瑞德西韋對(duì)狂犬病病毒的體外抑制作用研究

遲瑛琳，劉錚然，謝 淵，劉淑清，朱武洋

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)引起的一種動(dòng)物源性傳染病，感染后發(fā)病主要表現(xiàn)為恐風(fēng)、恐水、咽肌痙攣、進(jìn)行性癱瘓等特征。因狂犬病發(fā)病而報(bào)告的死亡人數(shù)，一直位于我國(guó)法定傳染病報(bào)告死亡人數(shù)的前列，作為一種可防不可治的烈性傳染病，對(duì)人類(lèi)健康安全有著極大的威脅[1]。隨著抗病毒藥物的不斷創(chuàng)新與精進(jìn)，許多病毒性疾病如乙肝、丙肝、艾滋病已得到有效控制，甚至埃博拉病毒的藥物治療也有積極的效果[2]。目前仍沒(méi)有有效治療狂犬病的療法和抗病毒藥物，狂犬病疫苗、免疫球蛋白、密爾沃基療法[3]均不能百分百阻斷病毒的感染，因此找到有效而合理的治療狂犬病的方法成為狂犬病防治的熱點(diǎn)之一。

瑞德西韋是一種RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RdRp)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其作為一種有活性的腺苷核苷酸類(lèi)似物，可在體內(nèi)代謝活化為三磷酸腺苷，在病毒RNA合成的過(guò)程中與RNA聚合酶結(jié)合，插入到正在合成的病毒RNA中從而終止病毒RNA的合成，使病毒失去致病毒力[4]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)瑞德西韋對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征及中東呼吸綜合征均有顯著的抗病毒活性，對(duì)新型冠狀病毒也具有一定的抗病毒效果[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)以不同狂犬病病毒CVS-11及SC16體外感染BHK-21及N2a細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^(guò)藥物與病毒直接作用、預(yù)防性用藥以及治療性用藥3種給藥方式，分析瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒是否具有阻斷病毒吸附、抑制病毒復(fù)制或直接殺傷的作用，從而為尋找有效的狂犬病治療藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 倉(cāng)鼠腎細(xì)胞的克隆細(xì)胞BHK-21，小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2a由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液：用Dulbecco’s MEM，GIBCO BRL配制，含100 mL/L小牛血清，10 mL/L雙抗。細(xì)胞維持液：用Dulbecco’s MEM，GIBCO BRL配制，含20 mL/L小牛血清。CVS-11 是一株經(jīng)典的狂犬病病毒，為CVS毒株經(jīng)BHK-21 細(xì)胞適應(yīng)后的固定毒株，具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性，在快速熒光灶抑制試驗(yàn)中被用作標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株使用，由本實(shí)驗(yàn)室保存；狂犬病毒街毒株SC16分離于2016年四川1只狂犬病病死犬腦內(nèi)，經(jīng)過(guò)鼠腦傳代、適應(yīng)N2a細(xì)胞生長(zhǎng)并獲得較高的滴度，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 瑞德西韋購(gòu)買(mǎi)自MCE公司，批號(hào)HY-104077。瑞德西韋儲(chǔ)存液：將瑞德西韋用DMSO(二硝基亞砜)配成100 mmol/L的儲(chǔ)備液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩MEM 高糖培養(yǎng)液、胰酶、雙抗、胎牛血清均購(gòu)自GIBCO公司；抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體，購(gòu)自美國(guó)Fujirebio Diagnostics公司；GoTaq probe-1-Step RT-qPCR mix 購(gòu)自promega公司。細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Counting Kit,CCK8)購(gòu)自東仁化學(xué)科(上海)技有限公司。倒置顯微鏡為日本奧林巴斯CXX4I型；熒光顯微鏡為日本奧林巴斯IX51型，Realtime-PCR 儀器為ABI QuantStudio 5，酶標(biāo)儀為FLUOstar Omega 415-2683，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，購(gòu)自美國(guó)ORFLO Technologies公司。

1.2 方 法

1.2.1 藥物對(duì)細(xì)胞活力的毒性測(cè)定 在BHK-21和N2a細(xì)胞上加入終濃度為0(DMSO對(duì)照組)、100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L、2 000 μmol/L的瑞德西韋處理細(xì)胞4 h，同時(shí)設(shè)置CCK-8的對(duì)照，按照 CCK-8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值即為OD值，通過(guò)運(yùn)用OD值計(jì)算細(xì)胞存活率從而表示藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響，公式為：[(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100%。

