糖誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控ALD6基因表達(dá)降低黃酒中的高級醇生成量

康新玥，魏敏，江森，王歡，郭學(xué)武,2，肖冬光,2，武曉樂,2，陳葉福,2*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學(xué))，天津，300457)

GB/T 13662—2018《黃酒》中定義黃酒是以稻米、黍米、小米、玉米、小麥、水等為主要原料，經(jīng)加曲和/或部分酶制劑、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒。黃酒酒度較低，酒體醇香，富含蛋白質(zhì)、氨基酸等多種有益人體健康的物質(zhì)，深受消費者喜愛[1]。近年來，隨著消費水平的提高，消費者不僅關(guān)注風(fēng)味口感，還越來越關(guān)注健康，而黃酒中的高級醇含量在發(fā)酵酒中較高，是限制黃酒行業(yè)發(fā)展的制約性因素之一[2]。黃酒中的高級醇主要包括異戊醇、異丁醇、正丙醇、苯乙醇等。適量的高級醇賦予黃酒以醇厚感，但是高級醇含量過高不僅影響其風(fēng)味口感，而且會對人體產(chǎn)生不適感甚至毒害作用，使飲用者飲后易醉、易暈眩且不利人體健康，其含量過低也會導(dǎo)致黃酒風(fēng)味寡淡，酒體不豐盈[3-6]。因此，調(diào)控黃酒中的高級醇含量對于黃酒行業(yè)的發(fā)展意義重大。

目前研究表明，黃酒等發(fā)酵酒中的高級醇主要由釀酒酵母代謝產(chǎn)生，其生成途徑主要是氨基酸分解代謝途徑和糖代謝途徑。在釀酒酵母中降低脫羧酶(PDC酶系)、醇脫氫酶(ADH酶系)的活性同時提高醛脫氫酶(ADL酶系)的活性，可以達(dá)到降低高級醇生成量的目的。乙醛脫氫酶屬于釀酒酵母丙酮酸脫氫酶旁路(pyruvate dehydrogenase bypass，PDB)中的酶，氧化乙醛生成乙酸[7]。本實驗室前期研究表明過表達(dá)乙醛脫氫酶基因ALD6可降低52.8%的高級醇，但ALD6基因的過表達(dá)也提高了酵母的乙酸生成量(為出發(fā)菌株的3.6倍)，這在一定程度上影響了酵母的生長和發(fā)酵性能，且乙酸含量過高會對酒體協(xié)調(diào)性產(chǎn)生不利影響[8]。

常用的啟動子主要有組成型和誘導(dǎo)型2種，組成型啟動子大多為強啟動子，某些基因不需要過強的表達(dá)量，否則會導(dǎo)致產(chǎn)物毒性或代謝負(fù)擔(dān)，對生長代謝有負(fù)面影響[9]。誘導(dǎo)型啟動子則是在特定培養(yǎng)條件下才有誘導(dǎo)基因表達(dá)的能力，可以通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)條件來掌控基因表達(dá)的水平，Phxts是受葡萄糖濃度誘導(dǎo)的HXT系列啟動子，對不同濃度葡萄糖的響應(yīng)程度及親和力存在差異[10]，可達(dá)到根據(jù)不同糖濃度動態(tài)調(diào)控ALD6基因表達(dá)的目的。黃酒發(fā)酵是雙邊發(fā)酵，發(fā)酵過程中的糖濃度是動態(tài)變化的，因此，本研究采用動態(tài)調(diào)控策略[11-12]，選用6種HXT系列的糖誘導(dǎo)型啟動子(Phxt1、Phxt2、Phxt3、Phxt4、Phxt5、Phxt7)過表達(dá)ALD6基因構(gòu)建重組菌株，在具有降低高級醇效果的同時，降低其對酵母生長和發(fā)酵產(chǎn)生的不利影響，為生產(chǎn)舒適健康的黃酒提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒見表1。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract-peptone-dextrose，YEPD)培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10、蛋白胨20、葡萄糖20，115 ℃，滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉5、蛋白胨10、NaCl 10，121 ℃，滅菌20 min。

半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L)：半乳糖10，蛋白胨20，酵母浸粉10，121 ℃，滅菌20 min。

