pH急性脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺行為及免疫酶活性的影響

丁瑞霞，黃星美，趙 旺，鄧正華，陳恒大，溫為庚，馬振華，王江勇,鄭忠明

(1 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384；2 三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南 三亞 572426；3 海南省深遠(yuǎn)海漁業(yè)資源高效利用與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南三亞，572426;4 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；5 惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007;6 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315822)

方斑東風(fēng)螺(Babylonia areolata)俗稱香螺、花螺，屬于腹足綱，蛾螺科，主要生長在中國東南亞和日本沿海，是熱帶和亞熱帶的海洋物種，也是中國東南沿海主要的養(yǎng)殖產(chǎn)品和經(jīng)濟(jì)貝類[1]。其營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美，是一種傳統(tǒng)海味，深受人們的喜愛，市場(chǎng)容量較大。近年來，隨著苗種繁育及養(yǎng)殖技術(shù)的突破與升級(jí)，方斑東風(fēng)螺工業(yè)化養(yǎng)殖在中國東南沿海地區(qū)發(fā)展迅速[2]。

水環(huán)境在水生生物的生長繁殖中起著重要作用，而不適宜的環(huán)境則會(huì)抑制水生生物的發(fā)育、生長和繁殖。pH是水產(chǎn)養(yǎng)殖水環(huán)境的重要指標(biāo)，過高、過低都會(huì)直接影響水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的生長、攝食和代謝[3-4]。在貝類工業(yè)化的養(yǎng)殖過程中，大量的貝類死亡、藻類的過度喂養(yǎng)甚至海水的紅潮都會(huì)降低水體的pH，而且在養(yǎng)殖過程中，為了凈化水質(zhì)，栽植大量的水生植物，由于光合作用，水中的二氧化碳(CO2)被大量消耗，導(dǎo)致水體pH增加[5]，pH的變化會(huì)對(duì)水生生物造成慢性或急性的應(yīng)激，影響其活動(dòng)及免疫功能[6-10]。方斑東風(fēng)螺在中國南方沿海的養(yǎng)殖方式主要以露天陸地水泥池的流水養(yǎng)殖為主，水產(chǎn)養(yǎng)殖池pH的變化會(huì)對(duì)其生理和生長過程產(chǎn)生不同影響。酸性和堿性環(huán)境會(huì)降低幼貝的附著力，兩殼緊密閉合、觸手不伸出[11]。

本研究通過pH脅迫試驗(yàn)確定了方斑東風(fēng)螺免疫活性的變化，更好地了解方斑東風(fēng)螺的免疫反應(yīng)，為深入研究方斑東風(fēng)螺提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

據(jù)試驗(yàn)要求放入健康、大小均勻且活力強(qiáng)的方斑東風(fēng)螺，觀察活動(dòng)和生存情況，試驗(yàn)過程中觀察24 h內(nèi)百分百死亡pH(LC100/24 h)和96 h內(nèi)百分百無死亡pH(LC100/96 h)，據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定試驗(yàn)液pH的上、下限，然后用等間距方法分別設(shè)置了5.0～9.0等5個(gè)pH濃度梯度，利用氫氧化鈉(NaOH)或者氯化氫(HCl)來調(diào)節(jié)至相應(yīng)pH，使用pH分析儀測(cè)定相應(yīng)的pH，并將已經(jīng)配置好的海水儲(chǔ)存在單獨(dú)的水箱中。以自然海水pH=8.0為基礎(chǔ)，用pH分析儀對(duì)水體的pH每天早晚各矯正一次，控制pH日變化幅度不超±0.2。每組處理均為3個(gè)平衡，并將30只健康活躍的螺放在每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器(40 L)中。試驗(yàn)用螺質(zhì)量相近，來降低試驗(yàn)差異性，整個(gè)試驗(yàn)過程中螺不會(huì)重復(fù)使用，并在試驗(yàn)期間停止投喂。

