單純皰疹病毒疫苗的研究進展

梁子騰 綜述，黃維金，王佑春 審校

1.中國食品藥品檢定研究院 國家衛(wèi)生健康委員會生物技術產品檢定方法與標準化重點實驗室 國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質量研究與評價重點實驗室，北京 102629；2.北京協和醫(yī)學院研究生院，北京 100730

近年來，流行病學調查顯示，由于人類感染單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）而導致的口唇皰疹、咽炎、生殖器皰疹等疾病的發(fā)病率仍處于高位。HSV 包括HSV-1 和HSV-2 兩種血清型［1］。目前每年約有1.4 億人感染HSV-1，5 億人感染HSV-2［2］，且病例數呈逐年上升趨勢。HSV-1 和HSV-2 均屬于皰疹病毒家族中的α 亞科，是具有包膜結構的雙鏈DNA病毒。HSV-1的基因組長度為125 000 ～240 000 bp，主要引起口、面部、咽部感染，嚴重者可表現為散發(fā)性腦炎等重大疾病。有文獻報道，HSV-1 減毒活疫苗VC2在生殖器皰疹豚鼠模型中提供了對HSV-2生殖器感染的保護，疫苗在2個HSV血清型間有一定的交叉保護作用［3］。HSV-2的基因組長度為154 000 bp，主要導致生殖器皰疹，每年報告的HSV-2感染新病例約為2 300萬［4］。有研究表明，HSV-2感染者艾滋病的發(fā)病率顯著增加［2］，且對于女性患者，與宮頸癌的發(fā)生也密切相關［5］。由于HSV獨特的感染特點和免疫逃逸機制，且目前全球范圍內尚無HSV疫苗獲批上市，因此，研發(fā)HSV疫苗顯得尤為重要。本文對國內外HSV疫苗的研究進展及其研制過程中可能存在的局限性作一綜述。

1 HSV感染及特點

HSV 的感染分為原發(fā)性感染、潛伏感染與復發(fā)，原發(fā)性感染即患者在感染HSV 后，該病毒在感染的組織及其周圍增殖，形成的病灶為原發(fā)性感染灶［5］。之后，病毒通過神經細胞軸突向感覺神經節(jié)傳遞形成潛伏性感染。有學者認為，HSV 潛伏感染時，其基因組的結構和功能均完好無損，只是暫停了病毒基因的轉錄和表達相關的一系列調控［6］。HSV 增殖后，最終以核衣殼的形式存在于被根神經節(jié)。當受到外界環(huán)境（紫外線照射或化學物質刺激等）影響時，可引起HSV 的復發(fā)感染。目前已知的HSV 上有12種糖蛋白：gB、gC、gD、gE、gG、gI、gH、gJ、gK、gL、gM和gN［7］。研究者基于HSV 的生物學特點、潛伏感染的機制等開發(fā)改造HSV疫苗。

根據病毒的感染特點，HSV疫苗可分為預防性疫苗和治療性疫苗。預防性疫苗的接種對象是健康人群，防止病毒的入侵，主要針對HSV的原發(fā)性感染，在皮膚和黏膜表面建立病毒防御，阻止病毒向感覺神經節(jié)的入侵，抑制病毒形成潛伏性感染。治療性疫苗的接種對象是已被病毒感染的人群，目的是緩解患者的臨床癥狀，達到治療或防止病情惡化的效果。

2 HSV疫苗

HSV疫苗按照其特點、形成和作用機理，可分為減毒活疫苗、核酸疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程活病毒疫苗、合成肽疫苗和抗獨特型疫苗，見表1。有文獻表明，抗獨特型疫苗可在一定程度上抵抗HSV的入侵［8］，但也有實驗表明，抗獨特型疫苗并未起到明顯作用，反而增強了HSV的致病能力［9］，之后對該類疫苗鮮有報道。

