蓼子樸核型分析

王波，胡超越

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

蓼子樸(Inula salsoloidesOstenf.)為菊科(Asteraceae)旋覆花屬(Inula)多年生草本植物，在新疆、內(nèi)蒙古、青海東部和北部、甘肅、陜西、河北、山西北部和遼寧西部均有分布。蓼子樸常作為伴生植物出現(xiàn)于沙生系列和鹽生系列過渡的群落中，其可以適應(yīng)于干旱環(huán)境并作為固沙植物，具有一定的藥用價(jià)值［1］。

染色體倍性在植物遺傳育種方面具有重要意義，目前主要有直接鑒定法和間接鑒定法兩種方法［2］。王榮邦等［3］通過對(duì)菊花染色體倍性的研究，指出染色體計(jì)數(shù)法是眾多倍性鑒定方法中最可靠的一種。STEBBINS G L［4］在 1971 年根據(jù)某一物種染色體的長(zhǎng)度比和臂比，將核型分為12種，1A屬于對(duì)稱性最高類型，而4C則屬于對(duì)稱性最低的類型，不同的核型代表著物種的進(jìn)化程度，在分類學(xué)上一般核型是由1A→4C進(jìn)化。每一種生物都具有不同核型，且染色體核型在一定程度上決定物種進(jìn)化歷程，同時(shí)核型是說明種系的最好標(biāo)準(zhǔn)。蓼子樸作為塔里木盆地周邊常見的植物，具有抗旱、抗蟲、抑菌等特點(diǎn)，因此對(duì)蓼子樸的深入研究有可能可以解決沙生植物馴化栽培從而降低沙漠化等生態(tài)問題，為進(jìn)一步確定其進(jìn)化程度及遺傳工程等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

塔里木盆地周邊的蓼子樸于野外取樣，水培后獲得新根根尖備用。蓼子樸取材有兩個(gè)環(huán)境相似的地點(diǎn)，分別為新疆維吾爾自治區(qū)阿拉爾市迎賓路安然國(guó)墓園（40°30'41.90"N，81°17'23.73"E）和南口農(nóng)場(chǎng)加工廠（40°30'37.83"N，81°18'11.76"E）。

1.2 方法

1.2.1 藥品配制

霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液：稱取霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液1.936 g于1 L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解并分裝，115℃高壓滅菌30 min后備用。

卡諾固定液配方：無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液：稱取0.29 g 8-羥基喹啉加入蒸餾水定容至1 000 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1%秋水仙素溶液：稱取1 g秋水仙素粉末溶于少量無水乙醇，加蒸餾水定容至100 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2%纖維素酶：稱取0.4 g纖維素酶粉末溶于20 mL蒸餾水，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2%果膠酶：稱取0.4 g纖維素酶粉末溶于20 mL蒸餾水，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

醋酸洋紅：量取45 mL冰醋酸，加入55 mL蒸餾水，煮沸后緩慢加入1 g洋紅，攪拌均勻后加入1顆鐵銹釘，煮沸10 min冷卻后過濾并貯存在棕色瓶?jī)?nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

龍膽紫：量取30 mL冰醋酸加熱到40℃，加入0.75 g龍膽紫，溶解后加入70 mL蒸餾水，過濾后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

希夫試劑：稱取0.5 g堿性品紅溶于100 mL熱蒸餾水中，待溶液冷卻至50℃時(shí)過濾，再冷卻到25℃時(shí)加入1 mol/L的鹽酸10 mL和1 g亞硫酸氫鈉(NaHSO3)，放置暗處?kù)o置24 h后，加0.25～0.50 g活性炭搖蕩1 min后過濾，溶液呈無色，裝入棕色瓶中塞緊瓶塞，保存于冰箱內(nèi)(0～4℃)備用。

1.2.2 水培蓼子樸

植物根尖的獲取有扦插取材、水培取材、種子萌發(fā)取材等方法［5］。本試驗(yàn)則采用水培的方法，從野外挖取長(zhǎng)勢(shì)良好的蓼子樸，用黑色塑料袋包裹、保持水分，拿回室內(nèi)用自來水洗凈根部，用遮光的容器進(jìn)行水培［6］。培養(yǎng)大約7 d，當(dāng)蓼子樸的新根長(zhǎng)出2～5 cm時(shí)，切取長(zhǎng)勢(shì)良好的根尖備用。

1.2.3 染色體制片

不同植物有絲分裂最旺盛的時(shí)間可能不同，一般植物有絲分裂最旺盛的時(shí)間大約在11：00［7］。本試驗(yàn)選取10：00、11：00、12：00、13：00 這4個(gè)時(shí)間段進(jìn)行制片觀察，以確定有絲分裂最旺盛的時(shí)間。

預(yù)處理及固定。本試驗(yàn)設(shè)置4種預(yù)處理方法：低溫預(yù)處理（將蓼子樸根尖放在4℃冰箱冷藏過夜）；秋水仙素處理（1 g/L秋水仙素溶液，處理2～3 h）；8-羥基喹啉處理（0.002 mol/L的8-羥基喹啉溶液，處理4～5 h）；秋水仙素和8-羥基喹啉協(xié)同預(yù)處理（秋水仙素處理2 h后再使用8-羥基喹啉處理4 h）。預(yù)處理后的根尖使用卡諾固定液固定24 h，經(jīng)不同濃度的酒精梯度處理，于70%酒精中保存?zhèn)溆谩?/p>

