羊肚菌生產(chǎn)菌株栽培適宜性評(píng)價(jià)系統(tǒng)

劉偉，蔡英麗，馬曉龍，何培新

1.中國(guó)科學(xué)院 昆明植物研究所，云南 昆明 650201；2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，湖北 武漢 430345；3.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 河南 鄭州 450001

0 引言

羊肚菌(Morchellaspp.)是一類名貴的食藥兼用真菌，百余年來(lái)，科技工作者一直致力于羊肚菌的栽培馴化研究，然而直到1982年才由美國(guó)學(xué)者R.D.Ower真正實(shí)現(xiàn)了室內(nèi)栽培，并進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)，但由于羊肚菌栽培穩(wěn)定性較差，故并未實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期運(yùn)營(yíng)[1-3]。我國(guó)自20世紀(jì)50年代開始進(jìn)行羊肚菌的栽培馴化研究，經(jīng)歷了仿生栽培、堆木栽培、菌根化栽培等模式，直至本世紀(jì)初，首次在川渝地區(qū)成功實(shí)現(xiàn)了以外源營(yíng)養(yǎng)袋為核心技術(shù)的羊肚菌大田栽培，并于2012年走上商業(yè)化生產(chǎn)道路。2020—2021產(chǎn)季的羊肚菌栽培面積已超過(guò)15萬(wàn)畝(1畝=667 m2)，九年間增長(zhǎng)了50余倍，遍布全國(guó)各地[4-6]。然而，羊肚菌產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的背后是近乎70%的種植者無(wú)法穩(wěn)定盈利。除了平棚和簡(jiǎn)易冷棚栽培管理模式無(wú)法抵御異常氣候變化等因素的影響，羊肚菌的育種和制種技術(shù)不夠統(tǒng)一和規(guī)范，菌種評(píng)價(jià)技術(shù)不夠科學(xué)和完善，也是造成栽培菌種質(zhì)量不穩(wěn)定，乃至生產(chǎn)不穩(wěn)定的重要原因[5,7-8]。

菌種是羊肚菌人工栽培的關(guān)鍵。2015年之前，全行業(yè)每年約有30%～40%的栽培面積不出菇或出菇質(zhì)量較差，一個(gè)重要的原因是推廣使用了如黑脈羊肚菌(M.angusticeps)、高羊肚菌(M.elata)、黃色羊肚菌類群(Esculenta clade)等非可栽培種類。目前，隨著對(duì)羊肚菌可栽培種類的認(rèn)知愈加明確，因種類選擇不當(dāng)而導(dǎo)致大面積不出菇的現(xiàn)象已大大減少[9-10]。最近研究[11]發(fā)現(xiàn)，羊肚菌組織分離物(潛在栽培菌株)存在較大比例的交配型基因丟失現(xiàn)象。隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間和代數(shù)的延續(xù)，羊肚菌菌株老化加劇，表現(xiàn)為菌核發(fā)生減少、色素產(chǎn)生提前、生長(zhǎng)速率下降和細(xì)胞死亡事件發(fā)生；老化菌株用于栽培會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量急劇下降[12-13]。上述問(wèn)題均直接影響了羊肚菌栽培的穩(wěn)定性。為了解決這些問(wèn)題，本文總結(jié)了相關(guān)的理論研究成果和生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提出了一套以身份(Identity)識(shí)別、交配型(Mating Type)基因檢測(cè)和菌株活力(Vitality)測(cè)定為主要內(nèi)容的羊肚菌生產(chǎn)菌株栽培適宜性IMV評(píng)價(jià)系統(tǒng),在概述該評(píng)價(jià)系統(tǒng)的理論和技術(shù)原理的基礎(chǔ)上，闡述了每項(xiàng)評(píng)價(jià)技術(shù)的具體操作方法，以實(shí)際應(yīng)用效果驗(yàn)證該評(píng)價(jià)系統(tǒng)的可行性，以期促進(jìn)該評(píng)價(jià)系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，為提高我國(guó)羊肚菌人工栽培的穩(wěn)定性，促進(jìn)羊肚菌產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定和健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 羊肚菌菌株身份識(shí)別

