外泌體在上皮性卵巢癌中的研究進(jìn)展

董 健，翟梁好，呂小慧，陳必良

（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西京 醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032）

卵巢癌是現(xiàn)代女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致女性婦科腫瘤死亡的第二大主要原因[1]，由于其早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)和有效的診斷方法，大多數(shù)患者就診時(shí)已為晚期。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是卵巢惡性腫瘤中最常見的病理類型，占所有病例的90%[2]，且發(fā)病率在我國(guó)婦科腫瘤中呈上升趨勢(shì)[3]。目前EOC 在臨床中的主要治療手段是進(jìn)行徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以紫杉醇聯(lián)合鉑類為基礎(chǔ)的化療治療，近年來隨著手術(shù)技術(shù)的不斷改進(jìn)，化療藥物及靶向藥物、免疫治療的迅速進(jìn)展，EOC 的生存率有了較大的提高，但其5 年存活率仍徘徊在40%左右，呈隱匿性發(fā)展，增殖轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，易耐藥，以上都是導(dǎo)致EOC 預(yù)后差的原因。因此，探尋EOC 高靈敏度、高特異性的生物標(biāo)志物，對(duì)實(shí)現(xiàn)早期診斷，探究EOC 增殖轉(zhuǎn)移、化療耐藥的作用機(jī)制并針對(duì)化療耐藥等制定靶向治療至關(guān)重要。

1 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體最初被認(rèn)為是細(xì)胞排泄廢物的一種形式，隨著實(shí)驗(yàn)研究的推進(jìn)，外泌體的結(jié)構(gòu)和功能不斷得到闡明，現(xiàn)已證明其是細(xì)胞間通訊、信息交換和腫瘤發(fā)展的重要媒介。外泌體是大小為30～150nm 的胞外囊泡，不同于直接從膜上分離出來的胞外囊泡，外泌體主要通過核內(nèi)體途徑形成，并可由多種類型的活細(xì)胞分泌，在血液、腹水、尿液、卵泡液、精液、羊水等體液中均可發(fā)現(xiàn)[4]。外泌體富含蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，其內(nèi)含有的多種特異性蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、微小RNA（miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）及環(huán)狀RNA（cirRNA）等取決于親本細(xì)胞的類型和環(huán)境條件，他們可以通過改變受體細(xì)胞的基因表達(dá)、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)通路進(jìn)而影響受體細(xì)胞的功能和表型，表明不同來源的外泌體可能發(fā)揮著各自獨(dú)特的功能。越來越多的研究表明，外泌體輸送的生物活性分子，通過與受體細(xì)胞融合或與細(xì)胞表面的受體結(jié)合參與運(yùn)輸、細(xì)胞間通訊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原呈遞和免疫調(diào)節(jié)，在細(xì)胞間相互聯(lián)系中起著關(guān)鍵作用[5]。

外泌體的內(nèi)容物因受到磷脂雙分子層的保護(hù)而高度穩(wěn)定，通過現(xiàn)有技術(shù)對(duì)體液中的外泌體進(jìn)行檢測(cè)，其基因組、蛋白質(zhì)組可以反映原始細(xì)胞的基因和蛋白質(zhì)。已有研究證明，正常人類血液中外泌體的含量約2 000 萬億個(gè)，腫瘤患者血液中約含有4 000 萬億個(gè)外泌體[6-7]，腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞分泌更多的外泌體已經(jīng)獲得認(rèn)可，且腫瘤細(xì)胞外泌體內(nèi)容物比正常細(xì)胞更具有標(biāo)志性，通過旁分泌和遠(yuǎn)距離分泌與靶細(xì)胞融合，其介導(dǎo)的細(xì)胞間信息和物質(zhì)交流可以為惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供必要的條件，影響腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和治療效果。因此，外泌體被認(rèn)為是早期識(shí)別腫瘤發(fā)生發(fā)展的新的生物標(biāo)志物，其特殊的生物學(xué)功能可提高生物標(biāo)記物擴(kuò)增的靈敏度，進(jìn)而提高腫瘤早期診斷的陽性率。

