卵巢運(yùn)輸及保存的重要影響因素

蘭可心 ，張學(xué)煒 ，鄭璐璐 ，王 敏 ，崔茂盛

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300380；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

哺乳動(dòng)物卵巢內(nèi)含有大量的原始卵泡，是當(dāng)前科研上獲取卵母細(xì)胞的重要原材料。隨著轉(zhuǎn)基因、克隆等胚胎工程技術(shù)日漸成熟，對(duì)卵母細(xì)胞的需求也在不斷增加。體內(nèi)成熟技術(shù)（in vitro maturation，IVM）和超數(shù)排卵技術(shù)所獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量有限，實(shí)際操作復(fù)雜且成本高。而屠宰場(chǎng)所提供的卵巢數(shù)量大、所獲得卵母細(xì)胞充足且成本低廉。各研究所現(xiàn)在更趨向于選擇屠宰場(chǎng)的廢棄卵巢用來作為體外成熟卵母細(xì)胞的原材料。但因屠宰場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)室之間距離以及工作時(shí)間因素的影響，卵巢從離體到實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行處理使用的時(shí)間是不定的。導(dǎo)致采集卵母細(xì)胞的時(shí)間不可控，有時(shí)需要較長(zhǎng)的時(shí)間。因此，為了合理安排實(shí)驗(yàn)的同時(shí)節(jié)省運(yùn)輸費(fèi)用，需要對(duì)離體卵巢進(jìn)行一定時(shí)間的保存。目前已有對(duì)常見家畜（豬、牛、綿羊、山羊等）以及一些特種動(dòng)物（家貓、犬、野生梅花鹿、伊比利亞紅鹿、羊駝、兔、鼠、牦牛、驢等）的相關(guān)報(bào)道。將卵巢從動(dòng)物死亡那一刻起直至到實(shí)驗(yàn)人員取卵母細(xì)胞為止的保存條件是維持卵母細(xì)胞活力的重要因素，不適當(dāng)?shù)谋４鏃l件會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成不利影響，可見如何在卵巢保存的過程中維持組織內(nèi)卵泡的活力對(duì)于后續(xù)的研究工作是十分重要的。

1 卵巢運(yùn)輸及保存溫度

當(dāng)離體卵巢所處的環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，會(huì)對(duì)卵泡及卵母細(xì)胞造成負(fù)面影響。溫血?jiǎng)游矬w內(nèi)存在的酶在正常體溫的溫度時(shí)活性最強(qiáng)，細(xì)胞的新陳代謝與酶的活性有關(guān)，而酶的活性與溫度呈現(xiàn)依賴性。細(xì)胞代謝會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)能量，緊接著消耗保存介質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。所以，即使在很短的保存時(shí)間（例如2 h或4 h）內(nèi)，也可能會(huì)啟動(dòng)顆粒細(xì)胞以及卵母細(xì)胞凋亡導(dǎo)致較高的濾泡閉鎖率。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，在卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞因?yàn)槭艿搅寺雅輧?nèi)環(huán)境的保護(hù)避免了溫度變化對(duì)其的損傷，相較于生發(fā)泡階段分離的卵母細(xì)胞對(duì)于冷刺激的表現(xiàn)較弱。對(duì)于短時(shí)間內(nèi)（3～4 h）保存山羊、蒙古牛、綿羊、牦牛、奶牛卵巢的研究結(jié)果顯示，在接近于室溫時(shí)（20～25℃），更有利于保持卵巢細(xì)胞的活性。王鋒等研究發(fā)現(xiàn)，牛卵巢保存在接近牛正常體溫的溶液內(nèi)2～4 h可以維持正常代謝，對(duì)卵巢保存更有利。造成結(jié)果存在差異性的原因可能與所取卵巢母牛的品種、年齡、飼養(yǎng)環(huán)境等有關(guān)。對(duì)于豬卵巢，豬卵母細(xì)胞對(duì)冷卻非常敏感，當(dāng)溫度冷卻到16℃以下時(shí)，會(huì)失去細(xì)胞膜的完整性。25～35℃是保持豬卵母細(xì)胞質(zhì)量、減數(shù)分裂能力和體外受精率的最佳溫度條件。石金月等報(bào)道，將兔卵巢保存在25-30℃ 0.9%NaCl（含雙抗）中，4 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，更有利于卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)。這可能與不同物種間卵巢對(duì)于溫度敏感度不同有關(guān)。在較低溫度下保存的卵巢的卵裂率和囊胚率明顯低于其他處理，可能是因?yàn)樵谑占涯讣?xì)胞前，長(zhǎng)期暴露在低溫下的卵巢對(duì)胚胎發(fā)育能力有負(fù)面影響。當(dāng)采用較高溫度保存時(shí)，卵母細(xì)胞會(huì)因受到熱應(yīng)激從而影響成熟質(zhì)量。會(huì)使卵母細(xì)胞成熟加快，使卵泡中產(chǎn)生的有害物質(zhì)不斷集聚，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)影響。將卵巢保存在較低的溫度下時(shí)，細(xì)胞代謝率隨之也降低，使其可以用最小限度的代謝來抵抗因?yàn)槿鄙贍I(yíng)養(yǎng)和氧氣所導(dǎo)致的能量減少。在低溫環(huán)境下保存卵巢，對(duì)酸中毒以及細(xì)胞凋亡過程會(huì)有所緩解。

