即食重組纖維感魚糜制品的制備及特性表征

朱士臣，馮媛，劉書來，周緒霞，丁玉庭*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)2(浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州，310014)3(國家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州)，浙江 杭州，310014)4(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心(大連工業(yè)大學(xué))，遼寧 大連，116034)

魚肉重組技術(shù)，一般是利用單一或復(fù)合黏合劑將低值碎魚肉經(jīng)重組黏接等工序制備魚糜制品的一種方法，其本質(zhì)是肌原纖維蛋白高級結(jié)構(gòu)在熱誘導(dǎo)及黏合作用下展開與再組裝的一種過程。高溫處理是制備即食重組魚糜制品的關(guān)鍵工序之一，通過殺滅致病微生物從而延長產(chǎn)品保質(zhì)期[1]。但是在高溫滅菌過程中重組肌肉制品的肌球蛋白會(huì)發(fā)生重鏈降解，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，凝膠特性、質(zhì)構(gòu)特性以及營養(yǎng)品質(zhì)顯著降低。目前魚糜制品熱穩(wěn)定性的影響因素主要包括NaCl、水分含量以及黏合劑等。NEZ-FLORES等[2]研究發(fā)現(xiàn)，增大NaCl的添加濃度可使肌原纖維蛋白活性基團(tuán)進(jìn)一步暴露，增強(qiáng)蛋白質(zhì)體系的疏水相互作用和二硫鍵作用，形成均一穩(wěn)定的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)魚糜凝膠熱穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)分子表面的極性基團(tuán)與水分子以氫鍵相結(jié)合，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高其吸水能力，使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。同時(shí)，TAKANO等[3]研究發(fā)現(xiàn)水分子可與蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)-水分子簇，在分子層面增強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

此外，黏合劑對于重組魚糜制品的熱穩(wěn)定特性具有重要作用。目前幾種應(yīng)用較為廣泛的水產(chǎn)品黏合劑包括谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(transglutaminase, TGase)、玉米淀粉、卡拉膠等。酶制劑主要是通過肌原纖維蛋白的化學(xué)交聯(lián)作用增強(qiáng)蛋白質(zhì)的凝膠作用，從而提高重組魚肉的質(zhì)構(gòu)特性。TGase作為一種應(yīng)用較為普遍的酶型黏合劑，可通過催化谷氨酰胺殘基從肽鏈轉(zhuǎn)移到γ-羧酰胺基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成非二硫鍵共價(jià)鍵?-(γ-Glu)-Lys，連接肌原纖維蛋白的頭部以提高凝膠強(qiáng)度[4]。YANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)，重組豬肉經(jīng)TGase處理后，所形成的共價(jià)鍵比較穩(wěn)定，不易斷裂，經(jīng)過反復(fù)凍融和蒸煮后不會(huì)松散。ARDIANSYAH等[6]研究低鹽重組魚排時(shí)發(fā)現(xiàn)添加TGase會(huì)使蛋白質(zhì)之間形成的共價(jià)交聯(lián)鍵增多，使其質(zhì)地變硬，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，凝膠強(qiáng)度增加。

此外，重組魚糜產(chǎn)品形式也較為匱乏，主要是魚腸、魚糕等傳統(tǒng)產(chǎn)品。近年來有研究將魚肉與豬肉重組，增強(qiáng)其風(fēng)味[7]，但豬肉油脂含量較高，易發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致貨架期縮短。此外，增加的脂肪含量也與運(yùn)動(dòng)健身人群的健康低脂需求相悖，同時(shí)帶來了高飽和脂肪酸和高膽固醇含量等缺點(diǎn)[8]。而雞胸肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇、低熱量等特點(diǎn)，作為典型的白肉類型，雞胸肉較魚肉含有更為豐富的肌原纖維蛋白纖絲，其凝膠性和纖維感較強(qiáng)。且經(jīng)過121 ℃高溫滅菌后，蛋白質(zhì)熱降解產(chǎn)生的小分子肽和游離氨基酸發(fā)生脫氨、脫羧反應(yīng)，生成醇、醛、硫化物等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[9]。因此，將魚糜與雞胸肉結(jié)合，開發(fā)一種具有纖維感的重組魚糜制品，對于豐富魚糜制品種類，增強(qiáng)魚糜的咀嚼性，以及創(chuàng)新魚糜加工形式具有重要意義。