1.1 羊肚菌潛在栽培菌株分類地位確定的必要性

羊肚菌子囊果形態(tài)多變，易受環(huán)境條件的影響，因此羊肚菌屬以下的分類一直是行業(yè)難題[14]。多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建為羊肚菌菌種的分類和鑒定確立了新的準(zhǔn)則。目前全球共確定了78個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種，而我國(guó)至少分布著30個(gè)種[15-19]。早期馴化研究均缺乏物種分類鑒定的內(nèi)容，因此很難判定這些馴化栽培種類(如尖頂羊肚菌(M.conica)、黑脈羊肚菌、粗柄羊肚菌(M.cassipes)、羊肚菌(M.esculenta)和小羊肚菌(M.deliciosa))分類地位的準(zhǔn)確性；另外，它們也無(wú)進(jìn)一步的栽培報(bào)道或推廣應(yīng)用[4]。因此，可以判定除目前廣泛應(yīng)用的3個(gè)黑色羊肚菌類群(Elata clade)種類(梯棱羊肚菌(M.importuna)、六妹羊肚菌(M.sextelata)和七妹羊肚菌(M.eximia))以外，其他曾被報(bào)道的馴化研究種類很難借助當(dāng)前的栽培模式進(jìn)行人工栽培，或者不具有商業(yè)栽培價(jià)值[9,20]。除此之外，紅褐羊肚菌(M.rufobrunnea)也容易馴化出菇，美國(guó)和以色列的栽培研究均采用該菌種進(jìn)行[21-23]。杜習(xí)慧[24]研究指出，除梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌以外,Mel-6至Mel-10支系中的其他幾個(gè)菌種也可以栽培出菇。綜上可以初步確定，以當(dāng)前栽培模式為基礎(chǔ)的可栽培羊肚菌有7種，分別為梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、頭絲羊肚菌(M.exuberans)、歐氏羊肚菌(M.owneri)、Mel-13和Mel-21，而生產(chǎn)中主要對(duì)前3種進(jìn)行大面積推廣應(yīng)用。由此可以斷定，以外源營(yíng)養(yǎng)袋為能量供給的羊肚菌大田栽培模式只適合于部分羊肚菌種類。因此，不要盲目將野生羊肚菌分離菌株和其他來(lái)源不明的菌株應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)。在大生產(chǎn)應(yīng)用之前，務(wù)必先確定推廣菌株的分類地位，明確其是否屬于目前適宜栽培的種類。

1.2 羊肚菌菌株身份識(shí)別方法

雖然構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹是羊肚菌物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)[15-19]，但采用單一的核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)序列分析即可準(zhǔn)確鑒定大多數(shù)羊肚菌種類，滿足栽培菌株身份識(shí)別的需要。但在羊肚菌分類鑒定的科研工作中，新種的鑒定必須整合形態(tài)特征、生理生化特征、多個(gè)保守基因序列分析等性狀進(jìn)行。目前，ITS序列擴(kuò)增和測(cè)序分析技術(shù)均已較成熟，本文將結(jié)合羊肚菌的特點(diǎn)闡述菌株身份識(shí)別方法：

1)菌絲體純培養(yǎng)。將活化培養(yǎng)的菌株菌絲塊接種于CYM(葡萄糖 20 g，酵母膏 2 g，蛋白胨 2 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.46 g，蒸餾水1000 mL，pH自然)或PD(土豆200 g煮汁，葡萄糖20 g，自來(lái)水1000 mL，pH自然)液體培養(yǎng)基中，于20～23 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，撈取菌絲體，用無(wú)菌水清洗2～3次，再用潔凈吸水紙吸干水分，-80 ℃保存?zhèn)溆没蛑苯邮褂谩?/p>

2)基因組DNA提取。加入液氮后，將菌絲體研磨成粉末；取約50～100 μL粉末，加入700 μL裂解液(CTAB 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，PVP 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，Tris-HCl 100 mmol/L，EDTA 20 mmol/L，NaCl 1.4 mol/L)，于60～65 ℃條件下裂解20 min后，于12 000 r/min條件下離心10 min；上清液加入等體積的PCA(V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1)，顛倒混勻后于12 000 r/min條件下離心10 min；上清液加入等體積CA(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，顛倒混勻后于12 000 r/min條件下離心10 min；上清液加入1/10體積的乙酸鈉溶液(3 mol/L)，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇，置于-20 ℃、30 min條件下沉淀基因組DNA；于12 000 r/min條件下離心5 min獲得基因組DNA，用1 mL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液清洗鹽離子后，再用含1%(體積分?jǐn)?shù))RNase A的TE緩沖液(Tris-HCl 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L)溶解基因組DNA，于37 ℃條件下水浴1 h以消解RNA，最終獲得高質(zhì)量基因組DNA母液。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定該母液質(zhì)量濃度，再稀釋為DNA質(zhì)量濃度為50 ng/μL的工作液，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