2 外泌體內(nèi)容物在EOC 中的作用

目前晚期EOC 主要通過臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查結(jié)合病理檢查確診，用于EOC 診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物是血清腫瘤標(biāo)志物糖類抗原（CA125），但其敏感性和特異性較低，并不是所有的患者CA125 都升高，如炎癥性病變也會(huì)導(dǎo)致CA125 的升高。外泌體的出現(xiàn)為EOC 的早期診斷提供了新思路，最新的研究表明，在EOC 患者血液、腹水及尿液中均檢測(cè)到了高濃度的外泌體，并隨著腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移而增多，因此外泌體及其內(nèi)容物具有成為EOC 診斷和判斷預(yù)后的重要標(biāo)志物潛在特征[8-9]。

2.1 外泌體蛋白質(zhì)

外泌體中的蛋白質(zhì)因受到磷脂雙分子層保護(hù)較為豐富穩(wěn)定，動(dòng)態(tài)波動(dòng)較小，通過對(duì)EOC 外泌體中的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，更容易從外泌體中發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)生物標(biāo)志物[10]。諸多研究對(duì)不同體液來源的EOC 外泌體進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，揭示了相關(guān)功能蛋白質(zhì)的差異性聚集[11]。Dorayappan 等[12]通過使用不同的技術(shù)提取純化外泌體，對(duì)高級(jí)別漿液性卵巢癌細(xì)胞株及其起源細(xì)胞系鑒定了EOC 的蛋白標(biāo)志物，確定了20 個(gè)獨(dú)特的外泌體蛋白作為優(yōu)先級(jí)候選蛋白生物標(biāo)記物，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription-3，STAT3）、基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase-7，MMP7）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）等，通過良性腫瘤和不同期別EOC 對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)早期EOC 患者血清外泌體中的HGF、STAT3 和IL-6 水平顯著升高。Zhang 等[13]使用自制的3D 納米微流體芯片，檢測(cè)了20 例EOC 患者血漿中CD24、上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和葉酸受體α 蛋白的表達(dá)變化，其中葉酸受體α 蛋白是一種糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白，其主要功能是介導(dǎo)葉酸向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。在正常組織中的葉酸受體α 蛋白表達(dá)受限，但在多種實(shí)體腫瘤中均有上調(diào)表達(dá)，對(duì)卵巢癌患者血液中外泌體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)葉酸受體α 蛋白含量顯著升高，有助于早期EOC 的發(fā)現(xiàn)，可作為無創(chuàng)檢測(cè)手段對(duì)EOC 進(jìn)行早期診斷。

新技術(shù)的不斷發(fā)展為分析EOC 外泌體中的蛋白質(zhì)組圖譜提供了技術(shù)支持，外泌體的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤細(xì)胞的不同階段可分泌特異性蛋白質(zhì)，通過EOC 外泌體蛋白質(zhì)組圖譜與其他腫瘤細(xì)胞的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)EOC 特異性蛋白分子，這些蛋白分子可以作為EOC 的“二維碼”，用于開發(fā)早期診斷標(biāo)志物[14]。Skryabin 等[15]研究表明多種上皮性癌細(xì)胞（非小細(xì)胞肺癌、乳腺和卵巢癌細(xì)胞）產(chǎn)生的外泌體及腫瘤患者體液中提取的外泌體均存在人類紅細(xì)胞膜整合蛋白（stomatin），且不同癌種來源的外泌體中stomatin 的豐度不同，EOC 細(xì)胞外泌體中stomatin表達(dá)較高，使其有望成為很有前途的外泌體標(biāo)記物。

2.2 外泌體微小RNA

微小RNA（miRNA）是外泌體中含量最豐富的非編碼小RNA，與血清、血漿等體液循環(huán)miRNA 相比，因其在外泌體中免受RNA 酶的降解，且其含量隨著腫瘤的進(jìn)展而發(fā)生變化，在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用，在各種癌癥細(xì)胞分泌的外泌體中可以發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異的miRNA，外泌體中miRNA 水平的變化對(duì)鑒別良惡性腫瘤及腫瘤分期預(yù)后有一定的診斷價(jià)值[16]。