本研究通過結(jié)合魚糜凝膠的黏彈特性及雞胸肉鮮明的纖維特征，進(jìn)一步以高溫處理前后質(zhì)構(gòu)特性變化為指標(biāo)，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化魚糜制備過程中的關(guān)鍵工藝參數(shù)(食鹽、水分和TGase的添加量)，制備一種具有纖維感的即食重組魚糜制品。進(jìn)一步通過內(nèi)源熒光光譜、微觀結(jié)構(gòu)觀察、SDS-PAGE、化學(xué)作用力分析等表征手段，研究重組魚糜制品的熱穩(wěn)定特性。本研究結(jié)果可為豐富魚糜制品加工種類提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿拉斯加鱈魚魚糜由浙江漁福公司提供，真空包裝，-20 ℃貯藏備用。泰森冷凍雞胸肉購買于聯(lián)華超市。TGase購買于上海青瑞食品科技有限公司，食品級，型號為TGY-2，酶活力為160 U/mL。NaH2PO4、三羥甲基氨基甲烷[tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, Tris]、甘氨酸(glycine, Gly)、NaCl、鹽酸、無水乙醇、戊二醛，分析純，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

ZRD-A780全自動(dòng)鼓風(fēng)干燥箱，上海智誠分析儀器制造有限公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀，英國Stable Micro Systems公司；Zetasizer Nano-ZS90激光納米粒度分析儀，英國Malvern儀器有限公司；ARL Advant X熒光光譜儀，美國Thermo公司；ECLIPSE E100 SCIENTZ-950顯微鏡，尼康儀器有限公司；S312恒速數(shù)顯電動(dòng)攪拌器，鄭州宇詳儀器設(shè)備有限公司；ISO9001電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 纖維感重組魚糜制品的制備

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雞胸肉的含水量與其質(zhì)構(gòu)特性密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%水分含量的肉粒纖維韌性與耐咀嚼性最好。因此，本研究將雞胸肉風(fēng)干至水分含量40%，切丁(0.2 cm×0.2 cm× 0.2 cm)待用。冷凍魚糜解凍12 h，空擂2 min，加入魚糜和風(fēng)干雞胸肉總質(zhì)量0.5%～2%的食鹽，鹽擂2 min，隨后加入7%的固形物(小麥蛋白∶馬鈴薯淀粉=2∶3，質(zhì)量比，下同)擂潰2 min，分3次加入4%～16%的冰水，每次擂潰3 min，繼續(xù)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%～1%的液態(tài)TGase，擂潰1 min，最后與雞肉丁1∶1混勻。隨后壓模4 ℃放置18 h，40 ℃蒸煮20 min，90 ℃蒸煮15 min。脫模后真空包裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌10 min。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

按上述方法制備纖維感重組魚糜制品，添加魚糜和風(fēng)干雞胸肉總質(zhì)量12%水分，0.5%TGase，選取食鹽添加量(0.5%、1%、1.5%、2%)；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%食鹽，0.5%TGase，水分添加量(4%、8%、12%、16%)；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%食鹽，12%水分，TGase添加量(0.25%、0.5%、0.75%、1%)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探究各因素對即食重組纖維感魚糜制品高溫滅菌前后質(zhì)構(gòu)特性的影響，每個(gè)因素平行試驗(yàn)12次，取平均值。

參考LIU等[10]的方法，將121 ℃高溫滅菌前后的即食重組纖維感魚糜制品切成1 cm×1 cm×1 cm的方塊，選用質(zhì)構(gòu)儀的TPA模型，P 36R探頭，測試前速度、測試速度和測試后速度設(shè)置為2、1、2 mm/s，壓縮率為40%。每組樣品至少測定12個(gè)平行樣，取平均值。

