新西蘭白兔不同內(nèi)臟組織中實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

倪萌柯，李笑然，李藝杰，張皓源，許會芬，李明

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046)

生物學(xué)研究中基因表達(dá)分析能為復(fù)雜的基因調(diào)控研究提供可靠的理論依據(jù)，而基因定量表達(dá)分析則需要通過內(nèi)參基因?qū)ο嚓P(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。內(nèi)參基因又稱管家基因，是表達(dá)量在各細(xì)胞和組織中相對穩(wěn)定且不受外部環(huán)境因素和試驗條件影響的基因。內(nèi)參基因的表達(dá)一直被認(rèn)為是穩(wěn)定的。然而，相關(guān)研究表明，內(nèi)參基因的表達(dá)會隨著細(xì)胞生長以及發(fā)育階段、試驗條件和組織的不同而發(fā)生變化[1-3]。同時，作為維持細(xì)胞最低限度功能的基因，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性也存在波動性表達(dá)。因此，直接使用未經(jīng)篩選的內(nèi)參基因會導(dǎo)致基因表達(dá)分析數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，影響目標(biāo)基因表達(dá)水平結(jié)果的可靠性。在開展試驗時，根據(jù)具體的材料和處理選擇合適的內(nèi)參基因?qū)虮磉_(dá)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，才能獲得準(zhǔn)確可靠的基因表達(dá)模式，這對深入開展基因的功能驗證和調(diào)控機(jī)制研究有重要意義。實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)由于靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于目的基因定量分析中[4]。PéREZ等[5]利用qRT-PCR方法確定在牛肌肉發(fā)育中SF3A1、EEF1A2和HMBS是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。GOOSSENS等[6]采用qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)在牛胚胎發(fā)育過程中酪氨酸3/色氨酸5單加氧酶激活蛋白基因(recombinant tyrosine 3/tryptophan 5 monooxygenase activation protein zeta，Ywhaz)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和琥珀酸脫氫酶基因(succinate dehydrogenase,Sdha)是最合適的內(nèi)參基因。MAMO等[7]利用qRT-PCR方法選擇并驗證了在兔卵母細(xì)胞中穩(wěn)定的內(nèi)參基因。但是，目前對不同內(nèi)臟組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因篩選研究較為少見。家兔(Oryctolaguscuniculus)對于生物醫(yī)學(xué)研究十分重要[8]，在系統(tǒng)發(fā)育上更接近人，是首先被用于研究人類動脈粥樣硬化的動物模型[9]。目前，家兔廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個研究領(lǐng)域，如急性動物試驗等方面[10-11]。單毅等[12]成功構(gòu)建了持續(xù)腹腔內(nèi)高壓下腹腔筋膜室綜合征家兔模型。LU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，家兔感染隱孢子蟲后可作為抗隱孢子蟲藥物試驗的動物模型。新西蘭白兔是著名的家兔品種，現(xiàn)已遍布全國，也是國際上公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)實驗動物?，F(xiàn)階段相關(guān)研究常用的內(nèi)參基因包括β-肌動蛋白基因(β-actin)、GAPDH、Ywhaz、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1基因(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HPRT1)、18SrRNA、Sdha、β2-微球蛋白基因(β2-MG，B2M)、細(xì)胞色素P450同工酶基因(cytochrome P450 proteins,CYP)等。β-actin參與合成細(xì)胞骨架，在細(xì)胞分泌、遷移及細(xì)胞質(zhì)的流動和分離[14]過程中起著重要作用，且在不同的物種間高度保守。GAPDH是最常用于校正目標(biāo)基因的表達(dá)的內(nèi)參基因。HPRT1參與細(xì)胞代謝，其穩(wěn)定性較高，常被選作內(nèi)參基因進(jìn)行研究。CYP主要存在于肝臟的單加氧酶，催化內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝。Ywhaz、18SrRNA、Sdha、B2M等在家兔不同發(fā)育階段也有穩(wěn)定表達(dá)。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，GAPDH、18SrRNA和β-actin等常用基因在校正目的基因表達(dá)量時所得結(jié)果有差異。因此，篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因就很有必要。本試驗以新西蘭白兔的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胃為研究對象，利用qRT-PCR技術(shù)分別檢測各個組織中8個候選內(nèi)參基因(β-actin、GAPDH、Ywhaz、HPRT1、18SrRNA、Sdha、B2M和CYP)的表達(dá)水平，分析其擴(kuò)增效率與穩(wěn)定性，并使用RefFinder[15]軟件中的geNorm、NormFinder和BestKeeper程序[16-18]分別對候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價。在此基礎(chǔ)上，本試驗對候選內(nèi)參基因進(jìn)行綜合評定，篩選不同內(nèi)臟組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，為后續(xù)新西蘭白兔及家兔相關(guān)試驗提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇6只正常飼養(yǎng)的70日齡新西蘭白兔(河南鄭州玉飛種兔場)，體質(zhì)量為(2.37±0.05)kg，安樂死后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及胃的樣品，迅速置于液氮中保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)總RNA的提取。所有動物程序均在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會(institutional animal care and use committee，IACUC)(編號11-0085)的批準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