2 卵巢運(yùn)輸及保存時(shí)間

據(jù)相關(guān)研究表明，從屠宰場(chǎng)收集的卵巢到采集卵母細(xì)胞的時(shí)間與卵母細(xì)胞的質(zhì)量呈正比。但實(shí)際上會(huì)受到各種因素影響。1）運(yùn)輸時(shí)間。根據(jù)當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)法規(guī)要求，屠宰場(chǎng)大多位于遠(yuǎn)離城市的郊區(qū)，導(dǎo)致屠宰場(chǎng)與實(shí)驗(yàn)室有一定的距離的情況存在。在一些國(guó)家因?yàn)檠芯课锓N的特殊性，也會(huì)跨地區(qū)運(yùn)輸。2）工作時(shí)間。屠宰場(chǎng)的工作時(shí)間會(huì)根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)規(guī)定而不同，有些地區(qū)屠宰工作需要在下午或者晚間進(jìn)行。當(dāng)卵巢運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室時(shí)，有時(shí)會(huì)與實(shí)驗(yàn)室工作人員的工作時(shí)間發(fā)生沖突。3）卵巢數(shù)量。因研究物種不同，對(duì)于一些特種動(dòng)物的研究，當(dāng)需要獲得足夠的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)需要在多個(gè)不同的屠宰點(diǎn)進(jìn)行采集。受以上因素影響，需要對(duì)卵巢進(jìn)行一定時(shí)間的保存。Anna Rita Piras等報(bào)道，家貓卵巢保存在4℃時(shí)，當(dāng)儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)24 h時(shí)，只會(huì)引起少量的腔前卵泡和卵母細(xì)胞的改變。但當(dāng)貯存時(shí)間超過24 h，隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致卵泡結(jié)構(gòu)逐漸受損，影響體外成熟卵母細(xì)胞的氧化狀態(tài)和體外受精后的發(fā)育能力。庫(kù)爾班·吐拉克對(duì)野生梅花鹿保存卵巢實(shí)驗(yàn)報(bào)道，細(xì)胞成熟率以及卵子變形率會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加。Pimprapar、Matías Nicolás Tellado等報(bào)道，將豬卵巢保存在35℃，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，卵泡液的pH、葡萄糖濃度、生發(fā)泡期未成熟卵母細(xì)胞的存活率、氧化活性和成熟率均呈下降趨勢(shì)，細(xì)胞核DNA片段化的卵母細(xì)胞比例增加。Alicia Martín-Maestro等報(bào)道，綿羊卵巢保存時(shí)間為5 h時(shí)是對(duì)維持綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育能力的最適宜。顆粒細(xì)胞在貯存時(shí)大于7 h會(huì)活力降低導(dǎo)致氧化還原狀態(tài)和線粒體活性受損，失去對(duì)卵母細(xì)胞的支撐和保護(hù)作用。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，由于離體卵巢缺乏氧氣以及營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)導(dǎo)致毒素累積，在不同物種中對(duì)卵巢中卵母細(xì)胞的質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期暴露在低溫下將不可避免地導(dǎo)致離子濃度失衡、代謝停滯和溫度依賴性膜功能失衡。

3 卵巢運(yùn)輸及保存介質(zhì)

