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    基于免疫組織化學(xué)方法分析YWHAZ在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及臨床意義

    2022-12-25 07:35:28王小文程曉菊李廷超劉代順
    關(guān)鍵詞:組織化學(xué)鱗癌腺癌

    王小文,程曉菊,李廷超,田 敏,劉代順

    (1.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 急診科,貴州 遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563000;3.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 病理科,貴州 遵義 563000;4.遵義醫(yī)科大學(xué) 珠海校區(qū),廣東 珠海 519041)

    在我國,肺癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均為第一位,發(fā)病率為81.6/1萬,死亡率為71.5/1萬,且呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)[1]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)以80%的高占比成為了肺癌的主要類型[2]。迄今,肺癌的主要治療策略有手術(shù)切除、放療、化療以及免疫治療[3-4],盡管近年來其主要治療方式在不斷改進(jìn),肺癌患者的5年生存率有所上升,但仍然僅為18%[5]。由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中,存在分子信號(hào)通路的多樣性[2,6],成為了目前癌癥治療的難點(diǎn)及瓶頸,因此,對(duì)肺癌演變過程中的核心樞紐分子的鑒定,以實(shí)施精準(zhǔn)分子靶向治療改善肺癌患者預(yù)后具有十分重要的臨床價(jià)值。

    酪氨酸3單加氧酶/色氨酸5單加氧酶激活蛋白zeta(也稱YWHAZ或14-3-3ζ),屬于14-3-3蛋白家族,位于人類8號(hào)染色體上,由YWHAZ miRNA編碼的一種蛋白質(zhì),大小28~30 kDa,是腫瘤發(fā)展進(jìn)程中參與調(diào)控多條分子信號(hào)通路的核心蛋白[7]。研究表明,YWHAZ是許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中樞蛋白,與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、粘附和自噬等相關(guān)蛋白相互作用[8]。

    本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)的方法,首先在多種癌癥類型中檢測(cè)YWHAZ的表達(dá)水平,然后重點(diǎn)在非小細(xì)胞肺癌及其癌旁組織中檢測(cè)YWHAZ的表達(dá)水平。我們還分析了非小細(xì)胞肺癌中YWHAZ的表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)。本研究旨在提高YWHAZ在非小細(xì)胞肺癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 臨床標(biāo)本 收集2018年1月至2020年8月遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治后經(jīng)手術(shù)切除的137例多種類型癌癥組織。其中非小細(xì)胞肺癌38例,均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診為NSCLC。在38例非小細(xì)胞肺癌中,男18例,女20例;肺腺癌31例,肺鱗癌7例;年齡43~86歲,中位年齡59.5歲;臨床分期:Ⅰ~Ⅱ期19例,Ⅲ~Ⅳ期19例;有明確淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移17例,病理學(xué)活檢對(duì)所有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞來源進(jìn)行判斷。所有標(biāo)本在收集前其患者暫未接受放療及化療。本研究通過遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,編號(hào):倫審(2020)-70號(hào)。

    1.2 臨床組織芯片 所使用的組織芯片購自武漢愛威爾生物科技有限責(zé)任公司,芯片編號(hào)為L(zhǎng)AC1402,點(diǎn)直徑為1.5mm,該芯片包含35例非小細(xì)胞肺癌組織和35例配對(duì)的癌旁肺組織,以及患者的臨床病理資料,包括患者年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、TNM分期等。

    1.3 免疫組織化學(xué)染色試劑 兔抗人YWHAZ抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;山羊抗兔IgG、10%正常羊血清、蘇木精、抗原修復(fù)液及顯色試劑均購自上?;蚩萍加邢薰荆?%過氧化氫、無水乙醇、二甲苯均購自南昌雨露公司;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)按說明書自行配制。