表1 HSV疫苗臨床試驗狀態(tài)Tab.1 Clinical trials of HSV vaccines

2.1 減毒活疫苗 減毒活疫苗刪除了病毒的致病基因，使其毒性減弱，接種后可刺激機體體液及細胞免疫應答，部分還可引起黏膜免疫，由于其副作用小，安全性高［8］等特點，HSV 減毒活疫苗的研發(fā)被寄予厚望，但其安全性還與宿主的機體免疫力、毒株本身返祖而重新獲得致病力［10］密切相關。

最初，TK基因是研發(fā)減毒活疫苗的首選基因，在HSV-1F基因中敲除一段基因得到2 個基因重組體R7017和R7020，在動物試驗中也證明了該疫苗是安全有效的［10］。1999年，一種刪除核糖核酸酶PK基因的ICPΔ10基因缺陷活病毒疫苗被評價為是能夠預防HSV-2 感染的潛在疫苗［11］，使用ICPΔ10PK 疫苗免疫小鼠后，可觀察到小鼠體內產生了針對HSV的特異性抗體。在WACHSMAN 等［12］構建的豚鼠模型中，注射ICPΔ10PK 疫苗的豚鼠，其潛伏感染神經節(jié)比例、原發(fā)感染和復發(fā)感染比例以及生殖器皰疹感染與復發(fā)比例均顯著低于使用PBS 等劑量注射的對照組，表明ICPΔ10PK 疫苗在豚鼠體內具有預防和治療作用。減毒活疫苗HSV529 目前正在進行Ⅱ臨床實驗。HSV-2 的UL5和UL29基因被敲除，獲得了HSV-2 的突變株dl5-29。YO 等［13］用已構建的HSV-1血清陽性和陰性的豚鼠模型檢測dl5-29 與gD 疫苗對豚鼠的保護效力，結果發(fā)現，經wild HSV 對豚鼠陰道刺激后，dl5-29 組豚鼠的神經節(jié)HSV DNA 水平更低，且誘導的中和抗體滴度較高。DELAGRAVE等［14］比較了肌內注射HSV529 與gD 疫苗在不同攻毒劑量下的保護作用，試驗結果與YO等的結果一致。研究發(fā)現，刪除UL22基因的非感染性單周期病毒，HSV 的gH 糖蛋白不能正常合成［15-16］，導致病毒不能感染正常的細胞，該疫苗安全性良好，但無法完全阻止HSV-2 的潛伏與復發(fā)。近幾年的一項研究中，STANFIELD 等［17］利用HSV gK 蛋白和2 個截短突變的UL20基因構建了HSV VC2減毒活疫苗，該減毒疫苗株能在豚鼠體內產生強烈的免疫應答，小鼠肌肉注射VC2可引發(fā)廣泛的黏膜免疫反應。

2.2 核酸疫苗 核酸疫苗與傳統疫苗不同，其具有性能穩(wěn)定、安全性高、成本低、在細菌中可大量增殖和廣泛誘導免疫應答等特點，是目前最新發(fā)展的疫苗之一［18］。核酸疫苗是將編碼某種病毒蛋白的質粒接種于人體內，之后在體內轉錄翻譯生成蛋白質，刺激機體產生免疫應答。目前研究較多的是DNA 疫苗。由于糖蛋白D2（glycoprotein，gD2）和gB2 是誘導免疫反應的主要抗原，HSV DNA 疫苗大多采用gD2 和gB2［18］。有資料顯示，聯合表達HSV gD、gB 的疫苗起到的保護效果優(yōu)于單一表達其中一種糖蛋白［19］。