保存溶液的組成成分是影響卵巢保存效果的重要因素之一。而找到對(duì)卵巢毒性及損傷最小的保存溶液的最佳成分至關(guān)重要。但確定保存溶液中缺少的有效成分是很難的。同時(shí)，對(duì)于保存溶液的選擇不僅要兼顧成本和可用性，也要考慮卵巢到達(dá)實(shí)驗(yàn)室所需要的時(shí)間。對(duì)于這種情況，許多研究評(píng)估了不同溶液對(duì)卵巢運(yùn)輸過程中保存效果及卵泡健康狀態(tài)的影響。生理鹽水和磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline,PBS）價(jià)格低廉且使用率較高。0.9%生理鹽水具有成本低且已有商品化產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)，使用便捷。雖然僅由水和氯化鈉組成，已經(jīng)是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室低溫（4℃）運(yùn)輸卵巢的主要選擇。

研究人員嘗試使用不同溶液對(duì)保存效果進(jìn)行改善。發(fā)現(xiàn)使用Braun-Collins溶液、椰子水、最低基本培養(yǎng)基（Minimum Essential Medium，MEM）和組織培養(yǎng)基199（Medium199，M199）等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更豐富的保存溶液來保存卵巢能更好地保證卵母細(xì)胞的活性。Braun-Collins溶液是高滲溶液，當(dāng)其用于卵巢組織運(yùn)輸時(shí)，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞脫水，同時(shí)可以避免細(xì)胞腫脹。而椰子水富含豐富的氨基酸、能量、維生素以及礦物質(zhì)等。在反芻動(dòng)物牛和山羊的卵巢組織保存運(yùn)輸后，可以有效地保持卵泡的良好形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。椰子水中的生長(zhǎng)素3-吲哚乙酸（IAA）添加到M199中時(shí)，有益于山羊腔前卵泡的保存?？赡苁且?yàn)镮AA與卵巢組織中的生長(zhǎng)因子相加作用，同時(shí)加強(qiáng)了生長(zhǎng)因子在卵母細(xì)胞中的作用，維持細(xì)胞通透性及呼吸模式。

為了防止卵母細(xì)胞受到氧化應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷，也可以添加其他促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或抗氧化類添加劑，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒、谷氨酰胺、次黃嘌呤和牛血清白蛋白等。商業(yè)培養(yǎng)基成本高昂，現(xiàn)階段已有研究人員推薦是用價(jià)格更合理的藥用植物提取物作為保存介質(zhì)。龍涎草和桑樹乙醇提取物對(duì)于保存山羊和綿羊卵巢組織已有相關(guān)研究，研究表明，將羊卵巢于4℃保存6 h，與對(duì)照組的正常腔前卵泡的百分比和凋亡率相比其正常腔前卵泡的百分比和凋亡率無顯著差異。天然植物提取物中含有天然抗氧化劑，可減少不同細(xì)胞類型中的氧化應(yīng)激和DNA損傷。

4 其他因素

有研究表明，將卵巢組織切割為3 mm×3 mm×1 mm的組織塊，更有利于培養(yǎng)基滲透進(jìn)組織。相較來說，運(yùn)輸整個(gè)卵巢或較大塊的卵巢組織，因?yàn)椴僮骱?jiǎn)便所需時(shí)間更少，其可行性更高。而且，在收集過程中操作越繁瑣越容易導(dǎo)致組織污染。同時(shí)，隨著組織塊的大小變化，會(huì)對(duì)剩余組織內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分以及氧氣消耗相對(duì)加快，進(jìn)而影響體外保存卵巢皮質(zhì)的卵泡代謝速率。在評(píng)估整個(gè)卵巢、一半卵巢或較小器官碎片對(duì)卵泡存活效果的研究中，結(jié)果也不盡相同，而導(dǎo)致結(jié)果差異的原因可能與研究物種或保存溶液成分相關(guān)。卵巢保存受到多因素影響。包括器官或組織碎片大小、溫度和可用性大小。也有研究提供了將溫度保存在接近生理體溫的保存方式，如水浴、便攜式培養(yǎng)箱或卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)箱。不同物種的卵巢所處的生殖周期階段以及生殖道部分是否存在等因素也會(huì)影響卵巢運(yùn)輸質(zhì)量以及進(jìn)一步的卵母細(xì)胞質(zhì)量。在犬類中，保存在4℃的卵巢中獲得的卵母細(xì)胞的成熟率最高，最低的試驗(yàn)組是37℃。此外，不同運(yùn)輸溫度對(duì)從黃體或卵泡期卵巢收集的卵母細(xì)胞的成熟率沒有顯著影響。重要的是，仍需要進(jìn)一步研究以評(píng)估不同因素（發(fā)情周期階段、身體狀況、年齡等）對(duì)卵巢組織運(yùn)輸?shù)挠绊?。通過簡(jiǎn)單有效的保存程序，已經(jīng)做出了許多努力來優(yōu)化運(yùn)輸條件。

