紅景天苷對小鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用及其機制

王建宇 高倩 張莉 王勇朝 崔永健 魏琰 (衡水市人民醫(yī)院神內(nèi)二科,河北 衡水 053000)

缺血性腦卒中表現(xiàn)為高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的三高特點,給社會和患者家庭造成極大的精神及經(jīng)濟壓力〔1～3〕。正常大腦的血管被堵塞后,造成血液供應(yīng)被中斷,進(jìn)而造成局部腦組織缺血缺氧,最終導(dǎo)致腦細(xì)胞的壞死或凋亡等〔4,5〕,即使在一定時間內(nèi)血液供應(yīng)得以恢復(fù),但大腦的功能卻不能得到及時的恢復(fù),反而會加重腦神經(jīng)的功能障礙,即腦缺血再灌注損傷〔6,7〕。目前,針對缺血性腦卒中仍沒有十分有效的治療方案,近年來,藥物性保護(hù)成為臨床醫(yī)學(xué)關(guān)注的治療方案之一〔8～10〕。

紅景天苷是來源于紅景天的一種有效的生物活性成分,是我國十分珍貴的傳統(tǒng)中藥之一,擁有悠久的藥用歷史〔11～13〕。研究表明,其具有抗氧化作用,可抑制腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng),改善缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺陷,對腦組織發(fā)揮保護(hù)作用〔14～16〕。紅景天苷對小鼠腦缺血和脊髓損傷均具有保護(hù)作用,并且這種保護(hù)作用的機制是通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的偏振分化而發(fā)揮作用〔17,18〕。腦缺血再灌注后紅景天苷對腦組織的保護(hù)機制鮮有報道,因此本文通過建立小鼠大腦中動脈缺血再灌注模型,觀察紅景天苷對腦組織的保護(hù)作用,并對其可能的作用機制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8～12 周齡SPF 級C57/BL6 小鼠(22±25 g) 購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 藥品與試劑 紅景天苷由河北中醫(yī)藥科學(xué)院提供,純度大于95%;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Sigma (T8877);動物組織總RNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司;DP431);cDNA 第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司;KR103-03);SYBR Green(天根生化科技有限公司;FP209);B 淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2 抗體(CST 15071);Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)抗體(CST 14796);cleaved-半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3 抗體(CST 9664);神經(jīng)元核抗原(Neun)抗體(CST 12943);細(xì)胞色素(Cytochrome)C 凋亡檢測試劑盒(Biovision K257-100);TUNEL 凋亡檢測試劑盒(Roche 11684817910)。

1.1.3 儀器 冰凍切片機(Leica CM1950);線栓(Doccol,602156PK5Re);激光多普勒血流儀(Peri-Flux5001);通用型小動物麻醉機(瑞沃德R500);體溫維持儀(瑞沃德69020);體視顯微鏡(Olympus SZX7);激光掃描共聚焦顯微鏡 (Olympus,FV3000);熒光定量PCR 儀(ABI 7500).

1.2 實驗分組 為篩選出紅景天苷的最佳劑量,兩大組實驗被設(shè)計。實驗一:大腦中動脈阻塞60 min再灌注后,分別通過尾靜脈注射不同劑量的紅景天苷〔2.5,5.0,10.0,20.0 mg/(kg·d)〕及同體積的磷酸鹽緩沖液(PBS),連續(xù)注射3 d。第3 天進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分,根據(jù)評分結(jié)果篩選出紅景天苷的最佳劑量。實驗二:實驗分為假手術(shù)(Sham)組、MCAO+Vehicle 組、MCAO+Sal 組,再灌注后及時通過尾靜脈注射紅景天苷,Sham 組和MCAO + Vehicle組注射相同體積的PBS。

1.3 MCAO 模型制作 氣體麻醉后,固定于加熱板上,使小鼠體溫維持在(37±0.5)℃,立體顯微鏡下,在頸部中間剪一小口,鈍性分離肌肉,暴露出左側(cè)頸總動脈(CCA),鈍性分離并打活結(jié),繼續(xù)往內(nèi)上方分離出頸外動脈(ECA),遠(yuǎn)心端打死結(jié),近心端打活結(jié),外下方分離出頸內(nèi)動脈(ICA),用動脈夾夾閉,在頸外動脈的近心端與遠(yuǎn)心端中間處剪一小口,將線栓從此處插入頸內(nèi)動脈,避開翼額動脈,線栓頭端距頸動脈分叉處9～10 mm 感覺有輕微阻力時停止。通過多普勒血流儀(Peri Flux System 5000,Perimed) 判斷血液流速,下降至70%～80%即為模型成功,缺血60 min 后將線栓輕輕抽出再灌注,縫合切口,待小鼠蘇醒后,放回飼養(yǎng)籠中,進(jìn)行后續(xù)實驗。Sham 組操作同上,不插入線栓。