3)PCR擴(kuò)增。選擇ITS通用引物ITS1/ITS4(5′→3′，下同)：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應(yīng)體系為：PCR Buffer 1×，MgCl21.50 mmol/L，dNTPs Mix 0.25 mmol/L，引物各0.25 μmol/L，rTaqDNA聚合酶 1.5 U，模板DNA 50 ng；或 PCR MIX 1×(包含dNTP、Mg2+、核酸染料)，引物各0.25 μmol/L，模板DNA 50 ng。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

4)測(cè)序分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后(黑色羊肚菌類群菌株條帶約800 bp，黃色羊肚菌類群菌株條帶約1200 bp)，直接送至測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

5)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。獲得測(cè)序結(jié)果后，檢測(cè)測(cè)序質(zhì)量，剔除兩端的低質(zhì)量堿基，拼接獲得完整的ITS序列；提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行blastn比對(duì)，初步確定樣品的分類地位。

(6)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。下載公開發(fā)表的參考ITS序列，使用MEGA、PAUP、MrBayes等軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，初步確定目標(biāo)菌株的分類地位。

2 羊肚菌菌株交配型基因測(cè)定

2.1 羊肚菌潛在栽培菌株交配型基因測(cè)定的必要性

同宗結(jié)合或異宗結(jié)合是羊肚菌的關(guān)鍵生活史類型[25]。交配型基因控制著真菌的性發(fā)育。子囊菌通常含有2種交配型位點(diǎn)(Mat1-1和Mat1-2)，根據(jù)這2種位點(diǎn)是否位于同一個(gè)細(xì)胞核，可以判定該物種的生活史類型;另外，在異宗結(jié)合真菌中,這2種位點(diǎn)也被用于代表不同的核相[26]。基礎(chǔ)研究[26-32]表明，梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌等可栽培羊肚菌種類均屬于異宗結(jié)合生活史類型。異宗結(jié)合真菌在其生活史中需要不同交配型的初級(jí)菌絲融合形成具有2種交配型位點(diǎn)的次級(jí)菌絲方可出菇。雖然早期研究[3]及近年栽培實(shí)踐[26]均有羊肚菌單孢菌株出菇的案例，但檢測(cè)單孢菌株栽培出菇獲得的子囊果的交配型基因發(fā)現(xiàn)，單孢出菇實(shí)為“假性出菇”，其實(shí)質(zhì)是在種植過(guò)程中引入了互補(bǔ)交配型的核相[26]。劉萍等[33]研究指出，在一些梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌的子囊果標(biāo)本中可檢測(cè)到較小比例的異核體單孢子，同時(shí)含有2種交配型基因，即存在假同宗結(jié)合現(xiàn)象，可直接栽培出菇。然而，異核體單孢子群體所占比例較低，羊肚菌子囊果的單孢分離菌株群體大多仍只含1種交配型位點(diǎn)，即Mat1-1或Mat1-2[30]。

筆者檢測(cè)了來(lái)源于不同地區(qū)的3個(gè)梯棱羊肚菌、5個(gè)七妹羊肚菌和11個(gè)六妹羊肚菌菌株栽培出菇的子囊果和3個(gè)野生高羊肚菌的子囊果(共計(jì)22份樣品、24批次組織分離的348份分離物)的交配型基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其中151份分離物只檢測(cè)到1種交配型基因，整體交配型基因的缺失率為43.4%[11]。蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)交配型基因缺失會(huì)導(dǎo)致菌株生產(chǎn)性狀退化，造成不出菇[34]。當(dāng)前尚無(wú)有關(guān)羊肚菌菌株產(chǎn)量高低與交配型基因關(guān)系的研究報(bào)道。然而可以確定，將只含1種交配型的羊肚菌菌株直接用于生產(chǎn)存在風(fēng)險(xiǎn)。多孢分離是食用菌育種常用的技術(shù)手段。多孢分離物雖然能保證交配型基因的完整性，但發(fā)生減數(shù)分裂形成子囊孢子的萌發(fā)菌株的性狀分離明顯，將其作為育種材料是可行的，若直接用于生產(chǎn)則面臨性狀不一致的局面，不利于栽培的穩(wěn)定性[1]，因而建議仍采取組織分離技術(shù)獲得生產(chǎn)菌株。由于組織分離物存在較普遍的交配型缺失現(xiàn)象，因此必須對(duì)組織分離獲得的菌株(潛在生產(chǎn)菌株)進(jìn)行交配型基因測(cè)定，以確?；蛐偷耐暾浴?/p>

