我國(guó)香菇雜交育種相關(guān)技術(shù)發(fā)展*

胡建平

（1．慶元縣食用菌科研中心，浙江 慶元 323800；2．食用菌生物科技浙江省工程研究中心，浙江 慶元 323800）

食用菌在我國(guó)已經(jīng)成為第五大農(nóng)作物，其中香菇（Lentinula edodes）產(chǎn)量占第一。香菇栽培發(fā)源于浙江慶元，至今已經(jīng)有800多年歷史[1]。同其他農(nóng)作物的種子一樣，菌種的品質(zhì)是其生產(chǎn)的重要制約因素。香菇的育種技術(shù)日趨成熟，目前主要的育種技術(shù)包括：人工選擇育種、雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種以及分子標(biāo)記輔助育種。在眾多香菇育種方法中，雜交育種是非常重要的育種技術(shù)，因其育種目標(biāo)性較好，是今后一段時(shí)間里香菇品種選育的主要手段[2]。雜交育種是一個(gè)系統(tǒng)性工程，包括雜交模式的選擇、親本的選擇、雜交種鑒定篩選以及交配型鑒定等。通過將香菇雜交育種及香菇技術(shù)發(fā)展進(jìn)行綜述，為開展香菇雜交育種等工作提供借鑒。

1 香菇雜交育種相關(guān)概念及模式

1.1 單核體

香菇菌絲的每個(gè)細(xì)胞中有2個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞核，通過2個(gè)細(xì)胞核的相互作用，完成香菇遺傳物質(zhì)的傳遞。在雜交前首先要得到細(xì)胞中只含一個(gè)細(xì)胞核的單核菌絲。由孢子萌發(fā)而得到的單核體稱為孢子單核體，通過原生質(zhì)體制備而得到的單核體為原生質(zhì)體單核體。

1.2 交配型

香菇的交配型由A、B兩個(gè)交配因子控制，香菇屬于異宗結(jié)合的四極性擔(dān)子菌，即必需由2個(gè)不同交配型的菌絲細(xì)胞交配才能生育。一個(gè)香菇菌株分別含有2對(duì)不相容的交配因子（A1和A2、B1和B2），同時(shí)每個(gè)交配因子含有許多復(fù)等位基因，使得香菇自然群體的交配型非常龐大。只有A、B因子均不同時(shí)，單核體才能配對(duì)成雙核體[3]。

1.3 雜交種

將來自2個(gè)親本的單核體通過不同的技術(shù)手段進(jìn)行配對(duì)可得到雙核菌株，即具有2個(gè)親本各一半遺傳物質(zhì)的新菌株，即雜交種。形成雜交種的過程也稱雙核化，異宗結(jié)合擔(dān)子菌包括交互、單向、限制性3類雙核化[4]。

1.4 單-單雜交

利用不同的細(xì)胞核的單核體進(jìn)行兩兩組合配對(duì)，當(dāng)兩個(gè)單核體交配型符合配對(duì)規(guī)則時(shí)，會(huì)形成雙核菌株，這個(gè)過程即單-單雜交。利用單-單雜交技術(shù)取得的成果較為顯著，比如香菇新品種L934與L937的選育[5]、Cr系列的選育[6]、撫香一號(hào)的選育[7]等。

1.5 雙-單雜交

布勒現(xiàn)象是指1931年布勒發(fā)現(xiàn)的單核菌株會(huì)被雙核菌株雙核化，即單核體與雙核菌絲接觸生長(zhǎng)時(shí)，單核體細(xì)胞核會(huì)與雙核菌絲中的一個(gè)細(xì)胞核形成新的雙核菌株的現(xiàn)象；香菇也具有布勒現(xiàn)象，利用單核菌株雙核化進(jìn)行的雜交育種即雙-單雜交[8]。由于“先導(dǎo)核效應(yīng)”，即當(dāng)可親和的單核菌絲與雙核菌絲接觸生長(zhǎng)時(shí)，雙核菌株中只有其中一個(gè)特定的核進(jìn)入單核體構(gòu)成新的雙核菌株[9]，因此一種雙-單雜交配對(duì)組合只形成一種核型的雜交種。同時(shí)研究表明，先導(dǎo)核的遷移速受B交配因子控制[10]，相同單核體與不同雙核菌株雜交形成的雜交種是同質(zhì)異核體[11]。利用雙單雜交，育種家們成功選育出香菇新品種申香8 號(hào)[12]、申香 10 號(hào)[13]與 JW 系列[14]。