1.3.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化纖維感重組魚糜制品的最佳工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert 8.06軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，選取食鹽添加量、水分添加量、TGase添加量為考察因素，以咀嚼度和121 ℃高溫滅菌前后咀嚼度降低率為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)原理，選用3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，優(yōu)化耐高溫的纖維感重組魚糜制品的加工工藝。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素編碼及水平表Table 1 Response surface experimental factor coding and level table

1.3.4 微觀結(jié)構(gòu)的測定

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果制備纖維感重組魚糜制品，40 ℃蒸煮20 min，90 ℃蒸煮15 min。脫模后真空包裝，再分別經(jīng)過100、105、110、115、120 ℃高溫蒸煮10 min后，以未經(jīng)高溫處理的樣品作為對照，觀察高溫處理過程中其微觀結(jié)構(gòu)的變化。制作樣品切片于25 g/L戊二醛中固定，乙醇梯度洗脫后冷凍干燥24 h，噴金后用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察拍照。

1.3.5 肌纖維形態(tài)的測定[11]

將經(jīng)過不同高溫處理的重組魚糜制品切成1 cm×1 cm×1 cm正方體浸入體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中固定24 h，然后乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，用石蠟包埋，制成1 cm×1 cm×1 cm的石蠟塊，用切片機(jī)切片，最后蘇木精-伊紅法染色后，顯微鏡鏡檢，圖像采集，選取雞肉纖維橫縱切面進(jìn)行分析。

1.3.6 抗熱力降解機(jī)理研究

1.3.6.1 內(nèi)源熒光

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)提取采用林忠武[12]的方法。稱取不同熱處理的肉樣 5 g，添加 50 mL 0.03 mol/L 的磷酸緩沖液(pH 7.4)，打漿 2 min 均質(zhì)。10 000×g、4 ℃離心20 min，上清液為肌漿蛋白，沉淀物中添加 40 mL 含有8 mol/L 尿素的緩沖液，打漿 2 min，10 000×g、4 ℃離心20 min，上清液用濾紙?jiān)? ℃下過濾，濾液為肌原纖維蛋白。將MP濃度調(diào)成0.5 mg/mL，測定參數(shù)如下：激發(fā)波長295 nm；狹縫10 nm；掃描范圍300～450 nm；靈敏度3。

1.3.6.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)圖譜

取適量樣品，加入9倍體積分?jǐn)?shù)5%的SDS溶液，高速勻漿2 min。在85 ℃水浴中放置1 h，冷卻至室溫。8 000×g下離心20 min，用Lowry法測定上清液中蛋白濃度，并調(diào)至1 mg/mL。取調(diào)節(jié)濃度后的樣品與5×Loading Buffer混合，沸水浴5 min。

分別取15 μL上述混合液和標(biāo)品于聚丙烯酰胺凝膠(12%分離膠、5%濃縮膠)，電壓為80 V，當(dāng)樣品跑至濃縮膠與分離膠之間后，調(diào)至120 V。電泳結(jié)束后，取出凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色30 min。脫色液脫色至條帶清晰。

1.3.6.3 非共價(jià)鍵[13]

2 g樣品分別與10 mL萃取劑S0(0.05 mol/L NaCl)、S1(0.6 mol/L NaCl)、S2(0.6 mol/L NaCl和1.5 mol/L尿素)和S3(0.6 mol/L NaCl和 8 mol/L尿素)混合均勻后均質(zhì)1 min，4 ℃浸提1 h，10 000×g離心15 min，上清液中的蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法測定。離子鍵為溶解于S1與S0溶液中的蛋白質(zhì)含量之差表示，氫鍵以溶解于S2與S1溶液中的蛋白質(zhì)含量之差表示，疏水相互作用以溶解于S3與S2溶液中的蛋白質(zhì)含量之差表示。

