姜黃素納米晶的濕法制備以及不同粒徑儀下姜黃素納米晶的粒徑分析

鄧耀辰

(廣東醫(yī)科大學(xué) 廣東 東莞 523808)

引言

姜黃素是從姜科植物姜黃屬姜黃、莪術(shù)、郁金等根莖中提取到的一種天然的小分子植物酸性多酚，是中藥姜黃的主要活性成分[1]。姜黃素具有抗炎、抗氧化，保護神經(jīng)以及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑等藥理作用。姜黃素還可以增強神經(jīng)的可塑性，增強神經(jīng)再生。這些藥理作用使得姜黃素在神經(jīng)退行性疾病以及情緒障礙方面的疾病中起到了重要的作用。目前姜黃素可以制備脂質(zhì)體、納米粒、微球、膠束、微乳等劑型來進行不同方式的給藥，改善其親水性，提高生物利用度。[1]

粒度測試是通過特定的儀器和方法對粉體粒度特性進行表征的一項實驗工作。在日常生活以及工業(yè)生產(chǎn)中，粉體的應(yīng)用十分廣泛，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域。在粉體粒度測試中，粒度分布是很重要的一項指標[2]。在藥物制備領(lǐng)域，能夠客觀真實的反映出粉體粒度分布是十分重要的，因為其關(guān)系到藥物的特性能否準確的發(fā)揮出來。

本次采用的是姜黃素納米晶混懸液，通過分析不同粒徑儀測量同一批次產(chǎn)物的結(jié)果的差異，探究如何更好的發(fā)揮粒徑儀在醫(yī)藥制劑領(lǐng)域的作用。

第二章 實驗階段

1 姜黃素納米晶混懸液制備

1.1 原材料及設(shè)備 姜黃素原料藥；十二烷基硫酸鈉(SDS)；聚維酮K30(PVP K30)；蒸餾水；WAB ECM-AP05型濕法研磨機

1.2 制備

1.取姜黃素原料藥600g；SDS、PVP各30g溶于2340mL蒸餾水中，充分攪拌(必要時可上磁轉(zhuǎn)子攪拌機)，得到含有1%SDS+PVP的姜黃素原料藥混懸液。

2.使用WAB ECM-AP05型濕法研磨機將原料藥懸濁液進行充分的研磨，取不同時間點的樣品混懸液經(jīng)稀釋后進行粒徑測量，當結(jié)果的平均粒徑范圍在200nm左右時即可終止研磨，最終得到姜黃素納米晶混懸液。

2 粒徑分析

2.1 納米粒徑儀方法學(xué)驗證

2.1.1 試劑與試液

姜黃素納米晶混懸液、純水

2.1.2 儀器用具

馬爾文Nano ZS-90激光粒度儀

2.1.3 樣品制備

分散劑的選擇：馬爾文Nano ZS-90激光粒度儀對樣品的要求是：能夠較好的分散在液體媒介中，要求分散劑透明、和溶質(zhì)粒子有不同的折光指數(shù)、應(yīng)和溶質(zhì)粒子相匹配、掌握準確的折光指數(shù)和粘度。姜黃素納米晶混懸液的分散介質(zhì)為水，且水符合分散劑要求，于是選擇水為分散劑。

樣品制備：每種樣品都有理想的測試濃度范圍。根據(jù)馬爾文推薦的樣品濃度，配制姜黃素納晶含量為0.0025mg/ml，0.005mg/ml，0.01mg/ml，0.02mg/ml，0.04mg/ml，0.08mg/ml，0.16mg/ml，0.32mg/ml，1.6mg/ml，3.2mg/ml樣品。使用馬爾文Nano ZS-90激光粒度儀測定樣品平均粒徑。

2.1.4 驗證階段

首先探究的是樣品濃度對粒徑測量結(jié)果的影響，結(jié)果如表1所示：

表1 不同濃度樣品的粒徑測量結(jié)果

不同濃度樣品的粒徑測定結(jié)果如表1所示，姜黃素納米晶混懸液的濃度在0.16mg/ml-3.2mg/ml這一范圍內(nèi)，粒徑測定結(jié)果與理想結(jié)果存在較大出入；濃度為0.0025mg/ml時，RSD值較大。在濃度為0.005-0.08mg/mL之間時粒徑偏差小于10%，證明的在此濃度范圍內(nèi)測定結(jié)果不依賴于濃度；且在每個濃度下的RSD值均小于5%，精密度高，因此樣品濃度暫定在0.005-0.08mg/mL之間。不同濃度的PDI由該表也可以看出。樣品濃度在0.005-0.08mg/mL之間的各濃度下PDI值的范圍在0.24-0.33，當分散系數(shù)在0.08-0.7時為適中分散體系，也是運算法則的最佳適用范圍。所以，根據(jù)以上結(jié)果，姜黃素納米晶混懸液粒徑測定的濃度范圍可定為0.005-0.08mg/mL。