EOC 分泌的外泌體中，存在許多針對(duì)mRNA 的特定基因伴隨腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過程，眾多研究報(bào)道，miR-203、miR-213-3p、miR-31、miR-373、miR-21-5p、miR-141-3p 和miR-200a/b/c 等參與EOC的發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮了重要作用[17-19]。Yoshimura等[20]發(fā)現(xiàn)EOC 患者血清外泌體中miR-99a-5p 表達(dá)水平顯著增加，檢測(cè)EOC 的敏感性和特異性分別為0.85 和0.75，且術(shù)后血清miR-99a-5p 表達(dá)水平顯著下降，同時(shí)，人腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)EOC 來源的外泌體處理后，miR-99a-5p、纖維連接蛋白和玻璃體連接蛋白的表達(dá)顯著增加，促進(jìn)了EOC 的侵襲轉(zhuǎn)移，提示外泌體中miR-99a-5p 一定程度上可反映EOC 腫瘤負(fù)荷及病程進(jìn)展。Wang 等[21]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-205 表達(dá)上調(diào)，EOC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)，凋亡能力減弱，可用來評(píng)價(jià)EOC 的惡性程度。Hang 等[22]利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了卵巢癌細(xì)胞及其外泌體的miRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)共有22 個(gè)miRNAs 在外泌體及其來源的卵巢癌細(xì)胞中共表達(dá)，其中miR-145-5p 及其負(fù)性調(diào)控的靶基因CTGF，可能通過影響Hippo 信號(hào)通路參與卵巢癌患者的預(yù)后。

3 外泌體參與EOC 的轉(zhuǎn)移

EOC 發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移是其預(yù)后差的重要因素，因此，預(yù)測(cè)、防范及阻止腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是治療的關(guān)鍵策略[23]。近年的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞衍生的外泌體可以在轉(zhuǎn)移靶器官中建立腫瘤微環(huán)境，通過為腫瘤細(xì)胞提供物質(zhì)基礎(chǔ)促進(jìn)轉(zhuǎn)移?；|(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和外泌體構(gòu)成了腫瘤微環(huán)境，其中外泌體是腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的一種強(qiáng)大的信號(hào)媒介，促進(jìn)所有相關(guān)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的溝通。EOC 外泌體可以通過免疫抑制、血管生成、基質(zhì)細(xì)胞重塑和致癌基因重組等方式促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[8,24-27]。

外泌體整合素在腫瘤微環(huán)境的建立中起了關(guān)鍵性作用，可用來預(yù)測(cè)器官特異性轉(zhuǎn)移，腫瘤患者血清中提取的外泌體整合素表達(dá)譜可作為預(yù)測(cè)未來轉(zhuǎn)移部位的預(yù)后因子[28-30]，已有研究證明外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)顯示出不同的整合素表達(dá)模式，其中外泌體整合素α6β4 和α6β1 與肺轉(zhuǎn)移相關(guān)，而外泌體整合素αvβ5 與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，通過靶向敲低整合素α6β4 和αvβ5 表達(dá)可減少轉(zhuǎn)移部位對(duì)腫瘤細(xì)胞外泌體的攝取，起到降低肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移的作用[28]。Li 等[31]研究證明了EOC 衍生的外泌體整合素α5β1(ITGA5B1)的表達(dá)及其與天冬酰胺內(nèi)肽酶(AEP)在人腹膜間皮細(xì)胞中的作用和機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ITGA5B1/AEP 復(fù)合體在EOC 細(xì)胞中高表達(dá)，EOC 細(xì)胞分泌的ITGA5B1/AEP 復(fù)合體對(duì)腫瘤細(xì)胞在腹膜間質(zhì)細(xì)胞中的增殖和遷移中起重要作用，患者的血清和腹水中也存在高水平的外泌體ITGA5B1/AEP 復(fù)合體，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞外泌體ITGA5B1/AEP 復(fù)合體的表達(dá)與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)，說明外泌體ITGA5B1/AEP 復(fù)合體在腹膜轉(zhuǎn)移中起重要作用。這些研究都證實(shí)外泌體直接或間接參與到腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建，從而促進(jìn)EOC 侵襲和廣泛轉(zhuǎn)移。