1.3.6.4 二硫鍵

參照 BEVERIDGE 等[14]方法。將1 g樣品加入5倍體積的Tris-甘氨酸Gly緩沖溶液(含0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Gly，0.004 mol/L EDTA，8 mol/L 尿素)勻漿，10 000×g離心15 min，4 mL上清液加入200 μL Ellman 試劑，置于室溫1 h，測定412 nm處吸光值(A412)。按公式(1)計(jì)算巰基含量:

(1)

式中：73.53=106/1.36×104，1.36×104為摩爾消光系數(shù)；ρ，樣品的蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

測總巰基含量時(shí)，取1 mL上清液，加入4 mL Tris-甘氨酸緩沖液(含15 mg/mL β-巰基乙醇，8 mol/L 尿素，5 mol/L 鹽酸胍)，室溫下反應(yīng)1 h，之后加入50%三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA) 至最終濃度為10%，3 000×g離心，沉淀用12% TCA洗滌2次，將沉淀溶于3 mL的Tris-Gly-8 mol/L 尿素緩沖液，二硫鍵含量為總巰基含量與游離巰基的差值。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用單因素ANOVA兩兩比較的Duncan模型進(jìn)行多組數(shù)據(jù)差異性分析，顯著性水平為P<0.05。數(shù)據(jù)作圖均采用 Origin Pro 8.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

質(zhì)構(gòu)特性是評價(jià)肉制品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，能間接反映出蛋白基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性及與其他成分相結(jié)合的狀態(tài)。其中咀嚼度是指將固體樣品咀嚼并達(dá)到吞咽時(shí)的穩(wěn)定狀態(tài)所需要的能量，能夠反映肉質(zhì)纖維的咀嚼感[15]。圖1顯示了食鹽、水分和TGase的添加量對重組魚糜制品高溫處理前后硬度、彈性和咀嚼度的影響。121 ℃高溫滅菌前后魚糜制品質(zhì)構(gòu)特性(硬度、彈性、咀嚼度)降低率越低，說明其熱穩(wěn)定性越好。

由圖1(a1～a3)可以看出，與對照組相比，添加一定濃度的食鹽可顯著增強(qiáng)重組魚糜的硬度、彈性及咀嚼度(P<0.05)。經(jīng)高溫滅菌后，魚糜制品的質(zhì)構(gòu)特性顯著降低，且隨NaCl添加量的增加，硬度與咀嚼度的降低率逐漸增大，熱穩(wěn)定性下降。BLIKRA等[16]研究發(fā)現(xiàn)，加入高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的NaCl，改變了蛋白質(zhì)更有效結(jié)合水的pH值，增強(qiáng)持水性。但當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)之間形成較強(qiáng)的化學(xué)鍵，使得肌肉收縮，MP因此迅速失去水分，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑增大，重組魚糜制品熱穩(wěn)定性下降[17]。

水分子既可以通過氫鍵與蛋白質(zhì)表面相結(jié)合，也可以填充在蛋白質(zhì)空穴中增強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。由圖1(b1～b3)可知，增加水分添加量，滅菌前后的魚糜制品硬度和咀嚼度均顯著降低(P<0.05)，彈性變化不顯著，其中添加8%的水分硬度和咀嚼度的降低率最低。由此可見，添加適量的水分可以有效提高重組魚糜制品的熱穩(wěn)定性。這可能是因?yàn)樘砑铀譃榧±w維的吸水膨脹提供了充足的條件[18]，且由于蛋白質(zhì)和水分子的水合作用使得蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)[3]。