2008年，一種候選HSV-2 gD2 DNA 疫苗在HSV-2 血清陰性的62 名健康成年人中進行了載體對照、雙盲、劑量遞增免疫原性和安全性試驗，且其中50%的受試者還是HSV-1 陰性，全部受試者被隨機分配到疫苗組和安慰劑組，比例為4∶1。實驗結果表明，疫苗安全性良好，未觀察到劑量依賴的毒性，但僅在3 000 μg 劑量組中一名受試者檢測到對gD2 的細胞免疫，提示該疫苗需高劑量接種可能才會發(fā)揮其更好的性能［19］。ZHOU 等［20］開發(fā)了一種編碼HSV-2 gD的gD2 DUL25 DNA 疫苗，該疫苗與傳統的gD2 疫苗相比，能誘導更強烈的免疫應答。之后又在gD2 DUL25 DNA 疫苗上進行了改造，IL-28佐劑的加入使體液免疫和細胞免疫得到進一步加強。KIM 等［21］也將gD 作為核酸疫苗的主要靶點，為了促進細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）反應，又選擇了有CD8 T 細胞特異性表位的UL25 和gB 蛋白作為額外的靶點，結果表明，該疫苗誘導了病毒特異性T 細胞應答，并較好地清除了HSV，起到了預防HSV原發(fā)性感染的作用。PACK 等［22］發(fā)現，熱休克蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70）與病毒MHCⅠ級限制性表位（gB498-505）耦合疫苗可保護新生小鼠免受HSV-1 感染，可在生命早期抵抗HSV 的攻擊。DUTTON 等［23］通過對密碼子優(yōu)化修飾來增強免疫應答，并在此基礎上增加泛素編碼序列將抗原靶向到蛋白酶體中進行處理，從而構建了編碼HSV gD 的新型DNA 疫苗，在小鼠體內注射后，細胞毒性T細胞應答顯著增強，并降低了病毒潛伏感染的風險。還有多種新型DNA 疫苗，如gD2、gB2、CTL 表位質粒DNA疫苗，可成功刺激機體產生廣泛的免疫應答［23-27］。

2.3 滅活疫苗 第一代滅活疫苗是通過用福爾馬林處理被HSV 感染的兔腦等動物組織而制備的［28］。第二代滅活疫苗是將HSV接種于雞胚，用紫外線照射或化學處理等方法滅活雞胚中的病毒，進而制成疫苗。目前的滅活疫苗是通過細胞培養(yǎng)HSV，滅活后進行一系列純化等制備的。據文獻報道，Lupidon G和Lupidon H是全病毒滅活疫苗的兩個代表性疫苗，在意大利曾進行Ⅱ期臨床試驗，結果表明，具有一定的預防作用，但臨床資料并不能證明其安全性和有效性［29］。由于早期開發(fā)的HSV 滅活疫苗免疫原性低、功效差及存在潛在致癌性等缺陷，現已基本停止研究［30］。

2.4 亞單位疫苗 目前研究最多的HSV 疫苗為亞單位疫苗［31］，是通過提取或體外合成HSV 分泌的蛋白以及包膜表面的結構蛋白制成的。已知的HSV上有12 種糖蛋白，研究者多使用gD 和gB 來研制亞單位疫苗，通過大腸埃希菌等原核表達系統或真核表達系統中的桿狀病毒載體系統來合成純化蛋白。KEVIN 等［32］用原核表達系統中的鼠傷寒沙門菌表達出HSV-1 糖蛋白D，動物實驗結果表明，該疫苗可對HSV 產生有效的保護作用。AWASTHI 等［33］研發(fā)的gD2／gC2／gE2 三價亞單位疫苗可提高ELASA 試驗中和抗體的滴度，對豚鼠具有預防作用，對恒河猴具有免疫原性［33-35］。亞單位疫苗中也常用佐劑聯合提高疫苗刺激機體免疫應答的水平。COREY 等［36］對531 名感染HSV-2 但HSV-2 血清（-）的性伴侶和1 862名HSV-2高位感染人群進行2次雙盲、隨機、安慰劑對照的臨床試驗，試驗開始時、第1 個月和第6個月對受試者肌內三角肌進行gD2-gB2-MF59疫苗3次注射，結果顯示，該亞單位疫苗在受試者中誘發(fā)了高滴度的HSV-2 中和抗體，但該疫苗的總有效率僅有9%。SITA 等［37］開發(fā)了Ⅱ型HSV 聯合佐劑MPL 和明礬的gD2亞單位疫苗，臨床試驗表明，僅對HSV（-）的女性提供了明顯的保護作用，但對HSV-1血清（+）的女性和男性無明顯的保護作用。ONNHEIM 等［38］近期研制了一款靶向gG2 的疫苗，可增強HSV-1、HSV-2的免疫應答，誘導大量的CD4 T細胞。

