 h,肌苷合成速率較慢;12~32 h,肌苷保持了較高的合成速率。48 h 時肌苷的最終產(chǎn)量為20.2 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為0.12 g/g葡萄糖,生產(chǎn)強度為0.42 g/(L·h)。

    圖6 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)改造對肌苷發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of transport system modification on inosine fermentation

    圖7 工程菌INO4-5的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果Fig.7 Fermentation results of the engineered strain INO4-5 in a 5 L bioreactor

    3 討論

    近年來,隨著抗病毒和抗腫瘤藥物需求量的增加,嘌呤核苷及其衍生物受到廣泛關(guān)注。然而,由于代謝途徑冗長、代謝調(diào)控復雜以及多種前體物需求,肌苷合成十分困難。芽孢桿菌因具有較強的PPP途徑和嘌呤合成途徑通量,以及較弱的核苷磷酸化酶活力,是肌苷生產(chǎn)菌株選育中常見的底盤菌株。相比芽孢桿菌,大腸桿菌基因操作高效、發(fā)酵控制簡便、生產(chǎn)周期較短,是發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷另一個優(yōu)良的宿主。于是,本研究將Ptrc啟動子控制下的芽孢桿菌嘌呤操縱子引入大腸桿菌,不僅繞過了PurR介導的反饋阻遏機制、鳥嘌呤介導的轉(zhuǎn)錄衰減機制[18],而且通過借助異源優(yōu)勢,提高了嘌呤從頭合成酶系的表達水平。隨著各模塊的優(yōu)化組合,肌苷產(chǎn)量持續(xù)提高,進一步體現(xiàn)了引入芽孢桿菌嘌呤操縱子的重要作用。

    腺苷和鳥苷支路對碳代謝流的分流也是肌苷合成的重要限制因素。本研究對比了阻斷這兩條支路對肌苷產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)腺苷支路的阻斷對肌苷產(chǎn)量提升效果更加明顯,但會導致菌體營養(yǎng)缺陷。為平衡菌體生長和產(chǎn)物合成,本研究嘗試了兩種方式來改造腺苷支路。一方面是靜態(tài)弱化。本研究通過將自身PurA替換為低酶活力的PurAbsuP242N突變體的方式來弱化腺苷支路,相比于直接阻斷的方式,菌體生長水平和肌苷產(chǎn)量均大幅提升。為進一步提升菌株發(fā)酵性能,本研究嘗試拷貝了第二個purAbsuP242N基因。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,菌體OD600值達到70,而肌苷產(chǎn)量大幅降低,表明二拷貝purAbsuP242N基因使腺苷支路分流過強,不利于肌苷合成。后期應嘗試其他表達強度,或開發(fā)新的活性位點突變,使PurA的表達更加均衡,同步提升菌體生長水平和肌苷產(chǎn)量。另一方面是動態(tài)調(diào)控。本研究選擇引入群體感應系統(tǒng)[19],通過響應菌體密度來動態(tài)調(diào)控purA基因的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)酵結(jié)果顯示,在生長初期,菌體OD600值相比對照菌株INO1-4偏低;12 h后,菌體OD600值與對照菌株INO1-4幾乎保持一致;24 h搖瓶發(fā)酵后,肌苷產(chǎn)量僅為0.3 g/L。推測purA基因轉(zhuǎn)錄停止后,胞內(nèi)已表達的PurA持續(xù)催化腺苷支路,導致肌苷支路通量不足。后期應嘗試在轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基礎上,結(jié)合蛋白水平的調(diào)節(jié),如引入TEVp[20]、SsrA[21]等元件適時降解PurA,使動態(tài)調(diào)控更加嚴謹和高效,真正實現(xiàn)“生長模式”到“生產(chǎn)模式”的自動切換。

    PRPP是嘌呤從頭合成過程中的重要前體物。本研究通過敲除purR基因、過表達prsecoD128A基因,增強了PRPP的供應,顯著提升了肌苷的產(chǎn)量。由于PRPP的前體物5-磷酸核糖經(jīng)PPP途徑生成,為持續(xù)提升菌株發(fā)酵性能,需對PPP途徑進行改造。為此,本研究過表達了PPP途徑的關(guān)鍵酶編碼基因gnd和zwf,發(fā)酵結(jié)果顯示,肌苷的產(chǎn)量并沒有提高,而菌體OD600值略有下降。我們推測PPP途徑的強化,使胞內(nèi)還原力NADPH水平提升,反饋抑制了關(guān)鍵酶6-磷酸葡糖酸脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的酶活力,進而限制了PPP碳通量的增強;胞內(nèi)NADPH/NADP+的比例失衡,可能是影響菌體生長的原因。因此,開發(fā)解除反饋抑制的關(guān)鍵酶活性位點突變,同時增強NADPH的代謝以平衡細胞內(nèi)氧化還原水平,是進一步提升肌苷產(chǎn)量的潛在策略。此外,減弱競爭途徑也是提升PPP途徑通量的關(guān)鍵考慮。糖酵解途徑(embden-meyerhof-parnas,EMP)是PPP的主要競爭途徑。WU等[22]通過敲除pgi基因來完全阻斷EMP途徑,經(jīng)52 h發(fā)酵,組氨酸產(chǎn)量與對照菌株相同,而菌體OD600值大幅下降,糖耗也顯著降低。這表明通過減弱EMP途徑來增強PPP途徑通量的方式,可顯著提升以PRPP為前體物的產(chǎn)物的糖酸轉(zhuǎn)化率。但對于EMP途徑與PPP途徑通量的再分配,應側(cè)重于更加溫和可控方式,如通過起始密碼子替換或動態(tài)調(diào)控等方式來減弱EMP途徑,才能達到同步提升產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的目的。同樣地,減弱2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸途徑[23]與PPP途徑的非氧化分支[24],也有助于降低碳代謝流損失,促使更多碳代謝流流向肌苷合成途徑,提升肌苷的產(chǎn)量。

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