采用Trizol法提取6種內(nèi)臟組織的總RNA，利用紫外分光光度計(Thermo，美國)測定所提取RNA樣本的濃度和純度，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，符合要求的RNA樣品(OD260/OD280比值為1.8～2.0，OD260/OD230在1.90以上，且RNA降解較少)用于cDNA第一鏈的合成，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)試劑盒說明書進(jìn)行，用于后續(xù)qRT-PCR。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中公布的兔基因序列，利用Primer 6.0軟件設(shè)計β-actin、GAPDH、Ywhaz、HPRT1、18SrRNA、Sdha、B2M和CYP這8個內(nèi)參基因的引物，引物由生工生物工程有限公司合成(上海，中國)合成，引物信息如表1所示。

表1 候選內(nèi)參基因的引物信息Table 1 Primers of candidate reference genes

1.4 qRT-PCR檢測

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，檢測8個內(nèi)參基因在6種不同組織中的表達(dá)情況。反應(yīng)體系如下：ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech, Nanjing, China) 5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA 1.0 μL, 加ddH2O 至終體積10 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；循環(huán)數(shù)為40個，95 ℃ 15 s；熔解曲線為65～95 ℃，每5 s增加0.5 ℃，用以確定擴(kuò)增特異性。

1.5 內(nèi)參基因的特異性鑒定及引物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

候選內(nèi)參基因的qRT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及測序檢測，以確定內(nèi)參基因引物擴(kuò)增的特異性。同時，利用不同內(nèi)臟組織的cDNA樣品制作混池，依據(jù)50、5-1、5-2、5-3和5-4設(shè)置等比例稀釋成5個質(zhì)量濃度梯度，每個質(zhì)量濃度梯度設(shè)置3個重復(fù)，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 數(shù)據(jù)分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線以樣品質(zhì)量濃度的對數(shù)值為自變量，qRT-PCR檢測得到的Cq值為因變量繪制，使用SPSS 26.0軟件計算引物標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測其回歸方程的擬合度R2，根據(jù)E=10(-1/slope)-1計算擴(kuò)增效率，其中slope為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，以此確定候選內(nèi)參基因引物是否可用于定量分析。

利用Microsoft Excel對定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計，首先分析候選內(nèi)參基因的Cq值以及標(biāo)準(zhǔn)差的大小，接著分別利用RefFinder中的geNorm、NormFinder和BestKeeper 程序分析8個內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。geNorm程序通過候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值M的大小來比較不同候選基因的穩(wěn)定性，表達(dá)穩(wěn)定值M按照ANDERSEN等[16]方法計算得到，M值大小與內(nèi)參基因穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，即M值越小說明基因的穩(wěn)定性越高。NormFinder程序計算候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值SV，表達(dá)穩(wěn)定值SV按照VANDESOMPELE等[17]方法計算得到，SV值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定。BestKeeper程序分析獲得各候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值SD，表達(dá)穩(wěn)定值SD按照PFAFFL等[18]方法計算得到，SD值越小，基因越穩(wěn)定。對內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行綜合分析，將geNorm、NormFinder 和 BestKeeper這3個程序內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析結(jié)果進(jìn)行排名，將最穩(wěn)定的內(nèi)參基因排名第1，然后計算8個內(nèi)參基因所得到名次的算術(shù)平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率

如表2所示，8個候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上，證明本研究篩選的候選內(nèi)參基因Cq值和相應(yīng)模板質(zhì)量濃度的對數(shù)值之間存在穩(wěn)定的線性關(guān)系，且擴(kuò)增效率較高，適合2-ΔΔCq方法歸一化目的基因。8對候選內(nèi)參基因的引物擴(kuò)增后的熔解曲線均是單峰，特異性較好。綜上，8個候選內(nèi)參基因的引物可用于qRT-PCR擴(kuò)增及后續(xù)分析。