選取濃度為0.04mg/ml的姜黃素納米晶混懸液，平行配制6份樣品，進行粒度測定，考察測定方法的重復(fù)性。結(jié)果如表2所示：

表2 重復(fù)性驗證

由上述結(jié)果可見，RSD(%)值為1.52，小于2%，方法精密度高，重現(xiàn)性良好。繼續(xù)對其進行方法學(xué)驗證，以下是平衡時間對粒徑測定的影響，其結(jié)果如表3所示：

表3 平衡時間對粒徑測定的影響

由以上結(jié)果可見，將粒徑儀平衡時間分別設(shè)置為60s，90s和120s，所測粒徑RSD值為0.114%，PDI值小于0.3，表明平衡時間的變化對粒徑測定產(chǎn)生的影響不大。為了加快測量效率，后續(xù)的測量選用了60s。

2.2 微米粒徑儀方法學(xué)驗證

2.2.1 試劑與試液

姜黃素納米晶混懸液、純水

2.2.2 儀器與用具

馬爾文Mastersizer 2000 粒度分析儀，一次性滴管、EP管、燒杯

2.2.3 樣品制備

與納米粒徑儀測量前相同，將姜黃素納米晶混懸液用純水稀釋至合適濃度，平行制備幾個稀釋程度相當?shù)臉悠穫溆谩?/p>

2.2.4 驗證階段

首先探究的是儀器參數(shù)之一的遮光度對粒徑測量結(jié)果的影響。遮光度的正確選擇是激光粒度儀在粒度測試過程中的一個重要的環(huán)節(jié)，遮光度是否合適嚴重關(guān)系到粒度測量結(jié)果的準確性和代表性。在實際的粒度測試中，通過調(diào)整遮光度的數(shù)值來盡量保證顆粒之間不發(fā)生二次散射。遮光度不宜過大(超過50%)或者過小(低于5%)，遮光度過大時，顆粒的濃度過高，容易發(fā)生二次散射，測量結(jié)果誤差增大;遮光度過低，樣品中顆粒的濃度太低，顆粒數(shù)太少，測試結(jié)果的代表性很差，甚至導(dǎo)致測試結(jié)果是無效的。因此在測試過程中，要反復(fù)的測試、尋找合適的遮光度，從而得到正確的測量結(jié)果。由于本次測量的樣品粒徑為納米級，于是為了能夠最大限度的保證測量準確，該驗證選取從5%的遮光度開始，以每0.5%遮光度參數(shù)進行增長，依次進行了測量。測量結(jié)果如表4所示：

表4 遮光度對粒徑測定的影響

由以上結(jié)果可以看出，當儀器遮光度參數(shù)>6%時，儀器后續(xù)測量的結(jié)果開始趨于穩(wěn)定。但是由于樣品納晶的粒徑在200nm左右，該微米粒徑儀測出的結(jié)果與理論結(jié)果差距較大，無參考意義。于是選取12%的遮光度進行后續(xù)的方法學(xué)驗證。

下面對泵速對測量結(jié)果的影響進行探究。質(zhì)量標準中設(shè)定的泵速為1250rmp/min，樣品滴加至燒杯時被分散開的速度較快，將泵速分別設(shè)置1250rmp/min、1500rmp/min以及2000rmp/min，設(shè)定遮光度為12%，進行粒徑檢測。結(jié)果如表5所示：

表5 泵速對粒徑測定的影響

由以上結(jié)果可以看出，不同泵速下的測量結(jié)果差別不是特別大，但是在實際操作過程中，泵速為1500rmp/min和2000rmp/min這兩組數(shù)據(jù)結(jié)果中均出現(xiàn)了一個小峰，推斷可能是由于泵速過大產(chǎn)生了較多的氣泡所導(dǎo)致，于是將泵速設(shè)置為1250rmp/min。