1.2.2 病毒滴度測(cè)定 將BHK-21或N2a細(xì)胞按細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所得的按一定比例鋪在96孔板中在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)滿(mǎn)單層細(xì)胞。依次將待測(cè)病毒液CVS-11及SC16分別進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)瑥?0-1到10-12，將稀釋好的病毒液依次加入鋪好細(xì)胞的96孔板內(nèi)，每孔100 μL病毒液，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)重復(fù)孔。將病毒液與細(xì)胞均勻混合后放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)[6]，最后用Reed-Muench方法計(jì)算病毒滴度[7]。

1.2.3 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)RABV滴度的測(cè)定 使用不同劑量的瑞德西韋按照上述要求處理不同狂犬病病毒感染的N2a細(xì)胞，收集病毒感染48 h的細(xì)胞，按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit試劑盒要求提取總RNA，測(cè)定RNA 濃度。根據(jù)GenBank上公布RV的N蛋白基因序列，利用Premiers 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和TaqMan探針，引物和探針由擎科生物科技有限公司合成，引物探針序列標(biāo)準(zhǔn)品制備方法等見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。參照GoTaq○RProbe 1-Step RT-qPCR System試劑盒說(shuō)明書(shū)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，利用狂犬病病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)N2a細(xì)胞中狂犬病病毒 mRNA水平。

1.2.4 瑞德西韋對(duì)狂犬病病毒吸附的阻斷作用 將N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞按照 5×105/孔密度接種于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Agostini ML等人研究發(fā)現(xiàn)瑞德西韋在非典型肺炎病毒和中東呼吸綜合癥病毒感染前及感染后2 h之間有最佳抑制病毒效果[9]，故在N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞中分別加入終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L瑞德西韋預(yù)孵育細(xì)胞2 h，加入MOI(Multiplicity of Infection)=5的CVS-11在細(xì)胞上吸附1 h，去除未吸附的病毒和藥物，加入培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)48 h。采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)，確定瑞德西韋的有效抑制濃度。由于之前已有文獻(xiàn)報(bào)道法匹拉韋有一定的抗狂犬病病毒的效果[10]，因此本實(shí)驗(yàn)中加入相應(yīng)濃度的法匹拉韋做為陽(yáng)性對(duì)照藥物，并設(shè)病毒單獨(dú)感染的DMSO對(duì)照組，每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。為探索瑞德西韋阻斷狂犬病病毒吸附的效果，將N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞按照5×105/孔密度接種于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使用最佳抑制濃度的瑞德西韋分別預(yù)孵育N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞2、4、6 h，加入MOI=5的CVS-11在細(xì)胞上吸附1 h，去除未吸附的病毒和藥物，加入培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)48 h。采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)，確定瑞德西韋阻斷狂犬病病毒吸附的最佳時(shí)間，每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。為探索瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的預(yù)防性作用，本實(shí)驗(yàn)使用最佳抑制濃度的瑞德西韋采用最佳時(shí)間預(yù)孵育N2a細(xì)胞，加入MOI=5的街毒株SC16感染N2a細(xì)胞上吸附1 h，去除未吸附的病毒和藥物，加入培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)48 h。采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)。設(shè)病毒單獨(dú)感染的DMSO對(duì)照組；同時(shí)采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)瑞德西韋對(duì)CVS-11及SC16 mRNA 水平的影響，確定瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的預(yù)防性作用，每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 瑞德西韋對(duì)狂犬病毒復(fù)制的抑制作用 將N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞按照 5×105/孔密度接種于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以MOI=5的CVS-11分別吸附N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞1 h后，棄去上清用DMEM洗滌3次，分別加入終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L瑞德西韋處理細(xì)胞48 h后，采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)，確定瑞德西韋的有效抑制濃度。并加入相應(yīng)濃度的法匹拉韋做陽(yáng)性對(duì)照藥物，并設(shè)病毒單獨(dú)感染的DMSO對(duì)照組，每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。為探索瑞德西韋對(duì)狂犬病毒抑制的有效時(shí)間，分別在CVS-11感染N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞1、2、3、4、6 h后，加入最適抑制濃度的瑞德西韋培養(yǎng)48 h后，采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)，每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。為探索瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的抑制作用，將街毒株SC16感染N2a細(xì)胞，加入相應(yīng)濃度的瑞德西韋培養(yǎng)48 h后，采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)；同時(shí)采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)瑞德西韋對(duì)CVS-11及SC16 mRNA 水平的影響，確定瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的抑制作用，每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 瑞德西韋對(duì)病毒的直接殺傷作用 將N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞按照 5×105/孔密度接種于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將500 μmol/L的瑞德西韋與MOI=5的CVS-11和SC16毒株混合孵育1 h[9]，將藥物與病毒的混合液分別處理N2a和BHK-21細(xì)胞1 h，去除未吸附的病毒和藥物，加入培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)48 h后，采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)，確定瑞德西韋直接殺滅狂犬病病毒的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 瑞德西韋對(duì)BHK-21及N2a細(xì)胞的毒性作用 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞存活率計(jì)算公式所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明，瑞德西韋在100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L內(nèi)未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用，但在1 000 μmol/L和2 000 μmol/L的作用后，細(xì)胞折光性變差，細(xì)胞變圓，脫落，有顯著的細(xì)胞毒性作用。藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用在500 μmol/L之后隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率降低。故本實(shí)驗(yàn)選擇的安全作用濃度為500 μmol/L。

