ET-1作為癌前病變分子標(biāo)志物的價(jià)值及應(yīng)用

孟韜 張大偉 ( 吉林省人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科,吉林 長(zhǎng)春 3000; 長(zhǎng)春市人民醫(yī)院普通外科)

直腸癌系源于上皮的腫瘤,其中腺癌占95%,也是最常見(jiàn)的消化道腫瘤,在大城市發(fā)病率明顯上升。經(jīng)深入研究,約70%是由腺瘤性息肉演變而來(lái)。隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,癌變過(guò)程中的基因改變逐漸被認(rèn)識(shí),已知直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段、多基因參與的細(xì)胞遺傳性疾病;因此尋找一種特異的分子標(biāo)志物對(duì)直腸癌的早期診斷十分重要。隨分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的提高,對(duì)直腸癌生物學(xué)特性的不斷深入,內(nèi)皮素(ET)及其拮抗劑成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。ET 在諸多惡性腫瘤中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)狀態(tài),并參與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、血管重構(gòu)等〔1〕,其中以ET-1 的表達(dá)最為突出〔2〕,多項(xiàng)研究〔3～5〕先后報(bào)道了ET-1 在乳腺癌組織及血液中呈高表達(dá)狀態(tài),可作為腫瘤標(biāo)志物檢測(cè),然而在直腸癌中表達(dá)情況國(guó)內(nèi)報(bào)道甚少。本研究擬分析ET-1 作為癌前病會(huì)分子標(biāo)志物的價(jià)值及應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集與分組 前瞻性收集吉林省人民醫(yī)院肛腸外科直腸癌患者60 例(直腸癌組);其中女23 例,男37 例;年齡58～88 歲,中位年齡73 歲;直腸癌病理類型:腺癌30 例、黏液腺癌15 例、腺鱗癌10 例、其他特殊型癌5 例。取癌旁正常良性組織標(biāo)本30 例為良性組,癌前病變組織標(biāo)本30 例(腺瘤)為癌前病變組。入選前均經(jīng)腸鏡檢查,明確病理學(xué)診斷。另選健康志愿者血清標(biāo)本20 例為血清對(duì)照。入組標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前均行腸鏡檢查并取病理活檢,明確病理診斷為直腸癌、良性腺瘤;②未接受過(guò)放、化療、靶向等抗腫瘤藥物治療;③預(yù)期生存期≥3 個(gè)月;④輔助檢查評(píng)估心、肝、腎等主要臟器功能基本正常。排除標(biāo)準(zhǔn):①接受過(guò)放化療治療、靶向治療;②合并骨轉(zhuǎn)移、嚴(yán)重骨質(zhì)疏松;③存在嚴(yán)重或不能控制的全身性疾病者;④無(wú)法控制的活動(dòng)性感染、各類傳染病者。所有患者自愿入組,符合醫(yī)學(xué)倫理標(biāo)準(zhǔn)。將3 組病理組織適量分別放入30%甲醛浸液中保存待測(cè)。

1.2 直腸癌組織ET-1 檢測(cè) 采用免疫組化法(IHC)測(cè)定,標(biāo)本用ABC 法標(biāo)記:①制作石蠟切片;②脫蠟;③去除內(nèi)源酶3%H2O215 min;④蒸餾水與0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4) 浸洗;⑤一抗:兔抗大鼠ET-1 抗血清(上海德波生物技術(shù)有限公司)1 ∶400,4℃過(guò)夜孵育;⑥PBS 浸洗;⑦二抗:生物素化羊抗兔抗血清1 ∶500,37℃30 min;⑧PBS浸洗;⑨三抗:ABC 復(fù)合物,1 ∶100,37℃40 min;○10二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,5 min。每例切片選5 個(gè)高倍視野(×400),隨即選測(cè)80～100 個(gè)ET-1 細(xì)胞吸光度值,計(jì)算平均吸光度值,以平均值(A)表示細(xì)胞中的ET-1 的含量。

1.3 血清ET-1 檢測(cè) 清晨空腹采集右肘部靜脈血3～5 ml,手術(shù)患者術(shù)前1～3 d 采集。采集完成后注入含10%乙二胺四乙酸二鈉和抑肽酶的試管中混勻(上海艾研生物、貨號(hào)367863、6 ml),4℃下,3 000 r/min離心15～20 min。分離出血清用0.1%TFA 6 ml 酸化,3 000 r/min離心20 min 后取其上清液,放置于-80℃冰箱保存待測(cè)。術(shù)后7～10 d 再次采集血液標(biāo)本,制作及保存方法同上。

1.4 結(jié)果判定 IHC:應(yīng)用德國(guó)CMIAS-008 型真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析儀,IHC 標(biāo)記顯示:ET-1 陽(yáng)性細(xì)胞其胞質(zhì)表現(xiàn)為棕黃色或黃色細(xì)顆粒狀,若陽(yáng)性細(xì)胞在標(biāo)記的細(xì)胞總數(shù)中超過(guò)60%者,標(biāo)記為陽(yáng)性病例。PCR:試劑盒為進(jìn)口Austria 生產(chǎn),儀器:γ 計(jì)數(shù)儀為美國(guó)bookman。主要技術(shù)參數(shù):ET-1 測(cè)定范圍20～4 680 pg/ml,靈敏度10 pg/ml,回收率平均95%～100%,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)＜5%,批間CV＜10%,正常參考值38.78～71.50 pg/ml。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 IHC 測(cè)定3 組ET-1 吸光度值比較 直腸癌組平均吸光度值(0.233±0.071)＞癌前病變組(0.107±0.060)＞良性組(0.029±0.072),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 術(shù)前、術(shù)后3 組血清ET-1 水平比較 術(shù)前直腸癌組血清ET-1 表達(dá)水平〔(77.87±7.98)pg/ml〕明顯高于癌前病變組〔(51.21±8.43)pg/ml〕和良性組〔(42.28±8.34)pg/ml;P＜0.01〕,術(shù)后〔(72.25±8.56)pg/ml〕較術(shù)前明顯降低(P＜0.01),但仍顯著高于良性組和癌前病變組(P＜0.01)。