下面對循環(huán)測試次數(shù)對粒徑測試結(jié)果的影響進行探究。泵速設(shè)置為1250rmp/min，遮光度為12%，其測量結(jié)果如表6所示：

表6 循環(huán)測定次數(shù)對粒徑測定的影響

由以上結(jié)果可以看出，循環(huán)測定次數(shù)對粒徑測定的結(jié)果影響較小，為得到更加準確的結(jié)果，采用普遍的3次循環(huán)測定取平均值。

以上是我對兩種粒度儀進行的方法學(xué)考察。分別對納米粒徑儀和微米粒徑儀進行方法學(xué)考察有利于在后續(xù)的正式測量過程中能夠更好地使用儀器，同時能夠找到適合被測樣品的各種參數(shù)設(shè)定，這對最終結(jié)果的精確度有著非常重要的影響。

2.3 粒徑測量結(jié)果

根據(jù)兩臺粒徑儀的方法學(xué)考察結(jié)果，對粒徑儀進行適合測量姜黃素納米晶的參數(shù)的設(shè)定。在上述方法學(xué)考察中已經(jīng)驗證過微米粒徑儀對該批次樣品無法提供具有參考意義的結(jié)果，于是針對納米粒徑儀進行粒度測試。測試條件為樣品濃度為0.04mg/ml，平衡時間選取60s，循環(huán)測定次數(shù)為3次取平均值。在該條件下重復(fù)測量了幾組，得到的粒徑大小均在200nm左右。將該批次姜黃素納米晶混懸液通過掃描電鏡進行觀測，姜黃素的實際尺寸與粒徑儀的測定結(jié)果基本相符，說明納米粒徑儀的測定結(jié)果可靠，同時說明了在規(guī)范操作下納米粒徑儀具有良好的精確度。也說明了不同粒徑范圍的樣品需要通過與之匹配的儀器進行測定，才能夠得到具有參考價值的結(jié)果。

3 討論

3.1 姜黃素納米晶混懸液濕法制備階段 查閱文獻資料，通過比較不同處方的納米晶混懸液放置穩(wěn)定性，最終確認SDS、PVP K30和吐溫80為良好的穩(wěn)定劑。為了更好地提高患者的依從性，我們將混懸液進行了固化。后續(xù)實驗中我們將固化后的姜黃素納米晶在固化保護劑加入的情況下成功地負載到了微晶纖維素丸心上，制成載藥微丸。但是經(jīng)過水溶實驗結(jié)果表明，含有吐溫 80 的納米晶載藥微丸在水中時，藥物從丸芯上呈片狀脫落，無法恢復(fù)為上藥之前的納米晶狀態(tài)。含有 PVP K30 與 SDS 的納米晶載藥微丸在水中再分散效果良好，能迅速分散得到 200 nm 左右的姜黃素納米晶，且長期保持穩(wěn)定，利于儲存，故最終確定以 PVP K30 為立體保護劑，SDS 為電荷保護劑[4]。所以本次濕法制備的姜黃素納米晶混懸液采用的穩(wěn)定劑組合為SDS+PVP K30。在研磨過程中，姜黃素原料藥混懸液一開始是橙紅色的，在研磨一段時間乃至研磨結(jié)束后變成了黃色。在收集樣品放置一段時間后，樣品又會變回橙紅色。這可能與姜黃素里的酚羥基結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3.2 粒度測試階段 在粒度測試這一環(huán)節(jié)中，需要注意的地方也是很多的。能否得到理想的測試結(jié)果，關(guān)鍵在于人為因素對其的影響。在樣品制備環(huán)節(jié)、樣品篩選環(huán)節(jié)、以及樣品測量環(huán)節(jié)中有種種人為因素會導(dǎo)致其最終的測量結(jié)果產(chǎn)生偏差。而對于整一套測試操作而言，機器(粒徑儀)本體對于結(jié)果的影響其實只占據(jù)非常小的一部分。于是在測量前我們要針對樣品找到合適的測量參數(shù)以及測量條件。