一級種子培養(yǎng)基(g/L)：將玉米糖化清液糖度調(diào)至8° Bx，酵母浸粉5。

二級種子培養(yǎng)基(g/L)：將玉米糖化清液糖度調(diào)至12° Bx，酵母浸粉5。

1.2 儀器與設(shè)備

22331Harmburg型PCR擴增儀，德國Eppendorf公司；PowerPacTM型電泳儀，美國Bio-Rad公司；Bioscreen全自動凝膠成像儀，上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司；7890A型氣相色譜、1100型高效液相色譜，安捷倫科技；StepOne實時熒光定量PCR，美國AB公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組菌株的構(gòu)建

根據(jù)美國國家生物信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)報道的釀酒酵母的基因序列使用Primer 5.0軟件設(shè)計PCR引物，用于構(gòu)建重組菌株及驗證。通過查閱文獻(xiàn)及在NCBI上確定誘導(dǎo)型啟動子的序列用于構(gòu)建不同啟動子過表達(dá)ALD6基因的重組菌株。引物序列見表2。

表2 PCR引物Table 2 PCR primers

續(xù)表2

本實驗在前期改造菌株a-Ppgk1-ALD6的基礎(chǔ)上更換誘導(dǎo)型啟動子，以誘導(dǎo)型啟動子Phxt3為例說明用啟動子Phxt3過表達(dá)ALD6基因構(gòu)建重組菌株a-Phxt3-A的過程，實驗均以a-Ppgk1-ALD6(該菌株在BAT2位點過表達(dá)ALD6基因，其中啟動子為Ppgk1，終止子為Tcps1)基因組為模板，分別使用引物對B3-U/D、A3-U/D和P3-U/D進(jìn)行PCR擴增，獲得上同源臂BA、ALD6-Tcps1-BB和啟動子Phxt3片段；以質(zhì)粒PUG6為模板，使用引物K3-U/D進(jìn)行PCR擴增，得到KanMX片段。通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將BA，ALD6-Tcps1-BB，Phxt3，KanMX片段全部導(dǎo)入酵母細(xì)胞，酵母自身通過胞內(nèi)DNA assembly實現(xiàn)多片段的組裝，并由同源臂介導(dǎo)的同源重組將目的基因表達(dá)整合到過表達(dá)位點[13]，同源重組過程如圖1所示。

圖1 Phxts啟動子過表達(dá)ALD6釀酒酵母菌株同源重組過程Fig.1 Homologous recombination process of overexpression ALD6 with Phxts promoter in Saccharomyces cerevisiae

在含有300 μg/mL G418抗性的YEPD培養(yǎng)基上篩選重組菌株。以提取重組菌株的基因組DNA為模板，以菌株a-Ppgk1-ALD6基因組為陰性對照，用驗證引物YZ-BAT2-U/D、YC-U/YA-D、H3-U/D對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗證。其余菌株驗證引物前2對均與舉例引物相同，第3對引物為對應(yīng)序號標(biāo)記驗證引物。

通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pGAPza質(zhì)粒導(dǎo)入重組菌株，挑取轉(zhuǎn)化子于半乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，稀釋涂布于YEPD培養(yǎng)基。將長出的單菌落在YEPD培養(yǎng)基和含300 μg/mL G418抗性的YEPD培養(yǎng)基進(jìn)行點板，挑出在G418抗性培養(yǎng)基上不生長而在YEPD培養(yǎng)基上生長的菌株，提取其基因組進(jìn)行PCR驗證。若以該基因組為模板PCR擴增KanMX片段，不能得到1 600 bp左右的條帶，而以轉(zhuǎn)化前重組菌株的基因組為模板能擴增得到該基因片段，即說明菌株成功去除KanMX篩選標(biāo)記。

1.3.2 過表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄水平測定

將酵母接種于5 mL YEPD液體試管，180 r/min、30 ℃培養(yǎng)12 h，然后取500 μL轉(zhuǎn)接于5 mL YEPD液體試管，相同條件培養(yǎng)4 h后，采用由TaKaRa公司提供的試劑盒Yeast Processing Reagent (for total RNA preparation) Code No.9089，按操作說明書收集菌體、提取總RNA；然后進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄、去除DNA；最后采用儀器Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System，以UBC6基因為內(nèi)參基因進(jìn)行Real Time PCR實驗，測定待測菌株的mRNA水平。本實驗RNA的逆轉(zhuǎn)錄、去除DNA以及Real Time PCR實驗所用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)由TaKaRa公司提供[14]。