表2 候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Table 2 Standard curve parameters for the candidate reference genes

2.2 候選內(nèi)參基因的Cq值分析

候選內(nèi)參基因在qRT-PCR反應(yīng)中的Cq值變化可以反映基因的表達(dá)水平，Cq值越低代表基因的表達(dá)豐度越高，而Cq值越高代表基因的表達(dá)豐度越低。如圖1所示，8個候選內(nèi)參基因的Cq值在不同組織樣品中均有變化，其中，18SrRNA和CYP分別具有最低的Cq值(11.26)和最高的Cq值(26.01)，表明不同內(nèi)參基因的表達(dá)豐度變異范圍較大。在所檢測的8個內(nèi)參基因中，HPRT1的表達(dá)豐度差異較小，且具有相對穩(wěn)定的表達(dá)水平；而內(nèi)參基因B2M的表達(dá)豐度差異較大。

圖1 候選內(nèi)參基因的Cq值分析Fig.1 Cq value analysis of candidate reference genes

2.3 geNorm 程序分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性

利用geNorm程序?qū)?nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析。如圖2所示，在心臟組織中，Ywhaz和B2M表達(dá)最穩(wěn)定，Sdha表達(dá)最不穩(wěn)定；肝臟組織中，CYP和HPRT1的M值最小，穩(wěn)定性最高，18SrRNA的M值最大，表達(dá)最不穩(wěn)定；在脾臟組織中，β-actin和GAPDH的穩(wěn)定性最高，18SrRNA穩(wěn)定性最低。在肺臟組織中，Sdha和18SrRNA的表達(dá)最穩(wěn)定，CYP表達(dá)最不穩(wěn)定；在腎臟組織中，CYP和β-actin的表達(dá)最穩(wěn)定，18SrRNA的表達(dá)最不穩(wěn)定；在胃組織中，CYP和β-actin表達(dá)穩(wěn)定性最高，B2M表達(dá)最不穩(wěn)定。

2.4 NormFinder程序分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性

利用NormFinder程序?qū)?nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析。如圖3所示，在心臟組織中，表達(dá)最穩(wěn)定的基因是β-actin，最不穩(wěn)定的基因是Sdha；在肝臟組織中，表達(dá)最穩(wěn)定的基因是HPRT1，最不穩(wěn)定的是18SrRNA；在脾臟組織中，表達(dá)最穩(wěn)定的基因是GAPDH，最不穩(wěn)定的基因是18SrRNA；在肺臟組織中，SV值最小的是Sdha，CYP的表達(dá)最不穩(wěn)定；在腎臟組織中，CYP的表達(dá)表達(dá)最穩(wěn)定，18SrRNA的表達(dá)最不穩(wěn)定；在胃組織中，β-actin表達(dá)最穩(wěn)定，B2M表達(dá)最不穩(wěn)定。

A.心臟；B.肝臟；C.脾臟；D.肺臟；E.腎臟；F.胃。下同。A.Heart；B.Liver；C.Spleen；D.Lung；E.Kidney；F.Stomach. The same as below.

圖3 NormFinder程序分析候選內(nèi)參基因在新西蘭白兔不同內(nèi)臟組織中的表達(dá)穩(wěn)定性Fig.3 Expression stability analysis of candidate reference genes in different visceral tissues of New Zealand white rabbits using the NormFinder program

2.5 BestKeeper 程序分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性

利用BestKeeper程序?qū)?nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析。如圖4所示，在新西蘭白兔的心臟和肝臟組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是GAPDH，18SrRNA的穩(wěn)定性較差；脾臟組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是β-actin，B2M基因在心臟、肝臟和脾臟組織中表達(dá)均不穩(wěn)定。而在新西蘭白兔的肺臟、腎臟及胃組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是Ywhaz、B2M和CYP，最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是β-actin、Ywhaz和B2M。

圖4 BestKeeper程序分析候選內(nèi)參基因在新西蘭白兔不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性Fig.4 Expression stability analysis candidate reference genes in different visceral tissues of New Zealand white rabbits using the BestKeeper program

2.6 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的綜合分析

將3個程序內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性結(jié)果進(jìn)行綜合分析。綜合排名越前越穩(wěn)定。如表3所示，在新西蘭白兔心臟組織中，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是β-actin，表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Sdha；肝臟組織中表達(dá)最穩(wěn)定的是HPRT1基因，18SrRNA基因表達(dá)最不穩(wěn)定；脾臟組織中表達(dá)最穩(wěn)定的基因是β-actin，B2M基因表達(dá)最不穩(wěn)定；肺臟組織中，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Sdha，表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYP；腎臟組織中，CYP基因表達(dá)最穩(wěn)定，18SrRNA基因表達(dá)最不穩(wěn)定；胃組織中表達(dá)最穩(wěn)定的基因是β-actin，B2M基因表達(dá)最不穩(wěn)定。