試驗(yàn)開始后，從6、12、24、48、72和96 h內(nèi)隨機(jī)選擇每組3只方斑東風(fēng)螺，檢測(cè)每種免疫酶的活性。在這種情況下，每6 h從每個(gè)容器中取出水樣，測(cè)量pH并及時(shí)調(diào)整到預(yù)定值。在試驗(yàn)中，對(duì)各試驗(yàn)組方斑東風(fēng)螺的活動(dòng)狀況和死亡率進(jìn)行持續(xù)觀察和記錄，評(píng)估死亡的標(biāo)準(zhǔn)是，螺肉向外翻，吻管向外突出，發(fā)白僵硬。

1.2.2 樣品的處理

用0.2 mol/L的生理鹽水以1∶2 的質(zhì)量體積比研磨整個(gè)組織，將研磨液置于5 000 r/min、4 ℃下離心10 min，并將上清液置于潔凈的EP(eppendorf)管中，-80 ℃冰箱內(nèi)保存、備用，POD、CAT、ACP和GSH-PX活性的測(cè)定分別采用相關(guān)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分析

獲得的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并使用SPSS 21.0 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，若處理間有顯著性差異，再用Duncan法對(duì)均值進(jìn)行比較，顯著性水平為P<0.05，極顯著性水平為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺的行為及存活率的影響

在pH試驗(yàn)組中，隨著pH的改變，方斑東風(fēng)螺出現(xiàn)不同程度的應(yīng)激反應(yīng)。pH脅迫后，方斑東風(fēng)螺主要表現(xiàn)為對(duì)外部刺激反應(yīng)遲鈍，運(yùn)動(dòng)緩慢，爬壁運(yùn)動(dòng)減少，沉到桶底，無法正立，身體硬死。方斑東風(fēng)螺的死亡狀態(tài)為發(fā)白僵硬，螺肉外翻，吻管向外伸出。pH=5.0的試驗(yàn)組在6 h時(shí)出現(xiàn)了行動(dòng)緩慢、翻背，在72 h開始死亡，死亡率為13%。pH=9.0試驗(yàn)組在12 h出現(xiàn)翻背，其翻背率為50%至27 h出現(xiàn)死亡。其他pH試驗(yàn)組的方斑東風(fēng)螺生活狀況良好，存活率100%，僅有個(gè)別螺出現(xiàn)翻背的現(xiàn)象(見表1)。隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組的方斑東風(fēng)螺也從最初的行動(dòng)活躍到最后的行動(dòng)緩慢、翻背。

表1 pH脅迫下方斑東風(fēng)螺的行為和存活率影響

2.2 pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺GSH-PX活性的影響

pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺GSH-PX活性的影響如圖1a所示?？梢钥闯?，不同pH的處理時(shí)間對(duì)方斑東風(fēng)螺GSH-PX活力影響顯著(P<0.05)，不同pH下GSH-PX活性短時(shí)間內(nèi)無顯著性差異(P>0.05)。在pH=5.0時(shí)，GSH-PX的活性先升高后又降低，并在48 h活性達(dá)到7.48 U/mgprot的峰值。同樣的pH=8.0時(shí)，GSH-PX活性在6 h也達(dá)到了最大值9.44 U/mgprot。然而，GSH-PX活性在其他各試驗(yàn)組中隨著時(shí)間的推移，GSH-PX顯示出“誘導(dǎo)-抑制”的趨勢(shì)。

2.3 pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺CAT活性的影響

pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺CAT活性的影響如圖1b所示?？梢钥闯?，不同pH的處理時(shí)間對(duì)方斑東風(fēng)螺CAT活力影響顯著(P<0.05)，不同pH下CAT活性短時(shí)間內(nèi)無顯著性差異(P>0.05)。在pH=9.0時(shí)，CAT活性變化顯著，在12 h試驗(yàn)組活性出現(xiàn)峰值，達(dá)到58.26 U/mgprot，隨著時(shí)間的推移，活性逐漸降低；在pH=7.0時(shí)，試驗(yàn)組在6 h活性達(dá)到最低值15.23 U/mgprot?？傮w來看，隨著時(shí)間的不斷延長，各pH處理組CAT活性顯示出 “誘導(dǎo)-抑制-誘導(dǎo)”的變化趨勢(shì)。

