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    柴胡龍骨牡蠣湯下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞環(huán)氧合酶-2/前列腺素E2的表達(dá)

    2022-12-28 08:56:26張繼龍笱玉蘭羅利俊
    世界中醫(yī)藥 2022年23期
    關(guān)鍵詞:抗癲癇星形龍骨

    單 萍 張繼龍 笱玉蘭 羅利俊

    (湖北省武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢,430022)

    癲癇是一種全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1],它影響了世界所有地區(qū)的各個(gè)年齡階段的人類(lèi)健康。任何引起大腦生理結(jié)構(gòu)或功能紊亂的因素都能導(dǎo)致癲癇,且可發(fā)生于人的任何階段[2]。癲癇以自發(fā)性發(fā)作為特征[3],其發(fā)作是一種涉及部分或整個(gè)身體的短暫不自覺(jué)顫抖,有時(shí)伴有意識(shí)喪失,且癲癇發(fā)作的強(qiáng)度和頻率都有差異[4]。研究發(fā)現(xiàn),目前抗癲癇藥物已無(wú)法控制20%~30%具有藥物抵抗性的難治性癲癇發(fā)病[5]。因此,尋找具有較好療效且不良反應(yīng)少的抗癲癇藥尤為重要,而中醫(yī)學(xué)可成為抗癲癇藥物的替代品[4]。據(jù)相關(guān)報(bào)道,星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)控制細(xì)胞外空間體積以及離子和神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)突觸的活動(dòng),當(dāng)其出現(xiàn)功能障礙時(shí),可導(dǎo)致神經(jīng)功能發(fā)生重大改變,從而參與了癲癇的發(fā)病機(jī)制[6-7]。柴胡龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》,具有較好的抗癲癇作用,且與柴胡龍骨牡蠣湯的劑量正相關(guān)[8-9]。課題組前期研究結(jié)果顯示:柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)戊四氮(Pentylenetetrazol,PTZ)點(diǎn)燃癲癇小鼠的大腦神經(jīng)元具有保護(hù)作用[10],但柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇的具體作用機(jī)制并未闡明。因此,本研究將使用PTZ刺激小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,用不同劑量的柴胡龍骨牡蠣湯處理后,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)情況,初步探討柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物 選取60只孕20 d的清潔級(jí)小鼠,購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2015-0018,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào):HLK-20181118-02。飼養(yǎng)溫度為22~26 ℃,相對(duì)濕度為50%~60%,人工光照明暗各12 h,自由飲水、飲食。

    1.1.2 藥物 柴胡龍骨牡蠣湯(柴胡12 g,龍骨、黃芩、生姜、鉛丹、人參、桂枝、茯苓、牡蠣各4.5 g,半夏、大黃各6 g,大棗6枚)由我院中藥制劑中心釆用水煮醇提法制備,提取濃縮成含生藥為1 g/mL的柴胡加龍骨牡蠣湯,置于冰箱中備用。

    1.1.3 材料與儀器 PTZ(美國(guó)Sigma公司,美國(guó),貨號(hào):P6500-25G);杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium,DMEM)(美國(guó)Hyclone公司,美國(guó),貨號(hào):SH30022.01B);胎牛血清(美國(guó)Gibco公司,美國(guó),貨號(hào):10270-106);0.25%胰蛋白酶、抗熒光衰減封片劑(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)、小鼠前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分析試劑盒和小鼠環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(中國(guó)Bioswamp公司,貨號(hào):PAB180002、PAB180018、MU30391、MU30589);小鼠抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)單克隆抗體、兔抗COX-2多克隆抗體和兔抗PGE2受體(Prostaglandin E Receptor 2,PTGER2)(英國(guó)Abcam公司,英國(guó),貨號(hào):ab10062、ab52237、ab167171);兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體(美國(guó)CST公司,美國(guó),貨號(hào):2118);聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜和化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)Millipore公司,美國(guó),貨號(hào):IPVH00010、WBKLS0010)。超凈工作臺(tái)(蘇州金凈凈化設(shè)備公司,型號(hào):SW-CJ-2D);顯微鏡(日本Nikon公司,型號(hào):TS100-F);熒光顯微鏡(日本Olympus公司,日本,型號(hào):AX53);酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司,芬蘭,型號(hào):MK3);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司,型號(hào):Tanon-5200)。