1.4 免疫熒光染色 小鼠麻醉致死,灌流固定,30 μm冰凍切片,PBS 洗5 min 3 次,5%BSA 室溫封閉1 h,PBS 洗,一抗4℃孵育過夜,PBS 洗5 min 3 次,二抗室溫孵育1 h,PBS 洗5 min 3 次,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核5 min,PBS 洗滌,封片鏡檢。

1.5 Western 印跡 小鼠麻醉致死,冷PBS 灌流,取半暗帶組織,提取組織總蛋白,BCA 法測蛋白濃度,變性。按各組蛋白濃度等質(zhì)量上樣,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過夜,PBST 洗5 min 3 次,二抗室溫孵育2 h,PBST 洗5 min 3 次,加發(fā)光液,暗室曝光,掃描儀對膠片進(jìn)行掃描,獲取清晰條帶圖片,Image J 進(jìn)行灰度分析。

1.6 腦梗死體積測定 小鼠麻醉致死,冷PBS 灌流,取腦,-20℃冷凍10 min,取出后放置小鼠腦槽中,1 mm 厚度連續(xù)6 片冠狀切片,2%TTC 37℃孵育30 min,4%多聚甲醛(PFA)終止反應(yīng)并固定,拍照。Image J 計算梗死區(qū)占對側(cè)半球體積百分比。

1.7 qPCR 小鼠麻醉致死,冷PBS 灌流,取半暗帶組織,液氮速凍,按動物組織總RNA 提取試劑盒操作步驟,提取組織總RNA,1.2%核酸膠檢測RNA 完整性,并對RNA 濃度進(jìn)行測定。按cDNA 第一鏈合成試劑盒操作步驟,反轉(zhuǎn)錄cDNA,上機進(jìn)行qPCR 檢測。

1.8 神經(jīng)功能缺陷評分 參考Li 等〔19〕的14 分制,分別對再灌注后0、1、3、5、7、14、21 d 進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism6 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 缺血再灌注后不同劑量紅景天苷對神經(jīng)功能恢復(fù)的影響 2.5,5.0,10.0,20.0 mg/kg 的紅景天苷與溶劑相比,對腦卒中后3 d 的神經(jīng)功能恢復(fù)都有顯著促進(jìn)作用〔(8.856 ±0.325) 分、(7.700 ±0.227)分、(7.471±0.288)分、(6.043±0.201)分、(7.400 ± 0.324) 分;P＜0.05,P＜0.001〕, 但10.0 mg/kg的效果最好,表明10 mg/kg 為紅景天苷的最佳劑量,這一劑量被用于之后的實驗。

2.2 缺血再灌注后紅景天苷減小了梗死體積,降低了神經(jīng)功能缺陷評分 缺血再灌注3 d,與Sham 組相比,MCAO+Vehicle 組、MCAO+Sal 組均出現(xiàn)了明顯梗死,神經(jīng)功能缺陷明顯。與MCAO+Vehicle 組〔(43.92±1.06)%〕相比,MCAO+Sal 組梗死體積〔(39.31±0.93)%〕顯著減小(P＜0.01)。再灌注1、3、5、7、14、21 d 神經(jīng)功能缺陷評分顯著降低(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 兩組不同時間神經(jīng)功能缺陷評分比較(±s,n=6,分)

表1 兩組不同時間神經(jīng)功能缺陷評分比較(±s,n=6,分)

與MCAO+Vehicle 組比較:1)P＜0.05

1 d3 d5 d7 d14 d21 d MCAO+Vehicle 組11.16±0.3110.17±0.329.84±0.358.31±0.218組別.00±0.376.50±0.43 MCAO+Sal 組8.83±0.311)8.50±0.221)7.83±0.261)6.67±0.191)5.35±0.231)4.17±0.341)

圖1 缺血再灌注后紅景天苷對梗死體積與神經(jīng)功能缺陷的影響

2.3 缺血再灌注后紅景天苷抑制了缺血半暗帶神經(jīng)元的丟失 缺血再灌注3 d,與Sham組相比,MCAO+Vehicle 組、MCAO+Sal 組缺血半暗帶NeuN陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.001);與MCAO + Vehicle 組相比,MCAO + Sal 組缺血半暗帶NeuN 陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.001),紅景天苷抑制了缺血半暗帶神經(jīng)元的丟失。見表2、圖2。

表2 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶NeuN、TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)的影響(±s,n=4,個)

表2 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶NeuN、TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)的影響(±s,n=4,個)

與Sham 組比較:1)P＜0.001;與MCAO+Vehicle 組相比較:2)P＜0.001

組別NeuNTUNEL Sham 組2 768.13±80.991.1825±0.39 MCAO+Vehicle 組299.61±19.141)507.09±9.971)MCAO+Sal 組691.79±42.811)2)314.67±9.871)2)

圖2 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶NeuN 陽性細(xì)胞數(shù)的影響(NeuN 染色,×200)