由圖1(c1～c3)可知，添加一定濃度的TGase使重組魚糜制品的硬度、彈性和咀嚼度顯著增強(qiáng)(P<0.05)。當(dāng)TGase的添加量為0.75%時(shí)，產(chǎn)品高溫滅菌后質(zhì)構(gòu)特性的降低率最小，其熱穩(wěn)定性最強(qiáng)?？赡苁且?yàn)樵隰~糜凝膠的熱誘導(dǎo)凝膠化過程中，交聯(lián)度的增加導(dǎo)致凝膠質(zhì)地從黏彈性變?yōu)閺椥?，凝膠結(jié)構(gòu)從無序和松散變?yōu)橛行蚝椭旅躘19-20]。然而，過多的TGase使蛋白質(zhì)之間相互作用增強(qiáng)，可能會(huì)減少蛋白質(zhì)與水之間的相互作用，導(dǎo)致水分流失，形成過于堅(jiān)固且柔韌性差的網(wǎng)絡(luò)，熱穩(wěn)定性降低[21]。

a1～a3-食鹽添加量對魚糜制品質(zhì)構(gòu)的影響；b1～b3-水分添加量對魚糜制品質(zhì)構(gòu)的影響；c1～c3-TGase添加量對魚糜制品質(zhì)構(gòu)的影響圖1 食鹽、水分及TGase添加量對重組魚糜制品質(zhì)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of salt, water and TGase addition on texture of recombinant surimi products注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化纖維感重組魚糜制品加工工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合分析，食鹽添加量選取0.5%、1%、1.5%，水分添加量選取4%、8%、12%，TGase添加量選取0.5%、0.75%、1%。咀嚼度為硬度、內(nèi)聚性、彈性三者乘積，它綜合反映了重組魚糜制品對咀嚼的持續(xù)抵抗性。經(jīng)121 ℃滅菌后，肌纖維斷裂程度越小，其咀嚼至吞咽時(shí)的穩(wěn)定狀態(tài)所需要的能量越高，可以在一定程度上間接反映該產(chǎn)品整體具有肉質(zhì)纖維咀嚼的真實(shí)感[22]。因此，以咀嚼度和咀嚼度滅菌前后的降低率為響應(yīng)值，采用BoxBehnken法進(jìn)行試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and result of response surface analysis

利用 Design-Expert 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件將咀嚼度和咀嚼度降低率分別進(jìn)行二次回歸擬合，并對二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行方差分析，所建立的模型能比較準(zhǔn)確地分析和預(yù)測重組魚糜制品中食鹽、水分及TGase添加量與其咀嚼度及其降低率的關(guān)系，得出最佳工藝條件為，食鹽添加量0.52%、水分添加量4.06%、TGase添加量0.51%，預(yù)測得到的纖維感重組魚糜制品的咀嚼度為2 982.4，降低率為4.6%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏?zhǔn)確性，在此條件下平行實(shí)驗(yàn)3次，得出咀嚼度為2 812.8，降低率為5.7%。由此可見咀嚼度和滅菌前后降低率的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測值比較接近，表明預(yù)測結(jié)果較優(yōu)。

2.3 重組魚糜制品微觀結(jié)構(gòu)及肌纖維形態(tài)

圖2(a1～a6)為魚糜凝膠部分在高溫處理過程中的微觀結(jié)構(gòu)變化，經(jīng)100～110 ℃高溫處理后，魚糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加平整有序。這是因?yàn)榈鞍字g氫鍵、靜電及疏水相互作用的改變，促使其發(fā)生聚集和交聯(lián)，形成有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。115 ℃高溫處理組的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)較多孔洞，無法形成有序的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。說明115 ℃以上的高溫對凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有較大程度的破壞，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的骨架變得更為脆弱，孔隙更大。120 ℃處理的魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)出小而緊湊的聚集簇，表明隨著加熱溫度的升高，使蛋白過度聚合變性，產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。這與韓靜文[13]研究耐熱性魚腸的結(jié)果一致。