1.6 自交

自交包括多孢自交和單孢自交。多孢自交即同一菌株的孢子制作成合適濃度的孢子懸浮液，涂布于PDA培養(yǎng)皿中，萌發(fā)后各菌落生長(zhǎng)交織起來后，形成具有拮抗線的多個(gè)小塊，分別挑取其中一小塊，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，經(jīng)拮抗等鑒定，得到雜交種，香菇新品種“申香1644”的選育就采用了多孢自交技術(shù)[15]。單孢自交則是同一菌株，通過孢子收集、單核體制備后，進(jìn)行配對(duì)組合，經(jīng)過鏡檢挑取雜交種的方法。

1.7 多孢雜交

多孢雜交是利用收集到的不同親本菌株的孢子，制成合適濃度混合的懸液，經(jīng)過與多孢自交相同的涂布、挑取等工序得到雜交種的過程。

由于多孢雜交、多孢自交不像單孢雜交一樣能夠明確知道是由哪2個(gè)單核體配對(duì)組合而成，且關(guān)于多孢自交與多孢雜交報(bào)道的文獻(xiàn)也較少，對(duì)于要進(jìn)一步進(jìn)行遺傳學(xué)分析的育種，不建議過多涉及。因此建議利用孢子、原生質(zhì)體制備等技術(shù)首先得到單核體，再進(jìn)行自交或雜交，更利于后續(xù)工作的開展。

2 親本的篩選

親本的選擇至關(guān)重要，關(guān)系著雜交育種的效率和最終能否得到目標(biāo)菌株。因此應(yīng)根據(jù)基因型對(duì)雜交后代的性狀有較為準(zhǔn)確的預(yù)判，再根據(jù)育種目標(biāo)篩選親本[16]。然而以往在選擇親本時(shí)，更多的育種人是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)與技巧進(jìn)行篩選，不能較精準(zhǔn)的預(yù)判育種結(jié)果，導(dǎo)致育種效率較為低下。

為此，科研工作者在親本篩選上進(jìn)行了一定的研究與探索?？梢岳镁垲惙治龇ㄟx擇香菇雜交親本[17]，親本間DNA的相似值作為親緣關(guān)系的判斷標(biāo)準(zhǔn)[18]。隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）標(biāo)記[19]，簡(jiǎn)單重復(fù)性序列間區(qū)（ISSR）標(biāo)記[20]技術(shù)都可用于分析親本間的親緣關(guān)系等，并據(jù)此選擇親本。

育種家認(rèn)為，親本來源地與雜交后代栽培地相同時(shí)，選育出的子代出菇率更高[21]。另外研究表明，目前我國(guó)在用的香菇菌種種質(zhì)來源比較窄[22-23]，已經(jīng)成為制約香菇生產(chǎn)的一大因素。因此在香菇育種中要注重收集野生種質(zhì)資源，經(jīng)過評(píng)價(jià)后，能夠利用雜交技術(shù)將更多的野生香菇基因引入主栽品種體系中。

在親本篩選方面，雖然已經(jīng)開展了一些科研工作，但仍然是依據(jù)經(jīng)驗(yàn)者居多。如何構(gòu)建系統(tǒng)的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)體系，同時(shí)利用先進(jìn)的表型組學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)，為雜交育種選擇更合適的親本，是目前面臨的重要挑戰(zhàn)，也是關(guān)系雜交育種效率和靶向性的問題。

3 單核體及其制備

3.1 孢子單核體

孢子單核體是指由孢子萌發(fā)而成的單核體。孢子單核體的制備，首先是得到親本子實(shí)體，收集其彈射出來的孢子，通過制作孢子懸浮液，涂布后，挑取單菌落，經(jīng)過鏡檢鑒定最終得到單核體。由于孢子單核體經(jīng)過了有性生殖過程，孢子中的遺傳物質(zhì)發(fā)生過重組等，得到的單核體遺傳物質(zhì)同親本具有較大差異[24]。