2.3 直腸癌組織與臨床病理分級(jí)、淋巴結(jié)、TNM 分期的關(guān)系 直腸癌組血清ET-1 與組織ET-1 表達(dá)結(jié)果吻合,組織學(xué)分級(jí)越差表達(dá)越高、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者表達(dá)越高、TNM 分期越高表達(dá)越高(均P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 組織ET-1、血清ET-1 與直腸癌臨床特征關(guān)系(±s)

表1 組織ET-1、血清ET-1 與直腸癌臨床特征關(guān)系(±s)

臨床病理n組織ET-1t 或F 值P 值血清ET-1t 或F 值P值組織學(xué)分級(jí) 高分化100.171±0.0612.923＜0.0573.42±08.235.668＜0.05中分化280.209±0.09176.37±08.24低分化220.293±0.05279.45±09.73淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陽(yáng)性360.305±0.03818.694＜0.0581.82±08.714.346＜0.05陰性240.125±0.03469.77±09.12 TNM 分期 Ⅰ～Ⅱ期260.191±0.09214.381＜0.0574.76±08.563.062＜0.05Ⅲ期220.225±0.08576.47±08.52Ⅳ期120.338±0.08882.82±08.62

3 討 論

ET 是1988年由Yanagisawa 等〔6〕首次從培養(yǎng)的豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液中分離并純化出來(lái),由21種氨基酸殘基組成的一種血管活性多肽,具有多種生物學(xué)作用〔7〕,如收縮血管、導(dǎo)致疼痛、促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。在正常人血液中ET 主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,起到一種神經(jīng)調(diào)節(jié)因子或局部激素樣作用,ET-1 有兩個(gè)同分異構(gòu)體〔8〕:ET-1、ET-2。其中ET-1起決定性生理作用〔2〕,腫瘤細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體CCR7 可被ET-1 與受體ETA 結(jié)合作用及同HIF-let協(xié)調(diào)共同促進(jìn),其表達(dá)的趨化因子受體可以通過(guò)其趨化性誘導(dǎo)入侵和轉(zhuǎn)移及肌動(dòng)蛋白聚合和偽足的形成,如通過(guò)淋巴轉(zhuǎn)移,顯示腫瘤的器官特異性轉(zhuǎn)移〔9,10〕。近年來(lái)研究表明ET-1 大量存在于惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi),與腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)關(guān)系密切〔11〕。而國(guó)內(nèi)對(duì)ET-1 在直腸癌組織內(nèi)報(bào)道甚少。

本研究結(jié)果說(shuō)明直腸癌組織細(xì)胞內(nèi)大量存在ET-1,多項(xiàng)研究提出在乳腺癌患者組織及血清中含有大量ET〔3～5〕,并可作為乳腺腫瘤標(biāo)志物檢測(cè),與胃癌組織內(nèi)表達(dá)相同。本文結(jié)果還說(shuō)明,ET-1 在直腸癌患者腫瘤組織中及血液中大量存在,癌前病變內(nèi)也廣泛存在,因此聯(lián)合ET-1 檢測(cè)對(duì)直腸癌的篩查及協(xié)助直腸癌診斷同樣具有一定參考價(jià)值,并可以單獨(dú)作為直腸癌腫瘤的分子標(biāo)志物,其血清學(xué)檢測(cè)方法快捷、便利、且無(wú)創(chuàng)。

本研究結(jié)果表明,直腸癌惡性程度越高,ET-1表達(dá)水平及平均吸光度值越高,其中在低分化直腸癌中ET-1 表達(dá)最高,如合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)會(huì)更加明顯,分期越高表達(dá)越高。這可能因?yàn)閻盒猿潭雀叩闹蹦c癌細(xì)胞,其增殖、浸潤(rùn)能力較強(qiáng),所以其在腫瘤增殖及浸潤(rùn)中扮演重要角色,與相關(guān)研究?jī)?nèi)容一致〔12,13〕。這對(duì)判斷直腸癌患者臨床分期、惡性程度和預(yù)后有重要意義。另外本文進(jìn)一步說(shuō)明ET-1表達(dá)情況和直腸癌轉(zhuǎn)移具有相互一致性,并可以作為判斷預(yù)后的一項(xiàng)因素。故臨床應(yīng)用中可以通過(guò)檢測(cè)ET-1 初步評(píng)價(jià)患者病理、臨床分期,甚至可以判斷遠(yuǎn)期預(yù)后。本研究還存在不足之處:(1)目前標(biāo)本收集數(shù)量有限,需要大量數(shù)據(jù)支持;(2)病理類型較多未進(jìn)行細(xì)化;(3)癌前病變標(biāo)本單一,本研究只有腺瘤,需要更多癌前病變標(biāo)本加以支持;(4)血清ET-1 對(duì)判斷遠(yuǎn)期預(yù)后還需要進(jìn)一步隨訪。目前還有學(xué)者研究ET 能促使癌細(xì)胞血管、淋巴管生成〔14,15〕,雖然ET 在不同組織的具體作用還存在一定爭(zhēng)議,但ET-1 在上述腫瘤中表達(dá)明顯,因此利用ET 受體拮抗劑行分子靶向治療將成為治療胃癌的新希望,有待于更多臨床數(shù)據(jù)證實(shí)。