通過HE染色法進(jìn)一步對魚糜制品中的雞肉纖維形態(tài)進(jìn)行觀察(圖2-b1～b6，c1～c6)。未進(jìn)行高溫處理的樣品肌纖維結(jié)構(gòu)完整，而經(jīng)不同高溫處理后肌纖維逐漸出現(xiàn)腫脹、邊界不清晰、纖維斷裂等現(xiàn)象，說明高溫處理會(huì)破壞肌纖維的結(jié)構(gòu)[23]。當(dāng)高溫處理溫度升高至105 ℃時(shí)，可以明顯看出肌纖維橫截面積增大，可能是該溫度范圍內(nèi)纖維縱向收縮的結(jié)果，導(dǎo)致肌肉纖維橫截面積膨脹[24]。但當(dāng)溫度繼續(xù)升高，肌纖維橫截面積變小，且間隙變大，且纖維斷裂現(xiàn)象更加明顯，說明橫向收縮和縱向收縮加劇。VASKOSKA等[25]也研究證實(shí)隨著熱加工過程中溫度的升高，肌纖維會(huì)連續(xù)橫向收縮，然后縱向收縮。因此，一定程度的高溫處理(100～110 ℃)導(dǎo)致MP活性基團(tuán)暴露，氫鍵、靜電及疏水相互作用的改變，促使其發(fā)生聚集和交聯(lián)，形成有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨著處理溫度的升高，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散，孔洞較多，肌纖維發(fā)生明顯斷裂。

a-魚糜凝膠部分SEM圖，5 000×；b-肌纖維部分纖維橫截面HE染色圖；c-肌纖維縱截面HE染色圖，20×；對照-90 ℃蒸煮15 min后未經(jīng)高溫處理的樣品(下同)圖2 高溫處理過程中重組魚糜制品微觀結(jié)構(gòu)及肌纖維形態(tài)變化Fig.2 Changes in the microstructure and muscle fiber morphology of the recombinant surimi products subjected to the high temperature treatments注：1～6表示不同處理組

2.4 重組魚糜制品肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜分析

高溫處理會(huì)引起蛋白構(gòu)象改變，使芳香族氨基酸殘基的位置及微環(huán)境發(fā)生變化，而芳香族氨基酸殘基可吸收紫外入射光發(fā)射熒光，因此可利用內(nèi)源熒光光譜來研究蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。如圖3所示，高溫處理使得MP的λmax發(fā)生紅移，熒光強(qiáng)度隨高溫處理溫度的升高先增大后減小，在105 ℃時(shí)達(dá)到最大。說明MP熱變性過程中，結(jié)構(gòu)會(huì)逐步展開，使埋藏在分子內(nèi)部的色氨酸等芳香族氨基酸殘基逐漸從內(nèi)部疏水區(qū)向溶劑暴露，導(dǎo)致MP所處微環(huán)境極性增強(qiáng)，產(chǎn)生溶劑淬滅作用，因此蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度的峰值λmax逐漸紅移[26]。120 ℃熒光強(qiáng)度增加，可能是MP通過疏水相互作用聚集形成蛋白質(zhì)聚集物，將暴露的少量疏水性殘基重新包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部，使蛋白質(zhì)所處的微環(huán)境極性降低，熒光強(qiáng)度增加，這與康懷彬等[27]研究高溫處理對牛肉蛋白內(nèi)源熒光光譜變化結(jié)果一致。

圖3 高溫處理過程中重組魚糜制品肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜圖Fig.3 Intrinsic fluorescence spectra of myofibrillar protein during high temperature treatment

2.5 重組魚糜肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析

SDS-PAGE圖譜可以直觀地看出蛋白質(zhì)的熱降解情況。重組肌肉蛋白的形成主要涉及肌球蛋白頭部、尾部和肌動(dòng)蛋白的展開、交聯(lián)和聚集[28]，因此，肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)(200 kDa)和肌動(dòng)蛋白(Actin，43 kDa)在蛋白凝膠形成中起主要作用。從圖4可以看出，隨著熱處理溫度的升高，電泳條帶在200～130 kDa和55～25 kDa均出現(xiàn)了明顯變淺，說明高溫促進(jìn)蛋白發(fā)生熱降解，形成了小分子肽段，導(dǎo)致MHC和Actin含量隨熱處理溫度升高明顯降低。經(jīng)120 ℃高溫處理后，200 kDa處的MHC條帶已完全消失，而44.3 kDa處的肌動(dòng)蛋白條帶變化較小，120 ℃處理后仍存在，說明蛋白熱穩(wěn)定性較好[28]。