2.2 羊肚菌交配型基因測(cè)定方法

羊肚菌交配型基因的測(cè)定方法已有不少研究[26-29]，筆者主要闡述更適用于生產(chǎn)實(shí)踐的測(cè)定方法，即完成菌絲體培養(yǎng)和基因組DNA提取(見1.2)后，采用特異性引物擴(kuò)增交配型基因片段，從而確定菌株的交配型。

1)特異性引物。Mat1-1-1TF/R：AAAACGCTCTATCGCCACCA/TGCGAAGTTGCGTTTTCAGG；Mat1-2-1TF/R：ATGAAGGCTGTTCGCCAGAA/TGGTGCTCTCGTGCAGATTT。分別擴(kuò)增Mat1-1和Mat1-2基因，目的片段大小分別為412 bp和291 bp，可用于梯棱羊肚菌、七妹羊肚菌、六妹羊肚菌和Mel-21交配型基因的檢測(cè)。

2)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同前文菌株身份識(shí)別方法中的PCR體系，或采用如下體系：PCR MIX 1×(包含dNTPs、Mg2+)，引物各0.25 μmol/L，模板DNA50 ng。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

3)電泳檢測(cè)和結(jié)果判斷。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，記錄擴(kuò)增條帶的有無(wú)和大小，若Mat1-1-1和Mat1-2-1片段大小正確且同時(shí)存在，則視為該菌株具有完整的基因型，否則視為某一種交配型缺失的菌株。

3 羊肚菌菌株老化和活力測(cè)定

3.1 羊肚菌菌株老化表現(xiàn)及菌株活力測(cè)定的必要性

相對(duì)于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和絲狀子囊菌鵝糞柄孢殼菌(Podosporaanserina)[35-37]，羊肚菌老化的相關(guān)研究較落后。筆者對(duì)高羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的老化進(jìn)行研究[12-13,38]發(fā)現(xiàn)，菌株老化是羊肚菌的普遍現(xiàn)象，但存在菌株特異性，多數(shù)菌株連續(xù)繼代培養(yǎng)20～30次(120 d以上)后，會(huì)表現(xiàn)出不可逆的老化死亡；但也存在極端情況，少數(shù)菌株連續(xù)繼代培養(yǎng)超過(guò)50次仍不死亡，也有少數(shù)菌株繼代培養(yǎng)5次以內(nèi)即發(fā)生老化死亡[38]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，隨著老化程度的加劇，菌株的脂質(zhì)過(guò)氧化程度增強(qiáng)，菌核產(chǎn)生能力下降，色素形成嚴(yán)重，栽培產(chǎn)量持續(xù)下降，即老化菌株不可用于實(shí)際生產(chǎn)。羊肚菌老化菌株的整體表現(xiàn)一致：菌絲細(xì)弱，色素增強(qiáng)，線性生長(zhǎng)速度下降，菌落邊緣不整齊；二級(jí)菌絲和主菌絲之間的夾角增大，菌核產(chǎn)生能力喪失，最終徹底死亡。羊肚菌菌株老化在麥粒-木屑-土壤栽培種培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)也會(huì)發(fā)生，在營(yíng)養(yǎng)豐富的純麥粒培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)更為突出[12,38-40]。老化程度與菌絲多次傳代培養(yǎng)、不當(dāng)?shù)木昱囵B(yǎng)和保存條件、營(yíng)養(yǎng)環(huán)境不匹配等有關(guān)[37]。雖然缺乏深入和系統(tǒng)研究，但目前的研究[38-40]表明羊肚菌菌株的老化機(jī)制與線粒體的活性密切相關(guān)。由于羊肚菌老化具有菌株依賴性，存在繼代培養(yǎng)數(shù)次即發(fā)生老化死亡的極端組織分離物，因此為避免易老化菌株用于生產(chǎn)帶來(lái)的嚴(yán)重產(chǎn)量損失，有必要對(duì)潛在生產(chǎn)菌株進(jìn)行活力測(cè)定。

3.2 羊肚菌菌株活力測(cè)定方法

目前，羊肚菌菌株活力評(píng)價(jià)的主要依據(jù)是培養(yǎng)特征。繼代培養(yǎng)是綜合評(píng)價(jià)羊肚菌菌株老化簡(jiǎn)便、可靠的方法，能直觀反映初始菌株的壽命(總繼代培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)和總生長(zhǎng)距離)和活性狀態(tài)(菌絲長(zhǎng)速、菌核、色素產(chǎn)生等)。