2.4 缺血再灌注后紅景天苷抑制缺血半暗帶腦細(xì)胞凋亡 缺血再灌注3 d,Sham 組未見TUNEL 陽性細(xì)胞的表達(dá),MCAO+Vehicle 組、MCAO+Sal 缺血半暗帶均能明顯觀察到TUNEL 陽性細(xì)胞表達(dá)。與MCAO+Vehicle 組相比,MCAO+Sal 組缺血半暗帶TUNEL 陽性細(xì)胞的表達(dá)數(shù)量明顯減少(P＜0.001)。見表2、圖3。

圖3 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)的影響(TUNEL 染色,×200)

2.5 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶凋亡相關(guān)蛋白及mRNA 表達(dá)量的影響 缺血再灌注3 d,與Sham 組相比,MCAO+Vehicle 組、MCAO + Sal 組Bax、Cytochrome C、Caspase-3 蛋白及mRNA 表達(dá)量顯著上升(P＜0.05),Bcl-2 蛋白及mRNA 顯著性下降(P＜0.05)。與MCAO+Vehicle 組相比,MCAO+Sal 組的Bax、Cytochrome C、Caspase-3 蛋白及mRNA表達(dá)顯著性下降,Bcl-2 蛋白及mRNA 顯著上升(P＜0.05)。見表3、圖4。

表3 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶凋亡相關(guān)蛋白及mRNA 表達(dá)量的影響(±s)

表3 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶凋亡相關(guān)蛋白及mRNA 表達(dá)量的影響(±s)

與Sham 組比較:1)P＜0.05;與MCAO+Vehicle 組比較:2)P＜0.05

組別Bcl-2蛋白(n=6) mRNA(n=4)Bax蛋白(n=6) mRNA(n=4)Cytochrome C蛋白(n=6) mRNA(n=4)Caspase-3蛋白(n=6) mRNA(n=4)7±0.031.00±0.210.14±0.021.00±0.30 MCAO+Vehicle 組 0.22±0.031) 0.31±0.241) 0.73±0.021) 1.96±0.311) 0.90±0.021) 3.37±0.361) 0.66±0.031) 2.37±0.401)MCAO+Sal 組0.37±0.021)2) 0.55±0.211)2) 0.39±0.021)2) 1.45±0.271)2) 0.51±0.031)2) 1.98±0.351)2) 0.53±0.021)2) 1.65±0.411)2)Sham 組0.77±0.031.00±0.230.27±0.011.00±0.250.2

圖4 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

3 討 論

紅景天苷屬于景天科植物紅景天的一種有效的生物活性成分,是我國十分珍貴的傳統(tǒng)中藥之一,具有抗疲勞、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除氧自由基等多種藥理作用。有文獻(xiàn)報道紅景天苷對心肌缺血具有保護(hù)作用,抑制心肌細(xì)胞的凋亡〔19～21〕。但腦缺血再灌注后紅景天苷對腦組織的保護(hù)機制鮮有報道。本研究結(jié)果表明,紅景天苷減小了缺血再灌注后缺血側(cè)的梗死體積,同時降低了神經(jīng)功能缺陷評分,證明了紅景天苷對腦缺血再灌注具有保護(hù)作用。神經(jīng)保護(hù)是治療缺血性腦卒中的重要途徑之一,本研究結(jié)果表明,缺血再灌注后紅景天苷抑制了缺血半暗帶神經(jīng)元的丟失及腦細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是缺血再灌注后細(xì)胞的死亡方式之一,受多種基因與蛋白的調(diào)控〔22〕。Bcl-2 家族是目前研究較多的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因家族,該家族中抗凋亡因子Bcl-2 和促凋亡因子Bax 在細(xì)胞凋亡過程起著促進(jìn)與抑制的作用〔23〕。Cytochrome C 在凋亡中起著非常重要的作用,常被看作是凋亡的起始標(biāo)志。此蛋白位于線粒體外膜和內(nèi)膜間的空隙中,凋亡誘導(dǎo)物能引發(fā)Cytochrome C 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中,并在此與凋亡酶激活因子(Apaf)-1 結(jié)合,Cytochrome C/Apaf-1 復(fù)合物激活Caspase-9,進(jìn)而激活Caspase-3〔24〕。Caspases 是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶,凋亡的最后實施是通過Caspases 的激活而實現(xiàn)的,Caspase-3 是Caspases級聯(lián)反應(yīng)中下行的最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,其表達(dá)量的高低預(yù)示著凋亡程度的高低〔25,26〕。本研究結(jié)果表明,腦缺血再灌注后,紅景天苷對腦細(xì)胞凋亡的抑制作用的其中一條途徑是通過上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2或下調(diào)促凋亡因子Bax 的表達(dá),抑制Cytochrome C 從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放,進(jìn)而下調(diào)Caspase-3 的表達(dá),即通過抑制細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑而發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。