注：*為1 000 μmol/L瑞德西韋與0 μmol/L瑞德西韋相比，對(duì)N2a細(xì)胞(A)或BHK-21細(xì)胞(B)存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，**為2 000 μmol/L瑞德西韋與0 μmol/L瑞德西韋相比，對(duì)N2a細(xì)胞(A)或BHK-21細(xì)胞(B)存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖1 不同濃度瑞德西韋對(duì)N2a細(xì)胞(A)BHK-21細(xì)胞(B)存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of remdesivir on cell viability in N2a(A)and BHK-21(B)

2.2 病毒的滴度測(cè)定 按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)感染量(TCID50)，經(jīng)Reed-Muench方法計(jì)算，在BHK-21細(xì)胞系感染中CVS-11的TCID50為106.56/0.1 mL，SC16的TCID50為104.19/0.1 mL，在N2a細(xì)胞系感染中CVS-11的TCID50為105.87/0.1 mL，SC16的TCID50為105.69/0.1 mL 并用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞數(shù)量根據(jù)MOI=病毒滴度/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)確立CVS-11及SC16感染兩種細(xì)胞系的MOI值為5。

2.3 瑞德西韋抑制狂犬病病毒的吸附作用 通過(guò)不同濃度100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L的瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞后，與CVS-11病毒感染組相比，500 μmol/L和1 000 μmol/L的瑞德西韋處理組N2a細(xì)胞綠色熒光標(biāo)記的病毒粒子減少(t500=43.30，t1000=60.98，均P<0.01)，表明500 μmol/L及以上濃度瑞德西韋能夠抑制CVS-11的感染；與相應(yīng)濃度的T705陽(yáng)性對(duì)照組相比，瑞德西韋處理N2a細(xì)胞中CVS-11病毒粒子的熒光強(qiáng)度降低(t=41.86，P<0.01)(圖2)；不同濃度100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L的瑞德西韋預(yù)處理BHK-21細(xì)胞后與上述結(jié)果基本趨于一致(圖3)。介于1 000 μmol/L的瑞德西韋有明顯的細(xì)胞毒性，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用500 μmol/L為最適藥物濃度。

注：A. DMSO(CVS-11單獨(dú)感染)組， B. 500 μmol/L瑞德西韋處理組，C. 1 000 μmol/L T705處理組，D為不同濃度瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞對(duì)CVS-11病毒滴度的影響，500 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比，對(duì)CVS-11病毒感染N2a細(xì)胞的滴度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05；1 000 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比，對(duì)CVS-11病毒感染N2a細(xì)胞的水平極差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P<0.01。A、B、C放大倍數(shù)：100×圖2 不同濃度瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞對(duì)CVS-11病毒吸附的影響Fig.2 Effects of remdesivir at different concentrations on CVS-11 in N2a cells

