一株可分解鉀長石真菌的分離篩選及鑒定

薛永萍，湯 璐，馮 健，謝婷婷*，池汝安*

(1.武漢工程大學郵電與信息工程學院，湖北 武漢 430074；2.武漢工程大學興發(fā)礦業(yè)學院，湖北 武漢 430074)

全球可溶性鉀資源非常豐富，但分布極其不均，我國僅占世界總儲量的2.2%[1]。因此，我國每年需進口大量鉀肥。值得慶幸的是，我國鉀長石礦物資源極為豐富，將鉀長石礦物中的難溶性鉀轉(zhuǎn)化為速效鉀，可有效解決我國可溶性鉀資源匱乏問題。目前，常采用物理法、化學法和微生物法提取鉀長石礦物中的難溶性鉀[2]，其中物理法和化學法易產(chǎn)生環(huán)境污染、生態(tài)安全和食品安全等系列問題，而微生物法能突破鉀長石礦物資源難以利用的技術(shù)瓶頸，為鉀長石的開發(fā)利用開辟了新途徑。李春鋼等[3]從貴州福泉甕福磷礦礦區(qū)土壤中分離得到了一株能有效提高煤矸石中有效鉀含量的新菌株；宋淼等[4]對草酸青霉分解鉀長石進行了研究，發(fā)現(xiàn)草酸青霉在一定條件下具有較強的解鉀能力。這些研究成果促進了我國難溶性鉀資源的進一步開發(fā)利用，為微生物法分解鉀長石礦物提供了理論支撐和技術(shù)指導，但這些研究僅闡明了硅酸鹽微生物可分解鉀長石礦物，但解鉀能力不強且未對解鉀機理進行研究?；诖耍髡邚哪斥涢L石礦區(qū)作物根系土壤中分離篩選可分解鉀長石的真菌，利用18S rRNA序列分析對其進行鑒定，同時分析其最適生長條件，探討其生長代謝特性，揭示其解鉀機理。

1 實驗

1.1 材料與培養(yǎng)基

土樣，取自某鉀長石礦區(qū)作物根系土壤；鉀長石，用去離子水浸泡24 h，然后用3.0 mol·L-1鹽酸浸泡72 h，再用去離子水洗滌3～5次至pH值呈中性[5]。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，磷酸氫二鉀0.2 g，氯化鈉0.2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸亞鐵0.002 g，硫酸錳0.2 g，氯化鈣0.2 g，硫酸銨0.3 g，二次蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至6.0。

解鉀培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，鉀長石礦粉4 g，氯化鈉0.2 g，硫酸鎂0.2 g，氯化鈣0.2 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鐵0.002 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至6.0。

1.2 分解鉀長石真菌的分離篩選

富集培養(yǎng)：稱土樣10 g，加入100 mL無菌水，充分攪拌，紗布過濾；準確吸取5 mL濾液置于裝有50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，于35 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)2 d；吸取5 mL培養(yǎng)液置于裝有50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(減少了磷酸氫二鉀用量)的新的三角瓶中，于相同條件下進行富集培養(yǎng)。

菌種篩選：吸取200 μL經(jīng)多次富集后的澄清菌液，涂布于解鉀培養(yǎng)基，于35 ℃恒溫培養(yǎng)，并進行多次分離純化。

1.3 分解鉀長石真菌的形態(tài)分析與種屬鑒定

通過顯微鏡觀察篩選得到的分解鉀長石真菌的菌落形態(tài)，并進行種屬鑒定。鑒定引物為：SN1：5′-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3′，SN2：5′-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3′；經(jīng)與NT數(shù)據(jù)庫比對，鑒定菌株的種屬[6-7]。

1.4 分解鉀長石真菌的生理生化性能測試

通過檸檬酸鹽作用實驗、硫化氫產(chǎn)生實驗、明膠水解實驗、淀粉水解實驗、硝酸鹽還原實驗、甲基紅反應、吲哚實驗、過氧化氫酶實驗、乙酰甲基甲醇實驗等測試分解鉀長石真菌的生理生化性能[5,8]。

1.5 分解鉀長石真菌的解鉀機理探究

分別采用X-射線衍射儀和高效液相色譜儀對真菌分解前后的礦粉組成和分解后的代謝產(chǎn)物進行分析，以闡明分解鉀長石真菌的解鉀機理。

2 結(jié)果與討論

2.1 JX-24菌株的形態(tài)

從礦區(qū)土壤中分離篩選到一株可分解鉀長石礦物的真菌，命名為JX-24。其顯微鏡照片如圖1所示。

圖1 JX-24菌株的形態(tài)(放大100倍)Fig.1 Morphology of strain JX-24(×100)

從圖1可知，JX-24菌株表面透明、光滑、隆起突出，且解鉀圈明顯(圖1a)；染色后，可明顯看出JX-24菌株為菌絲較粗且交錯有分隔、分生孢子呈橢圓形的“掃把型”真菌類微生物(圖1b)。

2.2 JX-24菌株的種屬

對JX-24菌株進行18S rRNA序列分析，并利用MEGA 4.0軟件繪制JX-24菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，進而確定JX-24菌株種屬，結(jié)果如圖2所示。

圖2 JX-24菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain JX-24

從圖2可知，分離篩選得到的JX-24菌株為枝孢菌(Cladosporiumsp.)，且與MT093667.1的同源相似性高達99.36%。

2.3 JX-24菌株的最適生長條件

微生物的生長繁殖與其賴以生存的環(huán)境密切相關(guān)，除了維持微生物生長的營養(yǎng)成分外，溫度和pH值起著至關(guān)重要的作用[9-10]。分別在溫度為10～50 ℃、pH值為1.0～10.0的條件下培養(yǎng)JX-24菌株，考察JX-24菌株的最適生長溫度和最適生長pH值，結(jié)果見表1。