圖4 高溫處理過程中重組魚糜制品肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE graph of myofibrillar protein of recombinant surimi product during high temperature treatment

2.6 重組魚糜制品蛋白質(zhì)化學(xué)作用力的變化

化學(xué)作用力在魚糜蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成中發(fā)揮了重要的作用。由圖5-a可知，隨著溫度升高，離子鍵含量先上升，后下降，105～110 ℃無明顯差異，當(dāng)溫度大于110 ℃時(shí)，迅速上升。氫鍵隨處理溫度的升高而迅速下降，至115 ℃后又呈上升趨勢?？赡苁堑鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)在過高的處理溫度下被破壞，因此維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氫鍵含量減少。120 ℃處理后的魚糜制品的氫鍵含量增加，可能是因?yàn)榻庑蟮募∏虻鞍紫嗷ラg無序結(jié)合，此時(shí)氫鍵重新暴露出來，含量增加。疏水相互作用整體呈先上升后下降，最后趨于穩(wěn)定。隨著溫度的升高，肌球蛋白展開導(dǎo)致疏水性殘基的暴露，相鄰暴露的疏水殘基能夠通過疏水相互作用交聯(lián)，和其他分子間作用形成了蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[29]。溫度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白變性和相互聚集的速率升高，不同蛋白質(zhì)分子間相互作用的時(shí)間縮短，故其作用隨著溫度的升高而減少[13]。

二硫鍵是由巰基氧化生成的共價(jià)鍵，有著極強(qiáng)的鍵能，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有著一定的影響。由圖5-b可知，隨著處理溫度的升高，二硫鍵含量呈先上升后下降的趨勢，105 ℃最大。二硫鍵含量上升可能是因?yàn)榈鞍追肿又g靜電斥力減弱，增加了蛋白分子表面游離巰基的互相接觸，促進(jìn)了二硫鍵的形成[30]。105～115 ℃二硫鍵含量趨于穩(wěn)定，分子鏈內(nèi)部的聚合聯(lián)結(jié)作用得到加強(qiáng)。120 ℃二硫鍵含量大幅度降低，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子間的靜電斥力增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子去折疊的程度降低，巰基與二硫鍵之間的硫醇-二硫鍵交換反應(yīng)減弱[30]。

a-非共價(jià)作用；b-二硫鍵圖5 高溫處理過程中重組魚糜制品蛋白間化學(xué)作用力的變化Fig.5 Changes in the chemical force of recombinant surimi product protein during high temperature treatment

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以冷凍魚糜和低溫風(fēng)干的雞胸肉粒為原料，通過響應(yīng)面優(yōu)化制備了一種具有纖維感和高熱穩(wěn)定的重組魚糜制品。確定食鹽、水分、TGase的最佳添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、4.1%、0.5%，此條件下制備的纖維感重組魚糜制品經(jīng)121 ℃滅菌10 min后的咀嚼度仍具有較高的咀嚼度，滅菌前后降低率為5.7%。微觀結(jié)構(gòu)分析表明，在高溫處理過程中，100～110 ℃條件下魚糜凝膠部分的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)平整有序，肌纖維橫截面積增大，溫度繼續(xù)升高，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和肌纖維形態(tài)均被破壞。隨著處理溫度的升高，蛋白降解成小分子質(zhì)量的蛋白片段，分子內(nèi)部的色氨酸等芳香族氨基酸殘基暴露，靜電相互作用增加。高溫處理過程中維持重組魚糜制品蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要化學(xué)作用力為疏水相互作用和二硫鍵。本研究可為即食重組魚糜制品制備提供一定的理論依據(jù)。