注：A. DMSO(CVS-11單獨(dú)感染)組， B. 500 μmol/L瑞德西韋處理組，C. 1 000 μmol/L T705處理組，D為不同濃度瑞德西韋預(yù)處理BHK-21細(xì)胞對(duì)CVS-11病毒滴度的影響，500 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比，對(duì)CVS-11病毒感染BHK-21細(xì)胞的滴度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05；1 000 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比，對(duì)CVS-11病毒感染BHK-21細(xì)胞的水平極差異，**P<0.01。A、B、C放大倍數(shù)：100×圖3 不同濃度瑞德西韋預(yù)處理BHK-21細(xì)胞對(duì)CVS-11病毒滴度的影響Fig.3 Effects of pretreatment with remdesivir at different concentrations on CVS-11 titer in BHK-21 cells

通過(guò)500 μmol/L瑞德西韋在不同時(shí)間2、4、6 h預(yù)處理N2a細(xì)胞后，與CVS-11病毒感染組相比，瑞德西韋預(yù)孵育N2a細(xì)胞2 h后綠色熒光標(biāo)記的CVS-11病毒粒子減少(t=96.38，P<0.01)，隨著預(yù)加藥時(shí)間的延長(zhǎng)，4 h和6 h預(yù)處理組相較之2 h預(yù)處理組對(duì)病毒滴度抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t4 h=1.08，t6 h=7.62，均P>0.05)(圖4)，瑞德西韋在不同時(shí)間預(yù)處理BHK-21細(xì)胞后與上述結(jié)果基本趨于一致(圖5)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)預(yù)處理N2a細(xì)胞選擇最短預(yù)處理時(shí)間2 h。

圖4 瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞不同處理時(shí)間對(duì)CVS-11病毒滴度的影響Fig.4 Effects of remdesivir with different treatment times on CVS-11 in N2a cells

通過(guò)與CVS-11和街毒株SC16病毒感染組相比，500 μmol/L瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞2 h后病毒滴度降低(tcos-11=75.48，tsc16=47.83，均P<0.01)(圖6)；通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與CVS-11病毒感染組或SC16病毒感染組相比，500 μmol/L瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞2 h后病毒mRNA拷貝數(shù)均降低(tcvs-11=183.82，tsc16=82.60，均P<0.01)(圖7)，提示瑞德西韋可以在體外有效抑制狂犬病病毒mRNA水平的表達(dá)。

圖5 瑞德西韋預(yù)處理BHK-21細(xì)胞不同處理時(shí)間對(duì)CVS-11病毒滴度的影響Fig.5 Effects of remdesivir with different times on CVS-11 in BHK-21 cells

圖6 瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞對(duì)CVS-11/SC16毒株的影響Fig.6 Effects of remdesivir on CVS-11 or SC16 in N2a cells

圖7 瑞德西韋預(yù)加藥對(duì)不同毒株mRNA水平的影響Fig.7 Effects of remdesivir on CVS-11/SC16 mRNA levels in N2a cells

2.4 瑞德西韋體外抑制狂犬病病毒的復(fù)制 與CVS-11病毒感染組相比，不同濃度100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L的瑞德西韋處理N2a細(xì)胞后，500 μmol/L和1 000 μmol/L的瑞德西韋處理組病毒滴度降低(t500=85.11，t1000=100.52，均P<0.01)，與相應(yīng)濃度的T705陽(yáng)性對(duì)照組相比，瑞德西韋處理N2a細(xì)胞中CVS-11病毒粒子的熒光強(qiáng)度也降低(t=61.15，P<0.01)(圖8)，表明500 μmol/L及以上濃度瑞德西韋能夠有效抑制CVS-11的復(fù)制；不同濃度100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L的瑞德西韋處理BHK-21細(xì)胞后與上述結(jié)果基本一致(圖9)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用500 μmol/L為最適藥物濃度。

注：A. DMSO(CVS-11單獨(dú)感染)組， B. 500 μmol/L瑞德西韋處理組，C. 1000 μmol/L T705處理組，D為CVS-11感染后不同濃度瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響。*P<0.05，**P<0.01。A、B、C放大倍數(shù)：100×圖8 CVS-11感染后不同濃度瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.8 Effects of remdesivir at different concentrations in N2a cells after CVS-11 infection