2.4 pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺POD活性的影響

pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺POD活性的影響如圖1c所示。可以看出，不同pH的處理時(shí)間對(duì)方斑東風(fēng)螺POD活力影響顯著(P<0.05)，不同pH下POD的活性短時(shí)間內(nèi)無顯著性差異(P>0.05)。當(dāng)pH=7.0、8.0時(shí)，POD活力呈現(xiàn)先降低后升高最后降低的趨勢(shì)，其他實(shí)驗(yàn)組POD活力均呈現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH=9.0時(shí)，POD活力變化顯著，在24 h活力出現(xiàn)峰值，達(dá)到15.19 U/mgprot，當(dāng)pH=5.0時(shí)，試驗(yàn)組POD活力在96 h達(dá)到最低值，活力為5.03 U/mgprot。雖然各試驗(yàn)組POD活力的變化規(guī)律不同，總體看來，POD活性顯示出“誘導(dǎo)-抑制”的變化趨勢(shì)。

2.5 pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺ACP活性的影響

pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺ACP活性水平的主要影響如圖1d所示。可以看出，不同pH的處理時(shí)間對(duì)方斑東風(fēng)螺ACP活力影響顯著(P<0.05)，當(dāng)pH=5.0、8.0、9.0時(shí)，ACP的活性顯著上升，并可于12 h達(dá)到最高，但隨著時(shí)間的推移，ACP的活性逐漸出現(xiàn)抑制。pH=7.0時(shí)，ACP活性由6 h的最高值173.09 U/mgprot逐漸降低，后雖然隨著時(shí)間的變化有所提高，但總體ACP活性仍然是受到抑制。pH=6.0時(shí)，ACP活性受到輕微抑制后隨時(shí)間顯著升高，在24 h時(shí)后又呈現(xiàn)抑制的現(xiàn)象。因此，低pH處理組(pH=5.0、6.0)ACP活性顯示出“誘導(dǎo)-抑制”的變化趨勢(shì)。

圖1 pH脅迫對(duì)方斑東風(fēng)螺免疫酶活性水平的主要影響

3 討論

3.1 pH對(duì)方斑東風(fēng)螺行為和存活率的影響

在適宜的環(huán)境條件下，水生生物體內(nèi)的代謝會(huì)加強(qiáng)，有利于其生長發(fā)育。反之，會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生代謝壓力進(jìn)而影響其生長[12-13]。pH作為一個(gè)重要的環(huán)境因子，其變化可能會(huì)導(dǎo)致水生生物的免疫能力受損甚至死亡[14]。本試驗(yàn)中，在pH為5.0、9.0處理72 h時(shí)的平均死亡率超過10%，在96 h的死亡率達(dá)到20%。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，方斑東風(fēng)螺的最適pH為8.0，其最高和最低的臨界pH分別為9.0和5.0，超出這個(gè)臨界范圍，方斑東風(fēng)螺的存活率會(huì)大大降低。這和劉洋等[15]的研究結(jié)果相似，不同pH對(duì)海灣扇貝(Argopectenirradians)胚胎發(fā)育的影響，隨著pH的降低，存活率逐漸下降。水體pH會(huì)直接地影響水生生物代謝功能，造成其免疫系統(tǒng)受損、酸堿平衡紊亂、導(dǎo)致個(gè)體的死亡。覃玉蓮等[16]研究低pH對(duì)小龍蝦(Procambarusclarkia)免疫功能影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在低pH水環(huán)境條件下，時(shí)間越長，死亡率也就越高，這是因?yàn)樾↓埼r長期的處于酸性條件下，破壞了小龍蝦的免疫系統(tǒng)從而影響小龍蝦自身的修復(fù)功能，使其無法有效抵御疾病。本研究中，隨著時(shí)間的延長，方斑東風(fēng)螺在過高、過低pH下，死亡率都逐漸上升，這可能因?yàn)閜H破壞了方斑東風(fēng)螺的免疫系統(tǒng)，使其失去抵御外來病原體入侵的能力而死亡。