3.2 原生質(zhì)體單核體

利用溶壁酶溶解親本的雙核菌絲細(xì)胞壁制備原生質(zhì)體，再在恢復(fù)培養(yǎng)基中使其恢復(fù)細(xì)胞壁和生長(zhǎng)，在原生質(zhì)體恢復(fù)過程中會(huì)形成部分只具有一個(gè)細(xì)胞核的菌落，挑取并篩選這些單菌落，即得到原生質(zhì)體單核體，這些單核體由于沒有經(jīng)過有性生殖世代，其遺傳性狀同親本保持高度的一致[25]。

4 雜交種鑒定、篩選、種性保持

雜交育種的最終目的是能夠在眾多交配組合中選到符合育種目標(biāo)的雜交種，因此還涉及雜交種的鑒定、篩選以及后續(xù)的保藏等。

雜交配對(duì)組合要求達(dá)到一定的數(shù)量，才能獲得符合預(yù)期的雜交種。然而傳統(tǒng)的方法是經(jīng)過顯微鏡檢觀察鎖狀聯(lián)合挑取雜交種，再經(jīng)過鑒定、菌絲培養(yǎng)和出菇試驗(yàn)，最終篩選出雜交種，這樣的操作工作量大，效率不高且耗時(shí)長(zhǎng)。

雜交種鑒定可以用拮抗試驗(yàn)進(jìn)行，但是拮抗反應(yīng)在遺傳關(guān)系較近的菌株間分辨率不高，且易受環(huán)境及操作者經(jīng)驗(yàn)等因素的制約[26]，因此拮抗試驗(yàn)只能作為初步判斷結(jié)果[27]。為提高判斷準(zhǔn)確性，育種家將拮抗試驗(yàn)與酯酶同工酶酶譜連用進(jìn)行綜合判斷[28]?；疑P(guān)聯(lián)度分析也被用于雜交種的篩選中[29-30]，然而此分析方法要求將雜交種進(jìn)行出菇試驗(yàn)，根據(jù)觀察與相關(guān)結(jié)果進(jìn)行分析，需要投入大量的資源和時(shí)間。

研究表明，在分子水平通過雜交種DNA多態(tài)分析，聚類分析等手段是可以有效提高雜交育種效率的[29]。RAPD分析因其靈敏度高、可重復(fù)性強(qiáng)、易操作而被引入到雜交育種分析中[31]。之后內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析[32]、ISSR[33]、信使 RNA（mRNA）差異顯示技術(shù)[34]等相繼用于香菇雜交育種中。

對(duì)于雜交種篩選出來后如何進(jìn)行種性保持等方面的研究較少，黃秀治[35]研究了雜交種多孢自交、雜交種組織分離、親本單核體重新配對(duì)、雜交種自交、原始菌株傳代等對(duì)雜交種種性保持的影響，認(rèn)為原始菌株傳代、雜交種組織分離、雜交種自交可以得到穩(wěn)定的菌株，同時(shí)自交還能提高雜交優(yōu)勢(shì)。

5 交配型及其鑒定

交配型的鑒定與研究香菇雜交育種密切相關(guān)[36]，只有符合交配規(guī)則的交配型單核體組合才能配對(duì)形成雜交種。香菇作為異宗結(jié)合的四極性擔(dān)子菌，每個(gè)菌株子實(shí)體能夠至少形成4種交配型[37]，而且在香菇這個(gè)群體中，不同菌株有著許多的交配因子復(fù)等位基因，據(jù)估算香菇群體中存在121個(gè)A因子和151個(gè)B因子[38]。

香菇交配型基因有許多應(yīng)用：1）遺傳研究，估測(cè)自然群體中香菇的不親合因子數(shù)；2）種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與種質(zhì)庫建設(shè)；3）菌種鑒定，以原生質(zhì)體單核體的交配型作為標(biāo)準(zhǔn)，采用交配型分子標(biāo)記進(jìn)行菌種鑒定[36，39]；4）菌種退化指標(biāo)，以交配型基因的復(fù)等位性和多態(tài)性為依據(jù)，以待測(cè)菌株的原生質(zhì)體單核體為材料，香菇單核體交配型的異常，可以作為菌種退化的一個(gè)遺傳指標(biāo)[40]。