注：A. DMSO(CVS-11單獨(dú)感染)組， B. 500 μmol/L瑞德西韋處理組，C. 1 000 μmol/L T705處理組，D為CVS-11感染后不同濃度瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響。500 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比，對(duì)CVS-11病毒感染BHK-21細(xì)胞的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05；1 000 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比，對(duì)CVS-11病毒感染BHK-21細(xì)胞的影響極差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P<0.01。A、B、C放大倍數(shù)：100×圖9 CVS-11感染后不同濃度瑞德西韋處理BHK-21細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.9 Effects of remdesivir at different concentrations in BHK-21 cells after CVS-11 infection

CVS-11病毒感染后分別在1、2、3、4、6 h加入瑞德西韋處理N2a細(xì)胞，與CVS-11病毒感染組相比，瑞德西韋在感染1、2、3、4 h后病毒滴度均下降(t1 h=44.89，t2 h=90.66，t3 h=68.07，t4 h=69.88，均P<0.01)，CVS-11感染6h后加入瑞德西韋后病毒滴度有一定程度回升(t=5.09，P<0.05)(圖10)，CVS-11病毒感染后分別在1～4 h加入瑞德西韋處理BHK-21細(xì)胞后與上述結(jié)果趨于一致(圖11)。提示CVS-11感染1～4 h內(nèi)加入瑞德西韋即有較好的抑制病毒復(fù)制的效果，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇狂犬病毒感染1 h后加入瑞德西韋處理細(xì)胞。

圖10 CVS-11感染后不同時(shí)間瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.10 Effects of remdesivir treatment for different times in N2a cells after CVS-11 infection

圖11 CVS-11感染后不同時(shí)間瑞德西韋處理BHK-21細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.11 Effects of remdesivir treatment for different times in BHK-21 cells after CVS-11 infection

通過(guò)與CVS-11和街毒株SC16病毒感染組相比，500 μmol/L瑞德西韋處理N2a細(xì)胞后病毒滴度降低(tcvs-11=76.16，tsc16=90.12，均P<0.01)(圖12)；通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與CVS-11病毒感染組或SC16病毒感染組相比，500 μmol/L瑞德西韋處理N2a細(xì)胞后病毒mRNA拷貝數(shù)均降低(tcvs-11=32.55，tsc16=45.30，均P<0.01)(圖13)提示瑞德西韋可以在體外有效抑制狂犬病病毒mRNA水平的復(fù)制。

圖12 CVS-11/SC16感染后瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.12 Effects of remdesivir in N2a cells after SC16 or CVS-11 infection

圖13 不同毒株感染后瑞德西韋處理細(xì)胞對(duì)RABV mRNA水平的影響Fig.13 Effects of remdesivir on RABV mRNA levels in N2a cells after CVS-11/SC16 infection

2.5 瑞德西韋體外直接殺傷狂犬病病毒的作用 通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)瑞德西韋對(duì)狂犬病病毒毒株CVS-11和SC16的影響，結(jié)果顯示：與CVS-11單獨(dú)感染組和SC16單獨(dú)感染組相比， 500 μmol/L瑞德西韋處理N2a細(xì)胞后CVS-11或SC16病毒含量均無(wú)明顯降低作用(圖14)，表明瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒均無(wú)直接殺傷作用。

圖14 瑞德西韋和不同毒株直接作用后對(duì)病毒滴度的影響Fig.14 Direct killing effect of remdesivir on CVS-11/SC16

3 討 論

目前狂犬病在全球廣泛分布，除南極洲外，所有大陸均有人間狂犬病報(bào)告。進(jìn)入21世紀(jì)以后，每年約造成59 000人死亡[12]，是致死人數(shù)最多的動(dòng)物源性傳染病。我國(guó)也是世界范圍內(nèi)疫情最為嚴(yán)重的疫區(qū)之一。由于抗病毒藥物的研制起步較晚，臨床上能有效地治療病毒性疾病的藥物十分匱乏，長(zhǎng)期以來(lái)，無(wú)特異性的狂犬病病毒感染的治療方案。廣譜抗病毒藥物利巴韋林是一種鳥(niǎo)嘌呤核苷酸類(lèi)似物，在體外實(shí)驗(yàn)中利巴韋林濃度在6.3～50 μmol/L時(shí)有良好的抑制狂犬病病毒復(fù)制的效果[13]。但臨床研究表明，長(zhǎng)期服用利巴韋林會(huì)使白細(xì)胞水平降低，產(chǎn)生骨髓抑制等不良反應(yīng)[14]。法匹拉韋(T705)也是一種核苷類(lèi)似物的廣譜抗病毒藥物，它經(jīng)口服后會(huì)形成嘌呤類(lèi)似物會(huì)競(jìng)爭(zhēng)病毒的RNA聚合酶。T705的核苷三磷酸化合物還會(huì)插入病毒的RNA鏈中導(dǎo)致病毒的突變，從而發(fā)揮抑制病毒的效果[15]。但是T705用量較大，毒副作用較大，在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肝功能障礙的患者會(huì)出現(xiàn)血藥濃度增加和尿酸升高的情況[10]，因此篩選高效低毒的抗病毒藥物是今后抗病毒研究熱點(diǎn)之一。