1.3.3 生長曲線測定

首先用接種環(huán)在斜面刮取一環(huán)酵母菌株于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基試管中，180 r/min，30 ℃，培養(yǎng)12 h。振蕩混勻菌液后，分別取10、20、30和40 μL菌液轉(zhuǎn)入含有1 mL液體YEPD的EP管中。然后取300 μL加入100孔深孔板，取300 μL YEPD液體培養(yǎng)基做空白對照，30 ℃培養(yǎng)24 h，之后每隔0.5 h測其在600 nm處的吸光度值。以培養(yǎng)時間為橫軸，OD600為縱軸，繪制菌株的生長曲線。

1.3.4 發(fā)酵實驗

發(fā)酵種子液培養(yǎng)：取酵母菌接種到裝有5 mL一級種子培養(yǎng)基的試管，30 ℃靜置24 h，然后將其全部接入含有45 mL二級種子培養(yǎng)基的150 mL三角瓶，30 ℃靜置20 h。

大米清液制備：

大米→蒸煮→液化→糖化→過濾滅菌→接菌發(fā)酵

操作要點：大米蒸煮后加3 000 mL蒸餾水、耐高溫α-淀粉酶500 μL、麥曲150 g，70 ℃水浴90 min。糖化酶500 μL，60 ℃水浴8 h，過濾得大米糖化清液。每瓶142 mL分裝至250 mL三角瓶。按種子培養(yǎng)的方法培養(yǎng)酵母種子液，然后接種7.5 mL菌液于上述瓶中密封發(fā)酵。

傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵工藝流程[4]：

大米→蒸煮→攤晾→拌曲→接菌→補水發(fā)酵

操作要點：大米和水按質(zhì)量比1∶1蒸煮0.5 h。攤晾冷卻1 h。大曲的用量為大米的15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，拌勻裝入500 mL三角瓶。接菌700萬個/g，米和水按質(zhì)量比1∶1補加水，混勻密封，30 ℃發(fā)酵7 d。

1.3.5 檢測方法

按照GB/T 13662—2018《黃酒》中斐林試劑法測定還原糖，酒精計比重法[15]測定酒精度，根據(jù)稱重確定CO2排放量。

采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中乙酸含量[7]：Aminex HPX-87H色譜柱，柱溫60 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，檢測器為示差折光檢測器。

采用氣相色譜法測定餾出液高級醇的生成量[16]：氣相色譜儀Agilent 7890C，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測器溫度200 ℃。進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1。載氣為高純度N2，流速2.0 mL/min。起始柱溫50 ℃，保持8 min，再以5 ℃/min的升溫速度升溫至120 ℃，保持5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖誘導(dǎo)型啟動子過表達(dá)ALD6基因釀酒酵母的構(gòu)建

2.1.1ALD6基因過表達(dá)菌株的構(gòu)建與驗證

利用6種HXT系列糖誘導(dǎo)型啟動子Phxt1、Phxt2、Phxt3、Phxt4、Phxt5和Phxt7構(gòu)建過表達(dá)ALD6的重組菌株a-Phxt1-A，a-Phxt2-A，a-Phxt3-A，a-Phxt4-A，a-Phxt5-A和a-Phxt7-A，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證。以a-Phxt3-A菌株的構(gòu)建為例，構(gòu)建過程如1.3.1所述，對重組菌株a-Phxt3-A的驗證結(jié)果如圖2所示。用引物YZ-BAT2-U/D、YC-U/YA-D、H3-U/D對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗證，上游驗證引物YZ-BAT2-U/D，得到2 694 bp的條帶；中游驗證引物H3-U/D，得到3 430 bp的條帶；下游驗證引物YC-U/YA-D，得到1 691 bp的條帶，對照均無條帶。由圖2可知，PCR驗證結(jié)果與預(yù)期一致，說明菌株構(gòu)建成功。之后通過1.3.1的方法去除重組菌株KanMX抗性標(biāo)記。

圖2 重組菌株a-Phxt3-A的PCR定點驗證Fig.2 PCR verification of the recombinant strain a-Phxt3-A注：M：DL5 000 bp Marker；泳道1、3和5分別為重組菌株a-Phxt3-A的上、中和下游驗證，泳道2、4和6為其陰性對照