有研究表明，水生生物可以通過體內(nèi)緩沖系統(tǒng)調(diào)節(jié)滲透壓，使體內(nèi)pH接近中性，維持機(jī)體酸堿平衡，使其能適應(yīng)一定范圍內(nèi)外界pH的變化，但是，如果超過緩沖限值，機(jī)體的pH會(huì)發(fā)生顯著變化，破壞體液的酸堿平衡，影響機(jī)體正常生理活動(dòng)[17-18]。本研究結(jié)果表明，方斑東風(fēng)螺對(duì)于pH有著一定程度的耐受性，因此在短時(shí)間內(nèi)，pH過高或者過低，方斑東風(fēng)螺僅僅表現(xiàn)出翻背，運(yùn)動(dòng)遲緩，并沒有立即死亡，并且這與李健等[19]研究結(jié)果相似，pH脅迫對(duì)中國對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)死亡率有一定的影響，高和低pH脅迫都會(huì)使3種對(duì)蝦的存活率隨時(shí)間的延長而逐漸降低。梁從飛等[20]研究表明，pH升高會(huì)導(dǎo)致羅非魚(Oreochromismossambicus)血清滲透壓發(fā)生顯著變化，從而破壞魚類體內(nèi)的酸堿平衡，對(duì)羅非魚造成危害。本研究中方斑東風(fēng)螺在高、低pH條件下均會(huì)出現(xiàn)翻背，這是因?yàn)樵趐H突變環(huán)境中方斑東風(fēng)螺采取主動(dòng)調(diào)節(jié)措施，維持體內(nèi)離子和酸堿平衡，這既是機(jī)體的被動(dòng)病理表現(xiàn)，也是主動(dòng)的保護(hù)反應(yīng)[21]，這跟榮小軍等[22]研究的不適pH下海參(Holothuria)會(huì)出現(xiàn)身體蜷曲、棘刺收縮，糞便變細(xì)變短相類似。

3.2 pH對(duì)方斑東風(fēng)螺個(gè)體免疫酶活性的影響

CAT和POD是動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化酶，GSH-PX可以將過氧化氫(H2O2)分解成氫氣(H2)和氧氣(O2)，來有效阻止體內(nèi)膜脂質(zhì)細(xì)胞的過氧化，進(jìn)而有效減緩膜細(xì)胞因氧化和應(yīng)激而引起細(xì)胞的破壞。正常的狀態(tài)條件下，CAT和POD可以與GSH-PX聯(lián)合作用清除動(dòng)物基體內(nèi)存在的過氧反應(yīng)性自由基，使得動(dòng)物基細(xì)胞體內(nèi)的自由基化合物的氧化形成過程和氧化消除過程達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，從而可以保證使其自身免遭有害自由基化合物的破壞[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)，CAT和POD的活性越強(qiáng)，抗逆性也就越強(qiáng)，其消除自由基能力也越強(qiáng)。而當(dāng)動(dòng)物的生存環(huán)境發(fā)生變化，受到脅迫時(shí)，這兩種酶的活性就會(huì)發(fā)生應(yīng)激變化以適應(yīng)新的環(huán)境[26-27]。該研究中，方斑東風(fēng)螺受到pH脅迫CAT和POD的酶活性在短時(shí)間內(nèi)顯著上升，隨著時(shí)間的延長這兩種酶的活性又逐漸降低。這可能是因?yàn)榉桨邧|風(fēng)螺體內(nèi)的CAT和POD產(chǎn)生適應(yīng)環(huán)境的誘導(dǎo)反應(yīng)，因此提高了這兩種酶的活性，使其達(dá)到新的動(dòng)態(tài)平衡。然而，隨著時(shí)間不斷延長，由于方斑東風(fēng)螺初始產(chǎn)生的活性氧超過了其抗氧化系統(tǒng)的捕獲能力，抗氧化系統(tǒng)無法及時(shí)捕捉自由基，從而導(dǎo)致氧化損傷，使得CAT和POD活性均降低或者喪失。GSH-PX具備單獨(dú)去除過氧化物的能力，隨時(shí)間延長，GSH-PX逐漸適應(yīng)新的pH環(huán)境，當(dāng)生物受到脅迫，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化時(shí)，GSH-PX活性就會(huì)升高進(jìn)而去清除體內(nèi)的過氧化物。田立立[5]在研究pH脅迫克氏原螯蝦(Pro-cambarusclarkii)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，GSH-PX活性受到pH脅迫在短時(shí)間內(nèi)迅速下降，而后又隨著適應(yīng)新環(huán)境而升高。這也與劉鵬飛等[28]研究凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)CAT和POD基因表達(dá)的機(jī)理相似。