從表1可知，JX-24菌株的最適生長溫度為35～40 ℃，最適生長pH值為6.0。

表1 JX-24菌株在不同溫度和pH值下的生長情況

2.4 JX-24菌株的生長代謝特性

JX-24菌株的生理生化性能測試結(jié)果見表2。

從表2可知，JX-24菌株為好氧型真菌類微生物，可進行明膠水解、淀粉水解，但吲哚實驗、過氧化氫酶實驗、乙酰甲基甲醇實驗、甲基紅反應等均為陰性[11-12]。

表2 JX-24菌株的生理生化性能

分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、木糖醇和木糖為培養(yǎng)基碳源培養(yǎng)JX-24菌株，并用于鉀長石的分解，以溶液中可溶性鉀離子含量及鉀浸出率為指標，考察碳源對JX-24菌株解鉀效率的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可知，JX-24菌株可較好地利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、木糖醇和木糖；在同等條件下，不同碳源對JX-24菌株解鉀效率影響較大。當分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、木糖醇和木糖為碳源時，溶液中可溶性鉀離子含量分別為27.12 mg·L-1、24.47 mg·L-1、20.12 mg·L-1、17.77 mg·L-1、16.24 mg·L-1、12.02 mg·L-1和10.77 mg·L-1，鉀浸出率分別為9.72%、8.77%、7.21%、6.37%、5.82%、4.31%和3.86%，其中，以葡萄糖為碳源時，獲得的JX-24菌株分解鉀長石礦物的能力最強。因此，選擇葡萄糖為最佳碳源培養(yǎng)可分解鉀長石真菌。

圖3 碳源對JX-24菌株解鉀效率的的影響Fig.3 Effect of carbon source on potassium-dissolving efficiency of strain JX-24

分別以硫酸銨、硝酸鈉、酵母菌、蛋白胨、賴氨酸和亮氨酸為培養(yǎng)基氮源培養(yǎng)JX-24菌株，并用于鉀長石的分解，以溶液中可溶性鉀離子含量及鉀浸出率為指標，考察氮源對JX-24菌株解鉀效率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 氮源對JX-24菌株解鉀效率的的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on potassium-dissolving efficiency of strain JX-24

從圖4可知，JX-24菌株可較好地利用無機氮硫酸銨和硝酸鈉以及有機氮酵母菌、蛋白胨、賴氨酸和亮氨酸；在同等條件下，不同氮源對JX-24菌株解鉀效率影響較大。當分別以硫酸銨、硝酸鈉、酵母菌、蛋白胨、賴氨酸和亮氨酸為氮源時，溶液中可溶性鉀離子含量分別為：27.04 mg·L-1、23.74 mg·L-1、19.73 mg·L-1、17.88 mg·L-1、15.04 mg·L-1和11.83 mg·L-1，鉀浸出率分別為9.69%、8.51%、7.07%、6.41%、5.39%和4.24%，其中，以硫酸銨為氮源時，獲得的JX-24菌株分解鉀長石礦物的能力最強。因此，選擇硫酸銨為最佳氮源培養(yǎng)可分解鉀長石真菌。

2.5 JX-24菌株的解鉀機理

微生物不同，其分解鉀長石礦物的代謝產(chǎn)物也不同，分泌量也不盡相同，所以微生物的解鉀機理相對復雜，是一個多元化綜合過程。為了闡明JX-24菌株分解鉀長石礦物的作用機理，對分解前后的礦粉組成和分解后的菌株代謝產(chǎn)物進行分析，結(jié)果分別見表3、4。

表3 鉀長石礦物經(jīng)JX-24菌株分解前后的組成分析結(jié)果/%

從表3可知，鉀長石礦粉經(jīng)JX-24菌株溶蝕后，其組成含量變化明顯，尤其是微斜長石含量由分解前的39%降至21%。證實鉀長石礦物中的氧化鉀被JX-24菌株分解。

表4 JX-24菌株分解鉀長石礦物后的代謝產(chǎn)物分析結(jié)果

從表4可知，JX-24菌株在分解鉀長石礦物的過程中代謝產(chǎn)生了檸檬酸、草酸和葡萄糖酸，其中較多的是檸檬酸。同時，也對JX-24菌株代謝產(chǎn)物胞外多糖(EPS)進行了測定，發(fā)現(xiàn)胞外多糖的含量較高，為2.86 mg·L-1。

圖5 JX-24菌株分解鉀長石礦物的歷程Fig.5 Dissolving process of potassium feldspar by strain JX-24

3 結(jié)論

從某鉀長石礦區(qū)作物根系土壤中分離篩選到一株可分解鉀長石的真菌JX-24，經(jīng)18S rRNA序列分析，鑒定其為枝孢菌(Cladosporiumsp.)，與MT093667.1的同源相似性高達99.36%；菌株JX-24屬于好氧型真菌，以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源，最適生長溫度為35～40 ℃，最適生長pH值為6.0；菌株JX-24對鉀長石中微斜長石分解行為顯著，其主要通過代謝產(chǎn)生的胞外多糖及微生物-礦物復合體的協(xié)同作用溶蝕礦物，破壞礦物晶格，進而釋放鉀離子。

(致謝:本研究測試分析工作得到了武漢工程大學測試中心、武漢理工大學分析測試中心和中國地質(zhì)大學分析測試中心的支持和幫助，在此表示感謝！)