    1.2 方法

    1.2.1 小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞分離及培養(yǎng) 取孕20 d的清潔級(jí)小鼠,處死后取出胎鼠,乙醇消毒后取出海馬組織于含DMEM的離心管中。將組織剪成1 mm3的組織塊,0.25%胰蛋白酶消化后,加入含10%胎牛血清的DMEM終止消化,175× g,離心5 min,棄上清,并用DMEM重懸細(xì)胞。使用200目孔徑的不銹鋼網(wǎng)除去未消化組織,收集細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM中,培養(yǎng)90 min后采用差速貼壁分離技術(shù)去除成纖維細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL,接種于培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換液,以后隔3 d換1次。待細(xì)胞融合達(dá)70%~80%時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    1.2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定 將單細(xì)胞懸液接種于放置有細(xì)胞爬片的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)過(guò)夜。取出培養(yǎng)皿,磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗后加入4%多聚甲醛固定30 min。加入0.5% Triton X-100室溫通透20 min,再加入5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)封閉1 h。加入一抗稀釋液(GFAP稀釋比1∶100),4 ℃孵育過(guò)夜,PBS清洗后加入二抗稀釋液,室溫孵育1 h后,PBS清洗。取一塊干凈的載玻片,滴一滴抗熒光衰減封片劑(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)。用鑷子取出蓋玻片,吸去多余的液體,細(xì)胞朝下,貼在載玻片上,置于熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.3 分組及處理 將鑒定成功的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞以5×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)48 h后,采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為4組:對(duì)照組、PTZ組、PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯低劑量組和PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組。PTZ組采用10 mmol/L的PTZ刺激細(xì)胞2 h。PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯低劑量組和PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組細(xì)胞在10 mmol/L PTZ刺激2 h后,分別采用10 mg/L和20 mg/L的柴胡龍骨牡蠣湯預(yù)處理細(xì)胞6 h,再用10 mmol/L PTZ刺激2 h。

    1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)COX-2/PGE2水平 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清于450 nm處的光密度(Optical Density,OD)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到直線回歸方程式后計(jì)算各組細(xì)胞培養(yǎng)液中COX-2和PGE2濃度,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

    1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)COX-2/PGE2表達(dá)水平 采用放射免疫沉淀試驗(yàn)(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解試劑盒(材料部分未提及)提取各組細(xì)胞總蛋白,蛋白定量后取20 μg上樣,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗稀釋液(COX-2稀釋比:1∶1 000;PTGER2稀釋比:1∶5 000;GAPDH稀釋比:1∶1 000),室溫孵育1 h。清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG,室溫孵育1 h后清洗。將膜置于暗室中,加入化學(xué)發(fā)光試劑,于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1 小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定 分離培養(yǎng)的小鼠原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),大部分細(xì)胞胞突外伸,且長(zhǎng)短不一。見(jiàn)圖1A。免疫熒光染色顯示,細(xì)胞呈GFAP陽(yáng)性表達(dá),鑒定細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞。見(jiàn)圖1B。

    圖1 海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)

    2.2 柴胡龍骨牡蠣湯對(duì)COX-2和PGE2的影響 與對(duì)照組比較,PTZ組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的COX-2和PGE2濃度顯著升高(P<0.01);與PTZ組比較,PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯低劑量組、PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的COX-2和PGE2濃度均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.01),且PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組更明顯(P<0.01),有劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