3.2.1 菌株繼代培養(yǎng)和培養(yǎng)特征觀察主要有如下幾方面。

1)培養(yǎng)基。CYM固體培養(yǎng)基。

2)大培養(yǎng)皿制作。將直徑為15 cm的大培養(yǎng)皿滅菌后，傾注40 mL CYM固體培養(yǎng)基，凝固備用。

3)接種與培養(yǎng)。在培養(yǎng)皿一側(cè)距邊緣1.5 cm處接種初始菌株菌絲塊，于23 ℃避光培養(yǎng)，每2 d在菌落前端劃線，記錄生長(zhǎng)距離；當(dāng)菌落生長(zhǎng)至距培養(yǎng)皿另一側(cè)約1 cm處時(shí)，用接種鉤或解剖刀取菌絲前端0.3 cm × 0.5 cm菌絲塊，按照菌絲生長(zhǎng)方向置于新培養(yǎng)皿一側(cè)繼續(xù)第二輪培養(yǎng)，如此循環(huán)往復(fù)，直至菌絲生長(zhǎng)速度明顯下降或停止生長(zhǎng)。每次轉(zhuǎn)接時(shí)保存一份斜面培養(yǎng)物用于后期形態(tài)觀察。以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，菌絲線性生長(zhǎng)速度(mm/h)為縱坐標(biāo)，繪制菌株的菌絲生長(zhǎng)曲線，計(jì)算菌株的總生長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)和總生長(zhǎng)距離。

4)菌落形態(tài)和菌絲微觀特征觀察。將保存的不同世代菌株活化培養(yǎng)后接種于直徑9 cm、鋪有無(wú)菌玻璃紙的CYM培養(yǎng)皿中央，于23 ℃避光培養(yǎng)，記錄菌絲塊萌發(fā)時(shí)間，采用十字劃線法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度；培養(yǎng)3 d、7 d和14 d后分別記錄菌落形態(tài)、菌落邊緣整齊度、菌核數(shù)量、菌核形態(tài)、菌落顏色等培養(yǎng)特征；在培養(yǎng)3 d時(shí)使用體視顯微鏡直接觀察菌落前端菌絲的整齊程度，測(cè)量主菌絲與次菌絲分枝間的夾角。

3.2.2 菌株試驗(yàn)性栽培與常規(guī)食用菌不同，羊肚菌具有快速變異和老化的特性。在羊肚菌育種和菌株保藏技術(shù)完善前，對(duì)潛在生產(chǎn)菌株進(jìn)行小規(guī)模試驗(yàn)性栽培是菌株活力評(píng)判的有效手段。試驗(yàn)性栽培多在規(guī)模化生產(chǎn)前進(jìn)行，一般在溫控房、現(xiàn)代化菇房或高海拔低溫地區(qū)采用常規(guī)大田栽培、塑料盤或床架栽培方式進(jìn)行，每個(gè)菌株栽培面積不小于3 m2，且至少進(jìn)行3次隨機(jī)小區(qū)重復(fù)。試驗(yàn)性栽培技術(shù)和管理要求同規(guī)模化栽培，即環(huán)境最高溫度低于20 ℃，光線可控，水分管理措施到位。觀察和記錄不同試驗(yàn)菌株的菌種萌發(fā)時(shí)間、菌絲蔓延情況、菌霜產(chǎn)生量、外源營(yíng)養(yǎng)袋分解利用情況、抗雜能力、產(chǎn)生原基情況、原基分化程度、病蟲害發(fā)生情況等，比較各栽培菌株的綜合表現(xiàn)，挑選綜合表現(xiàn)理想的菌株用于規(guī)?；a(chǎn)。

3.2.3 健壯菌株的判別根據(jù)繼代培養(yǎng)和不同世代菌株的人工培養(yǎng)特征，健壯菌株的判別標(biāo)準(zhǔn)如下。

1)菌絲塊萌發(fā)早、菌絲生長(zhǎng)速度快。菌絲塊一般在接種后6 h左右萌發(fā)；不同菌株的生長(zhǎng)速度略有差異，23 ℃恒溫培養(yǎng)的菌株平均線性生長(zhǎng)速度為0.5～0.7 mm/h。

2)菌絲長(zhǎng)勢(shì)。菌落邊緣整齊，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)勁，有齊頭并進(jìn)之勢(shì)。

3)菌核產(chǎn)生。菌核產(chǎn)生均勻，初期為白色，培養(yǎng)14 d為輕微黃棕色；不產(chǎn)生菌核的菌株不宜用于規(guī)?；a(chǎn)[41]。