2.5 基因工程活病毒疫苗 基因工程活病毒疫苗是利用基因工程方法，將HSV 外源基因插入已證明是安全的、能完整復制的病毒或細菌中，如痘苗病毒、腺病毒及相關病毒、水痘-帶狀皰疹病毒（varicella zoster virus，VZV）和鼠傷寒桿菌等。之后在上述病毒或細菌中即可表達出HSV 的相應蛋白，免疫動物后刺激其產生相應的免疫應答。

MCDERMOTT 等［39］利用重組人腺病毒載體AdgB2 驗證基因工程活病毒疫苗的免疫效力，接種AdgB2 的小鼠體內可產生針對HSV gB 高滴度的特異性抗體，且注射后無不良反應。試驗表明，該人腺病毒載體不會在小鼠體內復制，且單次免疫小鼠即可保護其免受HSV的攻擊。MESEDA等［40］用重組牛痘病毒MVA 載體研制了gD2 疫苗，在實驗過程中意外發(fā)現，如使用gD MVA 載體而不是gD 質粒載體作為啟動免疫，獲得了更多樣化的抗體同型反應，以及更多的抗體和強烈的細胞免疫反應。MACMILLAN等［41］發(fā)現，重組霍亂弧菌幽靈（recombinantVibrio choleraeghost，rVCG）可成功增強人體和動物病原體的體液和細胞免疫應答。該疫苗是由表達衣原體MOMP和HSV-2 gD的rVCG組成，在體內，小鼠經免疫后，在血清和陰道分泌物中均有l(wèi)gA和lgG2a抗體；在體外，小鼠經聯合疫苗免疫后，血清和陰道分泌物中均產生對衣原體和HSV-2 抗原分泌的IgA 和IgG2a 抗體，生殖器官可免受高劑量衣原體和HSV-2的攻擊［41-42］。最新研究表明，將gD和UL25基因插入重組腺病毒5（adenovirus 5，Ad5）載體中制備的基因工程活病毒疫苗可誘導強烈的CD4 T、CD8 T細胞免疫［43-44］，在小鼠模型中可有效預防生殖器皰疹［45］。

基因工程活病毒疫苗因其高安全性、可構建多價聯合疫苗以及可口服等特點備受關注，但由于有外源病毒的存在，可能會刺激機體產生多種抗體，抗體之間的相互作用對人體健康造成的影響目前尚不明確。另外，疫苗載體中HSV蛋白表達水平較低，誘導的抗體滴度較低，因此，后期應更多地關注如何提高基因工程活病毒疫苗中的HSV外源基因水平。

2.6 合成肽疫苗 從亞單位疫苗到合成肽疫苗，研究者在不斷將發(fā)揮抗原作用、刺激機體產生免疫應答的抗原單位縮短。2008年，一種以HSV-2 gB 中的HLA a *0201 限制性表位非共價鏈接，與截短的HSP70 佐劑結合的多肽疫苗AG-702 經Ⅰ期臨床試驗證明安全性良好，但56 名受試者的T 細胞數據顯示，并未檢測到對HSV-2 CD8+表位增強的免疫應答［19］。一種包含22個HSV-2蛋白與重組人Hsc70蛋白（命名為HerpV，原AG-707）非共價鍵鏈接而成的合成肽疫苗［46］已于2006年完成了Ⅰ期臨床試驗，2015年完成了Ⅱ期臨床試驗，其安全性高，且具有良好的免疫原性，受試者在注射疫苗前后，CD4 T和CD8 T 細胞應答差異有統計學意義。HerpV 是第一個在HSV 血清陽性受試者中誘發(fā)廣泛CD4+和CD8+T 細胞免疫應答的候選疫苗［47］。目前，多種生物信息學技術更多地應用于HSV疫苗的開發(fā)中。采用DNAstar 序列比對、生物信息學軟件系統BioSun和Antheprot 蛋白序列分析相結合的方法，對HSV-2 gB2、gC2、gE2、gG2和gI2的20個候選表位進行預測，并在體外進行生物學功能測試，結果發(fā)現，其中17個候選表位在EIA 測試中可與抗血清產生應答，有5個肽段與抗血清的反應較強烈，分別為gB2466-473（EQDRKPRN）、gC2216-223（GRTDRPSA）、gE2483-491（DPPERPDSP）、gG2572-579（EPPDDDDS）和gI2286-295（CRRRYRRPRG），上述5種多肽與BSA載體蛋白結合均可刺激小鼠產生免疫應答［48］。由此可見，合成肽疫苗是具有潛力的候選疫苗之一。但由于其分子量較小，免疫原性常不能達到設計者的預期，保護效力相對較弱，研發(fā)時需尋找適應的載體相互結合。