    1.4 免疫組織化學(xué) 二甲苯對(duì)組織切片脫蠟、過梯度酒精后PBS洗滌,內(nèi)源性過氧化物酶被3%過氧化氫封閉,抗原修復(fù)液在高溫及高壓條件下修復(fù)抗原3 min,自然冷卻至室溫,用10%正常羊血清室溫進(jìn)行封閉,半小時(shí)后用YWHAZ抗體在室溫孵育3 h,PBS洗滌3次,用山羊抗兔IgG在37 ℃恒溫箱中孵育0.5 h,PBS洗滌3次,用 DAB顯色劑進(jìn)行顯示處理,復(fù)染用蘇木精,再經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明,用中性樹脂進(jìn)行封片,在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。YWHAZ的染色評(píng)估,采用Image-Pro Puls軟件對(duì)染色效果統(tǒng)計(jì)評(píng)分,根據(jù)細(xì)胞的染色范圍(<5%為0分;6%~25%為1分;26%~50%為2分;51%~75%為3分;>75%為4分)和染色的強(qiáng)度(陰性為0分;弱陽性為1分;中等陽性為2分;強(qiáng)陽性為3分)評(píng)分,最終分?jǐn)?shù)為染色范圍分?jǐn)?shù)乘以染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)。病例被分為低表達(dá)組(0~6分)和高表達(dá)組(6分以上)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 YWHAZ在多種腫瘤中的表達(dá) 為了評(píng)估YWHAZ在腫瘤中的表達(dá)情況,本研究對(duì)137例多種癌癥類型的臨床標(biāo)本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示,YWHAZ在每種癌癥中均有表達(dá),主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜(見圖1)。我們分析了其總體陽性表達(dá)率達(dá)到94.2%(129/137),其中,肺癌的陽性表達(dá)率高達(dá)96.4%(27/28),甲狀腺癌陽性表達(dá)率為100%(28/28),乳腺癌陽性表達(dá)率為100%(18/18),胃癌陽性表達(dá)率為100%(6/6),結(jié)、直腸癌陽性表達(dá)率為92.8%(13/14),肝癌陽性表達(dá)率為100%(3/3),泌尿系統(tǒng)癌陽性表達(dá)率為100%(4/4),女性生殖系統(tǒng)癌陽性表達(dá)率為87.5%(14/16),淋巴瘤陽性表達(dá)率為66.7%(6/9),其他類型癌陽性表達(dá)率為90.9%(10/11),見表1、圖1。

    表1 YWHAZ在多種類型癌癥中的表達(dá)率

    2.2 YWHAZ在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁肺組織中的表達(dá) 將收集的73例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本(38例術(shù)中標(biāo)本及35例組織芯片標(biāo)本)和36例癌旁肺組織標(biāo)本,其中肺腺癌50例,肺鱗癌23例,用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了其中YWHAZ的表達(dá)。結(jié)果顯示,YWHAZ主要表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜,呈狀棕黃色或棕褐色區(qū),與癌旁肺組織相比,在肺腺癌組織及肺鱗癌組織中都觀察到Y(jié)WHAZ的表達(dá)水平增加(見圖2)。在肺腺癌組織中,YWHAZ高表達(dá)率54%(27/50),在肺鱗癌組織中,YWHAZ高表達(dá)率78.2%(18/23),在癌旁肺組織中高表達(dá)率16.7%(6/36),肺腺癌和肺鱗癌的高表達(dá)率均高于癌旁肺組織(P<0.001,見表2)。

    表2 YWHAZ在非小細(xì)胞肺癌及其癌旁組織中的表達(dá)

    A:肺鱗癌癌旁組織;B:肺腺癌癌旁組織;C:肺鱗癌低表達(dá);D:肺腺癌低表達(dá);E:肺鱗癌高表達(dá);F:肺腺癌高表達(dá);×400。

    2.3 YWHAZ的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征之間的差異 為了評(píng)價(jià)YWHAZ在非小細(xì)胞肺癌病例中的臨床意義,將73例非小細(xì)胞肺癌組織中YWHAZ的高低表達(dá)與患者的臨床病理特征之間的差異采用χ2檢驗(yàn)分析(見表3)。73例非小細(xì)胞肺癌患者,腫瘤長(zhǎng)徑的中位數(shù)為4 cm。本實(shí)驗(yàn)觀察到Y(jié)WHAZ的高表達(dá)與患者的腫瘤大小(P=0.001)、臨床分期(P<0.001)以及轉(zhuǎn)移(P<0.001)之間的差異有顯著性,與患者的年齡、性別、吸煙史均無顯著差異(P>0.05)。