4)色素產(chǎn)生。菌落色素較輕或無(wú)色素；色素產(chǎn)生時(shí)間早且量大的菌株，老化程度較高，不宜用于生產(chǎn)。

5)菌絲微觀形態(tài)。主菌絲和二級(jí)菌絲分枝間的夾角小于30°。

6)總繼代培養(yǎng)時(shí)間?？偫^代培養(yǎng)時(shí)間大于100 d。

7)試驗(yàn)性栽培。菌種萌發(fā)快，在土壤中蔓延快，適度產(chǎn)生菌霜，外源營(yíng)養(yǎng)袋分解利用徹底，抗雜能力強(qiáng)，能形成大量羊肚菌原基，部分原基有分化為幼菇的趨勢(shì)，對(duì)病蟲害抗性強(qiáng)。

4 實(shí)際應(yīng)用效果分析

應(yīng)用該評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)2019—2020產(chǎn)季6000余畝羊肚菌栽培菌株進(jìn)行了篩選和評(píng)估，結(jié)果顯示評(píng)估合格的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的原種和栽培種的質(zhì)量明顯提升，大田栽培67.6%的面積畝產(chǎn)超過(guò)150 kg(鮮菇，下同)，92%的面積畝產(chǎn)超過(guò)100 kg，只有小于2%的面積被判定為因菌種原因?qū)е庐€產(chǎn)不足50 kg。該評(píng)價(jià)體系在2020—2021產(chǎn)季應(yīng)用表現(xiàn)更加突出，大面積(約60%)畝產(chǎn)大于200 kg。與行業(yè)70%虧損的現(xiàn)狀相比，羊肚菌生產(chǎn)菌株栽培適宜性IMV評(píng)價(jià)系統(tǒng)的應(yīng)用效果明顯，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

5 結(jié)論與展望

使用優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)菌株是羊肚菌栽培成功的關(guān)鍵。由于不同品種羊肚菌的生態(tài)習(xí)性不同，目前只有少數(shù)羊肚菌被成功馴化栽培。因此，在規(guī)?；a(chǎn)推廣應(yīng)用前，應(yīng)采用ITS序列分析技術(shù)確定栽培菌株的分類地位，以確定是否屬于目前大規(guī)模推廣應(yīng)用的種類(如梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌)，不要盲目推廣應(yīng)用分類地位不明確的羊肚菌菌株。目前人工栽培的多數(shù)羊肚菌屬于異宗結(jié)合生活史類型，需要兩種不同交配型基因的細(xì)胞核共存才能完成完整的生活史。單孢分離物只包含1種交配型，且和多孢分離物一樣都存在性狀分離現(xiàn)象，可作為育種材料但不宜直接用于生產(chǎn)。獲得羊肚菌生產(chǎn)菌株還要以組織分離法為主。由于羊肚菌組織分離物存在一定比例的交配型丟失，因此要測(cè)定生產(chǎn)菌株的交配型，確保兩種交配型共存的菌株用于規(guī)?；a(chǎn)。羊肚菌菌株老化現(xiàn)象較突出，多數(shù)菌株在較短時(shí)間連續(xù)繼代培養(yǎng)即可發(fā)生不可逆的老化死亡，甚至存在繼代培養(yǎng)數(shù)代即老化死亡的極端組織分離物，因此有必要對(duì)擬推廣應(yīng)用的羊肚菌菌株進(jìn)行繼代培養(yǎng)試驗(yàn)，選擇不易老化和老化程度較弱的高活力菌株用于生產(chǎn)。本文基于多年的羊肚菌生物學(xué)研究和實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，提出了羊肚菌生產(chǎn)菌株栽培適宜性IMV評(píng)價(jià)系統(tǒng)，涉及菌株身份識(shí)別、交配型基因檢測(cè)、菌株活力測(cè)定等多項(xiàng)評(píng)價(jià)內(nèi)容，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用表現(xiàn)理想，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。今后應(yīng)強(qiáng)化羊肚菌老化檢測(cè)技術(shù)及老化分子機(jī)制研究，加強(qiáng)羊肚菌優(yōu)質(zhì)品種選育，規(guī)范和推廣菌株栽培適應(yīng)性評(píng)價(jià)技術(shù)應(yīng)用，以顯著提升羊肚菌人工栽培的穩(wěn)定性，促進(jìn)我國(guó)羊肚菌產(chǎn)業(yè)更好發(fā)展。