3 局限性與未來方向

目前為止，尚無HSV 疫苗成功上市［3］，提示研究者需制定合理的HSV 疫苗研制策略，所研制的HSV疫苗復制周期應比病毒的復制周期長，具有能被宿主容易識別的靶點，刺激機體迅速產生免疫應答，且具有無嗜神經毒性等特點［49］。針對HSV 疫苗的開發(fā)，哈欽森癌癥研究中心另辟蹊徑，其關注點并不是復制病毒本身、DNA或病毒表面蛋白，而是用經過改造的酶在關鍵位點的切割，以清除整合性或非復制性的附加型病毒的基因組為目標，結果目前尚無定論，但可作為一個全新的角度來嘗試HSV 疫苗的研制，這也提示HSV 疫苗目前未獲批上市的原因可能是研制策略需要調整，同是在HSV 疫苗研發(fā)過程中可能存在某些局限性。

3.1 尋找培養(yǎng)病毒的合適細胞系 資料表明，人胚肺細胞（MRC-5）和非洲綠猴腎細胞（Vero）多用于HSV的分離培養(yǎng)，其中HSV-1多在Vero細胞或人胚胎肺成纖維樣細胞（KMB17）中培養(yǎng)擴增，HSV-2多在Vero 細胞、地鼠腎細胞（BHK）和人喉表皮樣癌細胞（Hep-2）中進行培養(yǎng)［50］。據報道，通過空斑數和細胞病變出現的特征與時間對比黑松雞猴腎細胞（BGM）、宮頸癌細胞（Hela）、人二倍體細胞（HEL）、人非小細胞肺癌細胞（A549）對HSV-1 的敏感程度，進而得到HSV-1 分離培養(yǎng)較為理想的細胞，結果發(fā)現，BGM細胞優(yōu)于其他類別的細胞［50］。但由于病毒或細胞表面蛋白結構的影響，使用細胞培養(yǎng)病毒時，獲得的病毒量很少，應進一步探討使用何種新型細胞系可提高病毒量。

3.2 疫苗試驗過程中合理選擇實驗動物人類感染HSV 后，不會對生命構成威脅，但小鼠感染HSV 后，多會對其產生致命的攻擊［51］。因此，用小鼠模型進行HSV疫苗實驗存在很多局限性。研究發(fā)現，小鼠模型適于開發(fā)預防性疫苗，豚鼠模型適于開發(fā)治療性疫苗，但由于豚鼠不適合用基因敲除實驗來評估作用機制［52］，人們嘗試利用恒河猴等與人類親緣關系較近的實驗動物，盡量縮小動物實驗和臨床試驗的差距，缺點是使用恒河猴來進行模擬實驗成本太高［53］，提示急需建立一個更有效的動物實驗平臺，見表2。