ACP是參與動(dòng)物免疫防御功能的主要水解酶，它也是吞噬細(xì)胞的主要成分[29]，主要來源于粒細(xì)胞顆粒，在細(xì)胞吞噬作用、鈣磷代謝、體內(nèi)蛋白質(zhì)合成和磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移等過程起重要作用[30]，它的活力變化是判斷水產(chǎn)動(dòng)物免疫力的重要指標(biāo)[31-34]，因此在動(dòng)物免疫學(xué)中ACP作為關(guān)鍵的免疫指標(biāo)，長期以來一直被廣泛研究。Suresh等[35]研究了銅離子(Cu2+)脅迫下貝類血細(xì)胞ACP活性變化，發(fā)現(xiàn)在低或者高pH脅迫下，ACP活性明顯升高。本研究中，較低和較高pH條件下，方斑東風(fēng)螺的ACP酶活性的變化也趨于相同，均是呈先緩慢上升后逐漸下降的態(tài)勢(shì)，這是由于方斑東風(fēng)螺處于pH變化的環(huán)境中，為維持自身體內(nèi)酸堿平衡而采取的主動(dòng)調(diào)節(jié)措施，也是一種被動(dòng)的病理表現(xiàn)。當(dāng)環(huán)境因子存在脅迫時(shí)，方斑東風(fēng)螺的免疫功能將出現(xiàn)暫時(shí)的增強(qiáng)。也就是說，ACP活力提高是機(jī)體在病理?xiàng)l件下急性激活反應(yīng)中免疫功能的表現(xiàn)，提高活性有助于保護(hù)機(jī)體并減少氧化損傷。這跟樊甄嬌等[36]研究結(jié)果一致，pH對(duì)櫛孔扇貝(Azumapectenfarreri)ACP活性都有明顯的影響，隨著pH急劇變化，ACP活性明顯升高。當(dāng)貝類受到損傷時(shí)，為防止外來病原生物入侵，激活溶酶體中以ACP為主的一系列水解酶，使這些酶活力大大提高[37-38]。由此看來，除了作為自身防御的反應(yīng)外，ACP活力升高也被認(rèn)為是一種被動(dòng)病理表現(xiàn)。

4 結(jié)論

研究表明，pH對(duì)方斑東風(fēng)螺免疫酶活性有顯著影響，高pH和低pH水體養(yǎng)殖一段時(shí)間之后，都會(huì)表現(xiàn)出不能保持正立、腹面朝上、運(yùn)動(dòng)緩慢等狀態(tài)，甚至還會(huì)導(dǎo)致方斑東風(fēng)螺死亡。當(dāng)受到重度pH脅迫時(shí)，方斑東風(fēng)螺的GSH-PX、CAT、POD、ACP活性被抑制；當(dāng)受到輕度pH脅迫時(shí)，免疫酶活性則被誘導(dǎo)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH改變時(shí)，這些免疫酶活性變化得較特異，與方斑東風(fēng)螺所處的發(fā)育階段不同、抗逆能力較強(qiáng)、免疫能力強(qiáng)等生物習(xí)性有關(guān)。pH處理組中方斑東風(fēng)螺免疫酶活力變化規(guī)律，很好地指引了養(yǎng)殖水體pH調(diào)控范圍。未來對(duì)東風(fēng)螺的進(jìn)一步研究將考慮方斑東風(fēng)螺對(duì)不同環(huán)境脅迫反應(yīng)的種內(nèi)變異性，以及種間差異性。

□