2.1.2 基因表達(dá)水平的測定

按照1.3.2對ALD6基因表達(dá)量進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 出發(fā)菌株和重組菌株的ALD6基因表達(dá)量結(jié)果Fig.3 Result of ALD6 expression level in the original and recombinant strains

其中a-Ppgk1-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt1-A、a-Phxt7-A、a-Phxt2-A和a-Phxt5-A中ALD6基因表達(dá)量分別是出發(fā)菌株的6.37、3.85、1.81、1.45、1.3、1.25、1.22和1.05倍，誘導(dǎo)型啟動子Phxt3對ALD6基因的表達(dá)產(chǎn)生的效果僅次于組成型強啟動子Ppgk1。本實驗使用普通YEPD培養(yǎng)基作為培養(yǎng)條件(葡萄糖濃度在20 g/L左右)，若改變培養(yǎng)基條件，糖誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控ALD6基因表達(dá)的強度可能也會改變。因此圖3中的ALD6基因的相對表達(dá)量僅能證明誘導(dǎo)型啟動子過表達(dá)ALD6基因重組菌株構(gòu)建成功。

2.2 出發(fā)菌株和重組菌株的生長性能

2.2.1 YEPD培養(yǎng)基條件下的生長曲線

按照材料與方法1.3.3測定各菌株在YEPD培養(yǎng)基中的生長曲線，結(jié)果如圖4所示，相較于出發(fā)菌，過表達(dá)ALD6的重組菌株生長對數(shù)期的生長速率和穩(wěn)定期時的生物量均略低，說明過表達(dá)ALD6基因可能影響酵母生長。而采用誘導(dǎo)型啟動子過表達(dá)ALD6菌株的生長性能比a-Ppgk1-A稍好，這表明誘導(dǎo)型啟動子的強度弱于組成型啟動子Ppgk1，其調(diào)控ALD6表達(dá)對酵母的生長性能影響相對較小。此條件下的生長曲線可說明糖誘導(dǎo)型啟動子Phxts在YEPD培養(yǎng)基的條件下表達(dá)強度弱于組成型啟動子Ppgk1，由于Phxts啟動子對葡萄糖濃度的響應(yīng)強度不同，此培養(yǎng)條件與黃酒發(fā)酵條件下的糖濃度有很大差別，故后續(xù)采用大米清液體系測定各菌株生長性能。

圖4 出發(fā)菌株和重組菌株的生長曲線Fig.4 Growth curve of the original and recombinant strains

2.2.2 大米清液體系中的生長性能

傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵屬于半固態(tài)發(fā)酵，無法直接測定發(fā)酵過程中各菌株的生長性能，為測定在黃酒發(fā)酵條件中各菌株的生長性能，按1.3.4大米清液體系模擬傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵體系，調(diào)節(jié)初始葡萄糖濃度70 g/L左右，發(fā)酵時每隔2 h取樣檢測600 nm處吸光度，以O(shè)D600值來衡量菌株在大米清液體系中的生長性能。由圖5可知，過表達(dá)ALD6基因的重組菌株在0～12 h的生長速率均低于出發(fā)菌株，說明過表達(dá)ALD6基因影響酵母生長。最終重組菌株a-Ppgk1-A生物量顯著低于其余菌株，a-Phxt1-A略低于出發(fā)菌，但重組菌株a-Phxt2-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt5-A和a-Phxt7-A最終生物量與出發(fā)菌株沒有顯著差異，再次驗證了在大米清液體系中，采用誘導(dǎo)型啟動子(Phxt2、Phxt3、Phxt4、Phxt5、Phxt7)調(diào)控ALD6基因的過表達(dá)可相對減弱其對酵母生長性能的影響。

圖5 出發(fā)菌株和重組菌株在大米清液體系中的生長曲線Fig.5 Growth curve of the original and recombinant strains in supernatant of rice wine fermentation