表2 HSV疫苗動物模型Tab.2 Animal models used for HSV vaccines

其次，構建模型時，實驗動物的性別也是應考慮的重要因素。臨床資料表明，HSV-2 在男性中的發(fā)病率明顯低于女性，可能與其生殖結構密切相關。男性和女性生殖器部位的免疫細胞和微生物群不同，女性陰道處免疫細胞較多、多為厭氧微生物；而男性免疫細胞少，多為需氧微生物。在以往的研究中發(fā)現，研制HSV 疫苗時多用雌性動物［2］，但應用于雄性動物中，疫苗的保護效力低于雌性動物［2］，因此，應充分考慮實驗動物的性別差異對HSV 疫苗的限制，進而開發(fā)兼容性更高的HSV疫苗。

3.3 合理使用佐劑大量文獻表明，疫苗聯合佐劑的應用誘導了更有力的T細胞免疫和抗體水平。在疫苗研制過程中，CPG、MPL、MF59、QS21、HSP70和明礬等已被用作HSV疫苗的佐劑。如HSP70能夠通過MHCⅠ類途徑交叉提呈外源性病毒抗原，與HSV gB498-505表位耦合成重組HSV gB 疫苗，可在生命早期抵抗HSV的攻擊［22］，HSV聯合佐劑MPL和明礬的gD2亞單位疫苗可對HSV（-）的女性提供明顯的保護作用［54］。HSP70聯合HSV gB蛋白可將HSV抗原肽呈遞至CD8+和CD4+T淋巴細胞，還可激活抗原提呈細胞，并促進機體免疫應答［55］。有文獻表明，以細胞因子、趨化因子、免疫刺激調節(jié)分子和共刺激分子作為HSV-2 疫苗佐劑的DNA 疫苗可誘導機體產生強烈的免疫應答。SIN 等［56］將編碼IL-12 P40 與編碼IL-12 的P35質粒與HSV-2 PgD 質粒共同免疫小鼠，結果發(fā)現，小鼠體內免疫球蛋白lgA、lgG 水平明顯增高。之后用免疫刺激調節(jié)分子CD154 作為佐劑共同免疫小鼠，仍可觀察到小鼠T細胞免疫應答增強，且面對HSV-2致死劑量攻擊時，小鼠死亡率顯著降低［56］。SHLAPOBERSKY 等［26］將pDNA 與Vaxfectin（一種基于陽離子脂質的佐劑）開發(fā)了gD2 疫苗，用HSV-2 致死劑量攻擊小鼠，發(fā)現小鼠神經毒性明顯減弱，提示VaxfectingD2 pDNA具有作為未來多價HSV-2疫苗聯合佐劑的潛力。大多數佐劑可刺激先天免疫細胞或樹突狀細胞，從而誘導有效且持久的免疫應答。由此可見，佐劑的合理應用可大大提高免疫應答的效率，因此，實驗過程中佐劑的選擇至關重要，但聯合新型佐劑的HSV疫苗對人體產生的副作用應額外關注。

3.4 關注疫苗不同注射方式對其保護作用的影響資料表明，疫苗的接種途徑均是具有高度經驗性的，通過反復對比不同方式接種疫苗的保護作用，從而選擇一種對機體保護作用最高的疫苗接種方式作為標準［4］。但最近一項研究表明，HSV-2候選基因缺陷活病毒疫苗ACAM529［16］，不同注射方式可在小鼠體內產生不同的相對免疫原性和保護效力。通過皮內、皮下和肌內途徑注射ACAM529，結果表明肌內注射途徑對小鼠的保護作用最強。胡凱等［57］設計了一款以PEI-Fe3O4 為載體的DNA 疫苗pRSC-gD-IL-21，在小鼠HSK動物模型中，通過眼表黏膜注射方式刺激小鼠產生了明顯的細胞免疫、體液免疫和特異性黏膜免疫應答。由此可見，疫苗不同的注射方式在疫苗的作用發(fā)揮方面起重要作用，對注射方式的考量為進一步的臨床試驗研究奠定了基礎。

隨著HSV生物學特點，病毒感染、潛伏和復發(fā)機制等的深入研究，相信未來HSV 疫苗的研制將在上述研究的基礎上尋找到新的突破點。