4 外泌體參與EOC 的化療耐藥

化療耐藥是EOC 治療失敗的主要原因之一，近50%的晚期EOC 患者因化療耐藥復(fù)發(fā)且發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，及時(shí)全面地認(rèn)識(shí)不同患者的耐藥機(jī)制，可以進(jìn)一步完善個(gè)體治療的方案。腫瘤細(xì)胞的耐藥性機(jī)制十分復(fù)雜，涉及許多因素，如藥物外排泵的過度表達(dá)、藥物失活、DNA 錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制及藥物靶點(diǎn)的改變、突變。外泌體與化療耐藥的相關(guān)性為耐藥機(jī)制的研究提供了新的方向，已發(fā)現(xiàn)外泌體不僅在誘導(dǎo)藥物敏感癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性方面發(fā)揮著重要作用，還可以在腫瘤微環(huán)境中介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間的相互聯(lián)系，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和獲得性化療耐藥[32-33]。

大量研究證明，腫瘤細(xì)胞可以通過內(nèi)吞或釋放含有致癌或抑制因子miRNA 的外泌體，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞化療耐藥[34-35]。Zhu 等[36]的研究證明低氧條件及相關(guān)分子可以誘導(dǎo)EOC 相關(guān)巨噬細(xì)胞M2 極化，上調(diào)巨噬細(xì)胞來源的外泌體miR-223 的表達(dá)水平，這些外泌體可以通過受體細(xì)胞內(nèi)化方式，將miR-223轉(zhuǎn)移到EOC 細(xì)胞中誘導(dǎo)受體細(xì)胞向化療耐藥表型轉(zhuǎn)變，通過PTEN-PI3K/AKT 途徑在體內(nèi)和體外促進(jìn)EOC 化療耐藥?；熯€可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)多耐藥蛋白，并通過外泌體將耐藥性傳遞給其他細(xì)胞。Wang 等[37]研究發(fā)現(xiàn)EOC 的化療過程中，化療藥物不僅可以刺激多耐藥蛋白ABCB1 在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，還可以通過失調(diào)Rab8B 和Rab5 蛋白誘導(dǎo)富含多耐藥蛋白ABCB1 外泌體的分泌、循環(huán)和攝取，耐藥外泌體被受體細(xì)胞攝取后，可以促進(jìn)ABCB1 向質(zhì)膜的再循環(huán)，幫助腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生緊急化療耐藥。

外泌體除了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生獲得性化療耐藥，還可以直接外排或隔離化療藥物，Safaei 等于2005 年研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以將化療藥物從腫瘤細(xì)胞中移除，作為一種阻斷機(jī)制使藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積累量減少，通過降低其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的有效濃度來降低化療藥物的殺傷作用，介導(dǎo)化療耐藥。

5 結(jié)語

近年來，外泌體在腫瘤中的廣泛研究，隨著敏感、快速的生物傳感器的應(yīng)用，其生物學(xué)特性不斷被認(rèn)識(shí)，外泌體及其內(nèi)容物被認(rèn)為是早期識(shí)別腫瘤的新的生物標(biāo)志物，在發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。外泌體在EOC 的發(fā)生、早期診斷、侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥及判斷預(yù)后中具有重要的研究?jī)r(jià)值，期望通過進(jìn)一步深入研究，外泌體可以成為EOC 早期診斷、判斷預(yù)后的重要標(biāo)志物，為EOC 提供新的潛在特異性治療靶點(diǎn)，為EOC 患者帶來更多福音。