關(guān)于馬爾文粒徑測定，它的影響因素大致可總結(jié)為三點：1.取樣2.樣品的分散3.光學(xué)參數(shù)的影響。其中，前兩項受人為因素的影響是巨大的，于是粒徑測量結(jié)果的好壞，很大程度上取決于前兩項工作能否做好。取樣代表性，取樣前樣品應(yīng)充分的混合均勻，如果沒有代表性取樣設(shè)備，粉末樣品取樣前應(yīng)充分混合均勻，漿料則攪拌均勻。切記不要僅僅搖晃樣品(干的樣品)，這樣容易導(dǎo)致樣品的分層更加厲害，即小顆粒在最下層大顆粒在最上層。粒徑分布的越寬，其取樣代表性的難度也就越大；當粒徑>75μm時，取樣代表性會是很大的誤差來源。

樣品分散的理想狀態(tài)：1.所有顆粒單個狀態(tài)存在于分散介質(zhì)，沒有發(fā)生團聚。2.在測試過程中分散狀態(tài)沒有發(fā)生改變。那么我們應(yīng)當如何的去選擇分散方法？分散方法大致分為干法和濕法，分散方法的選取主要取決于我們要測量的樣品。選擇干法的理由：1.顆粒易分散，不容易被打碎2.團聚狀態(tài)下的觀測3.樣品可懸浮于空氣流中4.具有特殊性質(zhì)的樣品，如磁性材料。選擇濕法的理由：1.材料具有一定的危險性，如有毒材料、易爆材料2.樣品的顆粒很大，密度很大3.樣品的粘度很大4.樣品非常細(粒徑<1μm)樣品的顆粒越小，其團聚力也會越大5.樣品顆粒易碎。在正式的實驗操作中，選擇濕法的概率往往會更大，因為濕法可循環(huán)測樣，考察其重復(fù)性。本次對姜黃素納米晶混懸液進行粒徑的測量，選用的即為濕法測量。

影響濕法分散體系的因素：1.分散介質(zhì)2.添加劑3.分散作用力(超聲/攪拌)。分散介質(zhì)的注意點：若樣品為微溶，可考慮配制飽和溶液進行測量；樣品在分散介質(zhì)中是否浸潤？可加入表面活性劑降低其表面張力。還有特別要注意的一點，當拿到一份不熟悉的樣品時，應(yīng)先觀察，切勿直接測量。用超聲分散樣品時要注意控制，一方面超聲會增加樣品顆粒的碰撞幾率，導(dǎo)致團聚；一方面過渡的超聲會導(dǎo)致顆粒崩解影響最終的測量結(jié)果。樣品被分散的特征：1.顆粒的粒徑變小2.遮光度增加3.數(shù)據(jù)圖上的高位號碼檢測器的信號增強4.分布圖上的粗粒含量降低甚至消失；樣品被溶解的特征：1.遮光度下降2.小顆粒粒徑變得更小甚至消失3.整個樣品分布中粗粒粒徑變小，粗粒的含量增加(因為小顆粒溶解消失)。一次好的濕法分散結(jié)果應(yīng)：超聲前后的趨勢圖無明顯變化(測量結(jié)果前后一致)記錄圖中的遮光度不隨時間的變化增高或變小。

4 總結(jié)與建議

在納米晶混懸液制備階段，加入穩(wěn)定劑的樣品與不加入穩(wěn)定劑的樣品在不同時間進行取樣測定的結(jié)果相差較大(粒徑大小)，而不同的穩(wěn)定劑的組合以及使用劑量也會產(chǎn)生不同的差異。在穩(wěn)定劑的選擇方面，我認為不同的藥物應(yīng)當反復(fù)的進行實驗摸索，找到最適穩(wěn)定劑組合和劑量。

在粒徑測量階段，如果想得到一份好的測量結(jié)果，首先取樣應(yīng)有足夠的代表性；其次，根據(jù)樣品找到最佳的分散條件；最終選擇正確的光學(xué)參數(shù)。粒徑檢測雖然是整個制劑環(huán)節(jié)一個小的版塊，但是其重要性無需多言。規(guī)范的使用粒徑儀，是我們值得也是必須要去學(xué)習(xí)的。目前姜黃素可以作為阿爾茨海默病、抑郁癥、帕金森病、腦缺血再灌注損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的控制與治療的藥物；還具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，臨床也可用于治療及預(yù)防腦膠質(zhì)瘤[3]。姜黃素具有較高的有效性和安全性，毒副作用小。但姜黃素難溶于水，生物利用度低等問題限制了姜黃素在臨床用藥上的發(fā)展前景，通過改變姜黃素的劑型以及給藥方式可以彌補這種缺點。