    3 討論

    2021年全球高發(fā)病率的癌癥中,包含了結(jié)直腸癌、肺癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、膀胱癌、腎癌、宮頸癌、肝癌、乳腺癌[9]。目前對(duì)高發(fā)癌癥類型的靶向基因研究是當(dāng)下腫瘤研究的熱點(diǎn)。本研究收集的137例臨床組織標(biāo)本包含了這十類高發(fā)癌癥類型,通過免疫組織化學(xué)染色分析,我們發(fā)現(xiàn),YWHAZ在多種癌癥中均呈陽性表達(dá),且平均陽性表達(dá)率高達(dá)94.2%。已有研究表明,YWHAZ的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等多種癌癥中均顯著上調(diào),參與腫瘤細(xì)胞的多種細(xì)胞活動(dòng)[10-13],我們的研究結(jié)果與上述研究一致,提示把YWHAZ作為人類癌癥診斷的靶點(diǎn)分子可能具有潛在臨床意義。我們還發(fā)現(xiàn),無論是在男性或女性中都高發(fā)的肺癌,YWHAZ的陽性染色率高達(dá)96.4%,高于94.2%的平均水平,表明YWHAZ在肺癌中可能更具研究?jī)r(jià)值。

    YWHAZ已被證明在多種癌癥中經(jīng)常被上調(diào)并通過調(diào)節(jié)癌癥中的多種信號(hào)通路發(fā)揮致癌基因的作用[7]。在肺癌中,有研究發(fā)現(xiàn),與30個(gè)非肺癌組織相比,在152個(gè)NSCLC組織中,YWHAZ的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高[14]。YWHAZ在高侵襲性肺癌細(xì)胞株中的mRNA和蛋白表達(dá)均高于低侵襲性肺癌細(xì)胞株[15]。此外,YWHAZ在肺癌的發(fā)展進(jìn)程中可能參與了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[16]。在我們的研究中,通過免疫組織化學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌組織中YWHAZ的陽性表達(dá)水平明顯高于癌旁肺組織,與先前研究結(jié)果一致,已有的研究結(jié)果表明YWHAZ可能是非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵的核心樞紐分子。另外,在分別對(duì)癌旁肺組織、肺腺癌和肺鱗癌中YWHAZ高低表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)中,肺腺癌與肺鱗癌的YWHAZ表達(dá)顯著高于癌旁肺組織。

    細(xì)胞的增殖失控、抗凋亡和轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是腫瘤的惡性生物學(xué)行為,是影響患者預(yù)后的重要因素。已有研究發(fā)現(xiàn),YWHAZ的過表達(dá)可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[13]。在另一項(xiàng)研究中,YWHAZ通過結(jié)合 Par3 可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和轉(zhuǎn)移[17]。在乳腺癌中,YWHAZ敲除可誘導(dǎo)MCF-37細(xì)胞的凋亡[18]。這些研究表明,YWHAZ在腫瘤中起著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮惡性生物學(xué)行為的重要作用。本實(shí)驗(yàn)的73例非小細(xì)胞肺癌病例中,腫瘤直徑≥4cm患者的YWHAZ高表達(dá)率顯著高于腫瘤直徑<4cm的患者,腫瘤臨床分期為晚期患者的YWHAZ高表達(dá)率顯著高于腫瘤臨床分期為早期的患者,發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的YWHAZ高表達(dá)率顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者。提示YWHAZ的高表達(dá)增強(qiáng)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、抗凋亡以及轉(zhuǎn)移能力。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,YWHAZ的表達(dá)增加可能普遍存在于多種腫瘤的發(fā)生過程中。YWHAZ在肺腺癌及肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用,可為肺腺癌及肺鱗癌的臨床靶向治療提供新的思路。

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