在雜交配對(duì)組合之前，最好將親本單核體按照交配型進(jìn)行分類，從而提高雜交組合配對(duì)成功率。交配型的檢測(cè)方法主要有兩兩配對(duì)法、標(biāo)準(zhǔn)菌株法及分子標(biāo)記法。兩兩配對(duì)法對(duì)于A、B因子均相同和均不同的配對(duì)組合，通過觀察鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)可以可靠地進(jìn)行判斷；而對(duì)于A相同而B不同的配對(duì)組合和B相同而A不同的組合，則需要通過培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法（OWE-SOJ）加以鑒定[41]。分子標(biāo)記法是基于基因序列分析進(jìn)行交配型鑒定，可以基于單核苷酸多態(tài)性SNP分型[37]、ISSR分型等。

交配型因子存在著偏分離的現(xiàn)象，即一個(gè)菌株的孢子交配型并不趨于1∶1∶1∶1，引起偏分離的原因有很多，可能是致死純合基因[42]、親本來源[43]、親本細(xì)胞質(zhì)遺傳影響[44]、雜交過程中重組與突變[45]等。同樣雙核菌株制備的原生質(zhì)體單核體交配型比例通常也不是趨于1∶1。該比例與核的再生能力和生長(zhǎng)速度有關(guān)[46-47]，偏分離的主要影響因子是B因子，它控制著核的存活率[45]。研究表明，栽培菌株交配型偏分離大于野生菌株[48]。

6 雜交技術(shù)

在雜交技術(shù)上，較為傳統(tǒng)與常見的是先檢測(cè)單核體極性，再進(jìn)行配對(duì)組合；另外一種則是采用單核體菌落形態(tài)觀察，來選擇配對(duì)組合[35]。規(guī)范化的雜交操作有利于提高雜交育種效率以及后續(xù)的遺傳分析，但目前關(guān)于雜交工藝的研究與闡述較少，因此建議對(duì)雜交工藝進(jìn)行研究，形成規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)，便于今后雜交育種工作的開展與交流。

7 展望

雜交育種是現(xiàn)行和今后一段時(shí)間內(nèi)香菇育種的主要方式，為提高雜交育種的效率和目標(biāo)性，應(yīng)該從以下幾個(gè)方面加以深入研究。

7.1 單核菌絲保存技術(shù)

單核體在保藏過程中遺傳性狀較容易發(fā)生改變，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過1年保存后，單核體間生長(zhǎng)差異等變小[49]。單核體能否長(zhǎng)期保存將制約雜交育種，開發(fā)適宜長(zhǎng)期保藏單核體的技術(shù)，如單核體超低溫液氮保存等，已迫在眉睫。同時(shí)還可以研究將單核體雙核化，在使用時(shí)能快速得到該單核體的技術(shù)。

7.2 分子標(biāo)記快速精準(zhǔn)育種

現(xiàn)有的利用DNA多態(tài)性開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)，依據(jù)于某個(gè)群體的多態(tài)性，僅適用于該群體的區(qū)分與鑒定。通過分子標(biāo)記等技術(shù)的開發(fā)與利用，精準(zhǔn)育種已取得一定成效，但是由于遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究較為滯后，所開發(fā)的分子標(biāo)記大部分不是通用的，而僅僅可作為一個(gè)群體（比如幾個(gè)或者幾十個(gè)菌株間）分離鑒定的依據(jù)。靶向測(cè)序基因型檢測(cè)（GBTS）等有望較好的彌補(bǔ)以往分子標(biāo)記不通用的問題。同時(shí)可以結(jié)合基因測(cè)序等現(xiàn)代技術(shù)，定位更多基因，通過基因編輯技術(shù)，創(chuàng)制更多的優(yōu)良育種材料，再利用雜交育種，提高育種效率和目的性。

7.3 高通量表型鑒定

雜交種的鑒定與出菇試驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)仍然是影響雜交育種效率的最主要因素。開發(fā)高通量表型鑒定技術(shù)，能提高出菇試驗(yàn)中考種工作的效率。

7.4 種質(zhì)資源收集與評(píng)價(jià)

育種離不開大量?jī)?yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源，收集全國(guó)乃至全世界的香菇種質(zhì)資源，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)致的評(píng)價(jià)分析，從而為后續(xù)雜交育種的開展提供豐富的親本材料，也是我們要抓緊開展的工作。