2.3 出發(fā)菌株和重組菌株的發(fā)酵性能

將出發(fā)菌株a17和重組菌株a17-△B、a-Ppgk1-A、a-Phxt1-A，a-Phxt2-A，a-Phxt3-A，a-Phxt4-A，a-Phxt5-A和a-Phxt7-A按照1.3.4的方法進(jìn)行傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定各菌株的CO2排放量、酒精度和發(fā)酵液中還原糖剩余量。如表3所示，采用誘導(dǎo)型啟動子Phxts過表達(dá)ALD6基因的菌株還原糖余量相較于出發(fā)菌稍高，但低于重組菌株a-Ppgk1-A，且對酒精生成量和CO2排放量幾乎沒有影響。而重組菌株a-Ppgk1-A還原糖余量最高，CO2排放量和酒精度均低于出發(fā)菌和其他重組菌株，說明組成型啟動子Ppgk1過表達(dá)ALD6基因?qū)臧l(fā)酵性能影響最大，與本實驗室前期研究結(jié)果一致。綜上所述，過表達(dá)ALD6基因?qū)湍赴l(fā)酵性能會產(chǎn)生影響，但采用誘導(dǎo)型啟動子過表達(dá)ALD6基因可相對改善這一現(xiàn)象。

表3 出發(fā)菌株和重組菌株基本發(fā)酵性能的比較Table 3 Fermentation performances of the original and recombinant strains

2.4 出發(fā)菌株和重組菌株的乙酸和高級醇生成量

2.4.1 出發(fā)菌株和重組菌株的乙酸生成量

乙醛脫氫酶氧化乙醛產(chǎn)生乙酸，本研究檢測了傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵條件下所得發(fā)酵液中乙酸的生成量(圖6)。重組菌株a-Phxt5-A、a-Phxt2-A、a-Phxt7-A、a-Phxt1-A、a-Phxt4-A、a-Phxt3-A和a-Ppgk1-A的乙酸生成量分別是出發(fā)菌株a17的1.24、1.29、1.4、2、2.88、3和4.44倍。其中重組菌株a-Ppgk1-A的乙酸生成量最高，達(dá)到1.11 g/L，表明在傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵體系中，組成型強啟動子Ppgk1調(diào)控ALD6基因表達(dá)的強度要高于糖誘導(dǎo)型啟動子Phxts，在糖誘導(dǎo)型啟動子中，重組菌株a-Phxt3-A乙酸生成量最高，達(dá)到0.75 g/L。從乙酸的生成量可大致說明在此傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵體系中糖誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控ALD6基因表達(dá)的強度為Phxt3>Phxt4>Phxt1>Phxt7>Phxt2>Phxt5，與2.1.2以YEPD培養(yǎng)基為培養(yǎng)條件時，基因表達(dá)水平測定結(jié)果基本一致，調(diào)控ALD6基因表達(dá)水平越高，則乙酸生成量也越高。

圖6 出發(fā)菌株和重組菌株的乙酸生成量Fig.6 Acetic acid production of the original and recombinant strains

綜上，當(dāng)乙酸含量較高時，對酵母生長性能產(chǎn)生不利影響，通過誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控ALD6基因的表達(dá)，可相應(yīng)調(diào)節(jié)乙酸產(chǎn)量，進(jìn)而降低對酵母生長的影響。原因可能是乙酸的上升，酵母細(xì)胞不能維持胞質(zhì)膜電位平衡，導(dǎo)致細(xì)胞酸化，影響細(xì)胞代謝[17]。

2.4.2 出發(fā)菌株和重組菌株的高級醇生成量

按照傳統(tǒng)發(fā)酵工藝發(fā)酵結(jié)束后，測定出發(fā)菌株和重組菌株餾出液中高級醇的生成量，如圖7所示。與出發(fā)菌株a17相比，重組菌株的高級醇產(chǎn)量均有所下降。其中a-Ppgk1-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt7-A、a-Phxt1-A、a-Phxt2-A、a-Phxt5-A和a17-ΔB總高級醇分別下降52.36%、42.56%、37.84%、30.74%、22.29%、19.26%、16.72%和11.48%。重組菌株a-Ppgk1-A高級醇產(chǎn)量降低最多，苯乙醇、異戊醇、異丁醇、正丙醇分別降低45.67%、56.16%、48.55%、52.41%，總高級醇由592.31下降到280.65 mg/L。重組菌株a-Phxt3-A次之，苯乙醇、異戊醇、異丁醇、正丙醇分別降低37.03%、45.45%、38.69%、41.63%，總高級醇由592.31下降到340.47 mg/L。與誘導(dǎo)型啟動子Phxts相比，強啟動子Ppgk1過表達(dá)ALD6基因的菌株降低高級醇效果更為顯著，可能因為黃酒發(fā)酵過程中誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控ALD6基因的表達(dá)不如組成型啟動子穩(wěn)定，或者其表達(dá)強度弱于組成型啟動子[18]。