表3 內(nèi)參基因在新西蘭白兔不同內(nèi)臟組織中表達(dá)穩(wěn)定性綜合分析Table 3 Combined analysis of the reference genes’ stability in different visceral tissues of New Zealand white rabbits

3 結(jié)論與討論

在分子生物學(xué)研究中，目的基因表達(dá)量的定量分析為復(fù)雜機(jī)制提供了可靠的依據(jù)。基因的表達(dá)量經(jīng)常通過qRT-PCR測定其拷貝數(shù)(Cq)，以內(nèi)參基因為標(biāo)準(zhǔn)，通過2-ΔΔCq計算方法得到基因的相對表達(dá)量。在此方法中，必須選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化，從而獲得準(zhǔn)確可信的表達(dá)模式。穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)RT-PCR的重要程度不言而喻。因此，為了獲得在家兔不同內(nèi)臟組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，本研究選擇新西蘭白兔心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃來篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，為家兔內(nèi)臟組織中的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。新西蘭白兔是著名的優(yōu)良肉兔品種，也是國際上公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)實驗動物，本研究選擇新西蘭白兔作為研究對象探討內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性，研究結(jié)果對其他品種的家兔中同樣適用。

本研究結(jié)果表明，在新西蘭白兔的心臟中表達(dá)最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是β-actin、HPRT1和Ywhaz，在肝臟中表達(dá)最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是HPRT1、GAPDH和CYP，在脾臟中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因依次是β-actin、GAPDH和CYP，在肺臟中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因依次是Sdha、18srRNA和Ywhaz，在腎臟中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因依次是CYP、β-actin和HPRT1，在胃中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因依次是β-actin、CYP和Ywhaz。本研究證實了在新西蘭白兔的不同組織中能夠穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因不同。有報道指出，使用最穩(wěn)定的至少3個內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)是歸一化qRT-PCR數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確的途徑[19-20]。DANG等[21]人證明在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中HPRT1和RPL13A是最適合的內(nèi)參基因。陳瑞等[22]在研究新西蘭白兔幼齡期和成年期的心臟、肝臟和肺臟組織中發(fā)現(xiàn)，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因依次是HPRT1、GAPDH和β-actin。因此，本研究證明HPRT1基因表達(dá)較為穩(wěn)定，是與前人研究結(jié)論相符的。在豬的不同組織中，β-actin和HPRT1基因表達(dá)比較穩(wěn)定[23]。β-actin基因被證明在貓科動物子宮內(nèi)膜中穩(wěn)定表達(dá)[24]。HE等[25]在研究家兔食糞模型中穩(wěn)定的內(nèi)參基因發(fā)現(xiàn)，在肝臟組織中，HPRT1和β-actin表達(dá)較為穩(wěn)定。GAPDH是糖酵解、糖異生途徑的關(guān)鍵酶，是最常用的內(nèi)參基因之一，但是許多研究指出GAPDH作為內(nèi)參基因并不穩(wěn)定[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，在新西蘭白兔的心臟、肺臟、腎臟以及胃組織中GAPDH的表達(dá)穩(wěn)定性較差。在NYGARD等[22]的研究中發(fā)現(xiàn)，GAPDH基因在豬的不同組織中的表達(dá)最不穩(wěn)定。池永東等[28]在研究山羊不同組織器官的內(nèi)參基因穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn)，GAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最差。MONDRAGN等[29]指出常用內(nèi)參基因GAPDH在T細(xì)胞中的過表達(dá)可以通過激活NF-κB信號通路促進(jìn)血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤的生長。因此，本研究推斷GAPDH作為內(nèi)參基因，可能已經(jīng)不適用于部分組織器官。相關(guān)結(jié)果表明，內(nèi)參基因的表達(dá)可能會根據(jù)試驗設(shè)置而變化，并且參考基因的選擇會對目標(biāo)基因的測量表達(dá)水平產(chǎn)生很大影響[24,30-31]。因此，本研究推薦選擇上述結(jié)果中表達(dá)最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因來進(jìn)行目的基因的歸一化，或者根據(jù)生物醫(yī)學(xué)研究需要選擇最適合的內(nèi)參基因，以確保獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。