瑞德西韋(remdesivir，GS-5734)是Gilead Sciences公司正在研發(fā)中的一個(gè)廣譜抗病毒藥物[16]，作為核苷類(lèi)RNA 依賴(lài)的RNA 聚合酶(RdRp)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[17-18]，瑞德西韋在細(xì)胞水平上能有效抑制新型冠狀病毒[17-18]、冠狀病毒、丙肝病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒和埃博拉病毒等[13,16]。2020年Wit RD等人，也建立了恒河猴動(dòng)物模型進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)瑞德西韋能有效抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒的增殖[19]。可見(jiàn)瑞德西韋在抗病毒的治療中具有極大的潛力，但目前為止，瑞德西韋在體外抑制狂犬病病毒的效果尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用BHK-21和N2a兩種細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，3種不同的給藥方式(方式一：預(yù)防給藥；方式二：治療給藥；方式三：直接殺傷)下瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的抑制作用存在著一定差異，預(yù)防性用藥及治療性用藥方式比藥物與病毒直接作用的方式更好；在這兩種抗病毒細(xì)胞模型中，瑞德西韋的體外抑制效果均優(yōu)于T705，并在使用劑量達(dá)到500 μmol/L的情況下，未發(fā)現(xiàn)明顯細(xì)胞損傷加重的情況。瑞德西韋通過(guò)進(jìn)入宿主細(xì)胞后代謝為具有藥理活性的三磷酸核苷(nucleoside triphosphate，NTP)[10,17]，并通過(guò)摻入新生的病毒RNA轉(zhuǎn)錄物中導(dǎo)致其過(guò)早終止，進(jìn)而抑制了RdRp 催化的RNA合成，從而抑制了病毒的復(fù)制過(guò)程，最終實(shí)現(xiàn)抑制病毒的繁殖[5,18]，因此我們推測(cè)瑞德西韋可能主要通過(guò)影響病毒吸附細(xì)胞表面或直接殺傷細(xì)胞, 以阻斷病毒的穿入，達(dá)到預(yù)防病毒感染的作用，也可以通過(guò)治療性用藥達(dá)到抑制病毒復(fù)制的效果。后續(xù)為了觀(guān)察瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的體外抑制效果，模擬更接近自然感染狀態(tài)下的真實(shí)情況，我們選擇了街毒株SC16在神經(jīng)元細(xì)胞系N2a上進(jìn)行進(jìn)一步的研究，結(jié)果顯示瑞德西韋能夠在街毒株感染時(shí)具有顯著的抑制效果，在一定程度上阻斷病毒吸附，抑制病毒的復(fù)制增殖，保護(hù)細(xì)胞不受病毒侵害；結(jié)果進(jìn)一步表明瑞德西韋應(yīng)用于狂犬病病毒體外抑制時(shí)有較好的預(yù)期效果。與此同時(shí)，瑞德西韋的臨床前安全性試驗(yàn)顯示，瑞德西韋對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)很低，而且是非遺傳毒性[20-21]。其安全性高、毒副作用小，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

狂犬病作為一種可防不可治的烈性傳染病，目前仍沒(méi)有有效的發(fā)病后治療藥物，本研究結(jié)果表明瑞德西韋對(duì)不同毒株的狂犬病病毒均有較為理想的抑制作用，是一種潛在的抗狂犬病病毒的備選藥物，為進(jìn)一步的研究使用抗病毒藥物對(duì)狂犬病病毒的治療研究提供了參考價(jià)值。

利益沖突：無(wú)