    表1 各組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中COX-2和PGE2濃度比較

    與對(duì)照組比較,PTZ組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞COX-2/PTGER2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。而經(jīng)過(guò)柴胡龍骨牡蠣湯干預(yù)后,顯著抑制了PTZ組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)COX-2/PTGER2的蛋白表達(dá)水平(P<0.01),且有一定的劑量依賴(lài)性,PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組效果更明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2。

    表2 各組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞COX-2和PTGER2蛋白表達(dá)水平比較

    3 討論

    由于長(zhǎng)期服用西藥抗癲癇,產(chǎn)生多種不良反應(yīng),導(dǎo)致部分患者不能耐受,使得中藥治療癲癇受到了醫(yī)學(xué)界越來(lái)越多的關(guān)注[11]。大量研究顯示中醫(yī)藥在抗癲癇方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[12-15]。柴胡加龍骨牡蠣湯可協(xié)調(diào)陰陽(yáng)、祛痰調(diào)氣、定志攝神,令癇癥不作[9]。研究顯示,柴胡龍骨牡蠣湯具有多系統(tǒng)、多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),有較好的抗癲癇療效[16-17]。柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇作用機(jī)制的研究報(bào)道較少,因此,本研究對(duì)其抗癲癇機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

    癲癇發(fā)作后會(huì)發(fā)生星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,而激活后的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥介質(zhì)等,對(duì)神經(jīng)元具有毒性作用,進(jìn)而在癲癇、帕金森病、缺血性腦損傷等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[18]。因此,星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化可作為癲癇的病理標(biāo)志,可能成為藥物治療癲癇的新靶點(diǎn)[19]。前期研究發(fā)現(xiàn),PTZ可誘導(dǎo)小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,本研究在PTZ誘導(dǎo)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步檢測(cè)了星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)COX-2/PGE2的表達(dá)。

    COX-2是炎癥反應(yīng)激活指標(biāo),在癲癇發(fā)作過(guò)程中,COX-2表達(dá)上調(diào),其過(guò)度表達(dá)通常與急性條件下的神經(jīng)毒性和組織損傷有關(guān)[20-21]。COX-2激活后可促進(jìn)癲癇活動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷死亡,降低癲癇發(fā)作的閾值,進(jìn)而促進(jìn)癲癇的反復(fù)發(fā)作,而阻斷COX-2的信號(hào)級(jí)聯(lián)后可提高抗癲癇藥物的腦滲透能力并克服耐藥性[22-23]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示COX-2與難治性癲癇有密切的關(guān)系,干預(yù)COX-2炎癥反應(yīng)通路可能成為治療難治性癲癇的治療方向[24]。組織受損誘發(fā)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致大量花生四烯酸釋放,而COX可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素[25]。PGE2作為COX-2炎癥反應(yīng)通路中一種重要的炎癥效應(yīng)物,在多種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括癲癇)中,通過(guò)其受體亞型EP2(前列腺素類(lèi)激素受體)介導(dǎo)大腦炎癥和組織損傷[21]。Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn),COX-2/PGE2信號(hào)通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷是PTZ點(diǎn)燃癲癇小鼠認(rèn)知功能障礙的原因之一,認(rèn)為在癲癇患者的大腦中靶向COX-2/PGE2信號(hào)通路可能會(huì)產(chǎn)生減輕神經(jīng)元損傷和預(yù)防認(rèn)知功能障礙的效果。本研究結(jié)果顯示,PTZ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)COX-2/PGE2通路表達(dá)顯著升高,經(jīng)過(guò)不同劑量的柴胡龍骨牡蠣湯治療后,COX-2、PGE2表達(dá)下調(diào),柴胡龍骨牡蠣湯高劑量效果更明顯,提示柴胡龍骨牡蠣湯可有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)COX-2/PGE2信號(hào)通路的表達(dá)水平。

    綜上所述,柴胡龍骨牡蠣湯可下調(diào)PTZ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞COX-2/PGE2信號(hào)通路的表達(dá),該作用可能參與了柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇的作用機(jī)制。

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