5 總結(jié)

卵巢離體后環(huán)境改變?nèi)狈ρ鯕庖约盃I(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)，導(dǎo)致毒素累積，對(duì)卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞造成了負(fù)面影響。卵巢的保存條件會(huì)引起卵泡的代謝變化從而改變卵泡液的PH，卵泡液PH隨著溫度的提高不斷下降。葡萄糖是卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞成熟過程中關(guān)鍵的能量來源，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，卵泡液內(nèi)的葡萄糖不斷被消耗，含量減少。缺氧也會(huì)引起代謝途徑的改變，由有氧代謝轉(zhuǎn)變到無氧糖酵解，其產(chǎn)物主要是乳酸。以上因素使乳酸在細(xì)胞內(nèi)濃度不斷升高，卵泡液逐漸偏向酸性環(huán)境造成酸中毒，從而影響卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育潛能。卵母細(xì)胞會(huì)隨著生存環(huán)境不同而選擇不同的死亡途徑。缺血條件下的酸中毒、復(fù)氧和再灌注的作用強(qiáng)烈刺激細(xì)胞進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡。缺氧導(dǎo)致ROS生成，引起氧化應(yīng)激，使卵巢內(nèi)卵泡發(fā)生自噬、凋亡、壞死等多種細(xì)胞死亡途徑以及退行性變化。當(dāng)保存時(shí)間超過24 h時(shí)，氧化應(yīng)激（OS）是阻礙卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）的因素之一。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，卵母細(xì)胞周圍顆粒細(xì)胞的死亡導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的中斷，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^卵母細(xì)胞活性氧水平、相關(guān)凋亡指標(biāo)和基因表達(dá)來評(píng)估卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

6 結(jié)論

考慮到卵母細(xì)胞的質(zhì)量決定了受精后胚胎的發(fā)育潛力，從動(dòng)物死亡的那一刻起直到卵巢被加工完成，卵母細(xì)胞的完整性是至關(guān)重要的。當(dāng)保存時(shí)間小于6 h時(shí)，保存溫度接近于室溫（20～25℃）是比較好的選擇。當(dāng)保存時(shí)間大于12 h，低溫保存更有利于卵巢保存。有研究表明，在體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下，采用酶和非酶氧化劑，可以降低ROS水平，抑制caspase活性，可通過內(nèi)源性凋亡途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡程度，改善卵巢活性以及卵母細(xì)胞質(zhì)量。當(dāng)卵巢經(jīng)過保存后在體外培養(yǎng)液內(nèi)添加能量物質(zhì)（葡萄糖）、抗氧化劑（白藜蘆醇）等可以對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能形成正面影響。需要強(qiáng)調(diào)的是，物種和卵泡種類（腔前或腔內(nèi)）對(duì)貯藏溫度的反應(yīng)是不同的。腔前卵泡因環(huán)境變化，發(fā)生氧化應(yīng)激、代謝途徑變化、毒素積累等都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。針對(duì)目前各實(shí)驗(yàn)室研究物種、時(shí)間間隔、溫度變化不同，以及體外培養(yǎng)條件差異等因素影響，導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果并不統(tǒng)一。加強(qiáng)對(duì)于長(zhǎng)距離運(yùn)輸卵巢的研究可以拓展遠(yuǎn)距離卵巢資源的應(yīng)用。目前大多數(shù)研究?jī)H對(duì)成熟率和極體率進(jìn)行了對(duì)比，缺少對(duì)卵母細(xì)胞分子水平的研究，所以有必要在細(xì)胞和分子水平闡明發(fā)生在卵母細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間，以便采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣頊p少這種損害，有助于人為調(diào)節(jié)或干預(yù)卵泡發(fā)育。