圖7 出發(fā)菌株和重組菌株的高級醇生成量Fig.7 Higher alcohols production of the original and recombinant strains

在6種HXT系列糖誘導(dǎo)型啟動子中Phxt3過表達(dá)ALD6基因的菌株降高級醇效果最顯著，這是因為黃酒主發(fā)酵過程中葡萄糖質(zhì)量濃度一般在25～75 g/L，Phxt3是中糖誘導(dǎo)的啟動子，故此糖度有利于啟動子Phxt3調(diào)控ALD6的表達(dá)[19]。Phxt4與Phxt7過表達(dá)ALD6菌株降低高級醇效果次之，這可能因為傳統(tǒng)黃酒補水發(fā)酵的最初階段發(fā)酵液中的葡萄糖濃度較低，在此階段誘導(dǎo)了啟動子Phxt4和Phxt7調(diào)控ALD6基因的表達(dá)，但隨著原料的糖化發(fā)酵液中糖濃度提高，又抑制了其表達(dá)[20]。而Phxt2和Phxt5可能是因為其本身強度較弱使得ALD6基因表達(dá)相對較低，因此最后降低高級醇效果相對較弱。Phxt1過表達(dá)ALD6菌株降低高級醇效果最弱，這是因為啟動子Phxt1最適糖質(zhì)量濃度為90～130 g/L，黃酒發(fā)酵過程中無法達(dá)到該濃度[21]。

重組菌株高級醇生成量降低的原因可能是高級醇的前體物質(zhì)醛類可以被乙醛脫氫酶氧化生成有機酸，故醛類還原產(chǎn)生高級醇有所減少[22-23]。結(jié)合圖6、7，隨著重組菌株乙酸的上升，高級醇生成隨之降低，所以重組菌株高級醇降低的另一原因可能與其乙酸含量顯著上升有關(guān)，高濃度乙酸抑制細(xì)胞代謝，影響了酵母的生長速率，因此，過表達(dá)ALD6可能是通過增加乙酸產(chǎn)量，抑制了酵母的生長性能，進(jìn)而降低了高級醇含量。

3 結(jié)論

本研究在釀酒酵母中選用6個HXT系列糖誘導(dǎo)型啟動子Phxt1、Phxt2、Phxt3、Phxt4、Phxt5和Phxt7過表達(dá)乙醛脫氫酶基因ALD6構(gòu)建6個重組菌株a-Phxt1-A、a-Phxt2-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt5-A、a-Phxt7-A，對比了其與實驗室前期構(gòu)建重組菌株a-Ppgk1-A、出發(fā)菌a17的生長和發(fā)酵性能、乙酸及高級醇生成量，過表達(dá)ALD6基因使酵母產(chǎn)乙酸增多，影響酵母的生長性能，但是糖誘導(dǎo)型啟動子較Ppgk1可以適當(dāng)減弱其對酵母產(chǎn)生的負(fù)面影響。同時，在傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵體系中重組菌株還原糖余量均高于出發(fā)菌株，Ppgk1過表達(dá)ALD6基因?qū)戤a(chǎn)酒精能力影響較顯著，而Phxts幾乎不影響菌株的發(fā)酵性能。與出發(fā)菌株a17相比，重組菌株的高級醇產(chǎn)量均有所下降，其中a-Ppgk1-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt7-A、a-Phxt1-A、a-Phxt2-A、a-Phxt5-A總高級醇分別下降52.36%、42.56%、37.84%、30.74%、22.29%、19.26%和16.72%。綜上所述，誘導(dǎo)型啟動子Phxt3過表達(dá)ALD6基因的重組菌株a-Phxt3-A降高級醇效果最好且對酵母生長和發(fā)酵性能的影響相對較小。本研究采用動態(tài)調(diào)控策略利用糖誘導(dǎo)型啟動子初步解決了ALD6基因過表達(dá)對酵母生長和發(fā)酵的影響，后續(xù)還需要擴大發(fā)酵體系，優(yōu)化發(fā)酵工藝進(jìn)一步驗證HXT系列糖誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控ALD6基因表達(dá)及其降高級醇的效果。