解離使用酸解和酶解兩種方法。酸解：將根尖置于小試管內(nèi)，加入1 mol/L鹽酸溶液沒過根尖進(jìn)行處理，并置于60℃水浴中分別解離7 min、9 min、11 min篩選最佳解離時(shí)間，解離后的根尖用蒸餾水沖洗數(shù)次（每次蒸餾水停留30～60 s）至無鹽酸殘留，再置于蒸餾水中備用。酶解：將根尖放入小試管中，加入2%纖維素酶和果膠酶混合液在37℃進(jìn)行解離，分別解離0.5 h、1 h、1.5 h，篩選最佳解離時(shí)間，解離后的根尖用蒸餾水清洗備用［8］。

染色體制片方法。在試驗(yàn)過程中選用了3種染色劑比較染色。龍膽紫或醋酸洋紅制片法：十字壓片法制片后，打開兩個(gè)載玻片、材料面朝上、迅速滴1滴龍膽紫（或醋酸洋紅）染色3～5 min后，蓋片觀察［9］；孚爾根染色體制片：取根尖放入小離心管，避光染色大約0.5 h，再加入漂洗液洗掉多余染液，切取蓼子樸根尖紫紅色部位，并使用45%醋酸溶液進(jìn)行蓋片觀察［10］。

1.3 核型分析

1.3.1 統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目

在低倍鏡下找到染色清晰、染色體無重疊的細(xì)胞，再用100倍油鏡觀察，并使用NIS-Elements viewer軟件進(jìn)行拍照和圖片初步處理。在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)蓼子樸形態(tài)數(shù)目清晰的30個(gè)有絲分裂中期細(xì)胞的染色體，進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

1.3.2 繪制核型模式圖

使用 Photoshop CC(2015.0.0版)處理圖片［11］；CorelDRAW X7(17.6.0.1021版)處理制作矢量圖片并進(jìn)行測(cè)量［12］。

選擇染色體數(shù)目和形態(tài)清晰的細(xì)胞。使用CorelDRAW X7平行度量工具和Adobe Photoshop C C標(biāo)尺工具對(duì)染色體的長(zhǎng)臂、短臂以及總長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，所獲得的數(shù)據(jù)使用Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行分析；用Photoshop軟件摳圖，整理成為染色體形態(tài)圖［13］。核型模式圖的繪制需要借助Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行，主要過程如下：?jiǎn)卧窀袷皆O(shè)定、插入并調(diào)整圖表橫縱坐標(biāo)、圖表格式的設(shè)定［14-15］。

1.3.3 染色體和核型分類的綜合描述

參考KUO S R等［16］研究方法整理得到染色體分類表（如表1），染色體核型分類表（如表2）。

表1 染色體分類表

表2 Stebbins G L（1971）核型分類表

2 結(jié)果與分析

2.1 蓼子樸的水培根尖形態(tài)

塔里木盆地周邊的蓼子樸于野外取樣，帶回室內(nèi)進(jìn)行水培。如圖1所示，從左至右水培時(shí)間依次為水培7 d（圖1a）、14 d（圖1b）、30 d（圖1c）的效果，觀察到將蓼子樸培養(yǎng)7 d后可以長(zhǎng)出新根，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，蓼子樸的新根也越細(xì)并且越多。培養(yǎng)14 d的蓼子樸，新生根較粗較多，易于染色體制片，因此培養(yǎng)14 d的蓼子樸根尖最適用于核型分析。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間蓼子樸的水培根尖形態(tài)

2.2 制片方法篩選

2.2.1 有絲分裂最旺盛時(shí)間的篩選

如圖2所示，發(fā)現(xiàn)12：00（圖2c）取材的根尖分裂能力較強(qiáng)，含有較多分裂期的細(xì)胞，因此后續(xù)試驗(yàn)材料均在12：00時(shí)進(jìn)行預(yù)處理和固定。

圖2 不同取材時(shí)間染色體制片效果分析

2.2.2 預(yù)處理方法篩選

4種預(yù)處理方法效果如圖3所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8-羥基喹啉單獨(dú)預(yù)處理時(shí)的效果最佳，細(xì)胞分散程度很高，背景清晰而且中期染色體較多（圖3a）。秋水仙素預(yù)處理效果次之，后續(xù)試驗(yàn)采用8-羥基喹啉單獨(dú)預(yù)處理的方式進(jìn)行。

圖3 不同預(yù)處理方法篩選

2.2.3 蓼子樸根尖細(xì)胞解離時(shí)間篩選

酸解效果如圖4所示，結(jié)果表明解離9 min的蓼子樸新根根尖效果最佳（圖4b）；而解離7 min的蓼子樸根尖細(xì)胞分散度不夠高、細(xì)胞聚集在一起（圖4a）；解離11 min的根尖細(xì)胞過于分散，一個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量很少（圖4c）。

圖4 蓼子樸根尖細(xì)胞酸解效果圖

酶解效果如圖5所示，分別為酶解0.5 h(圖5a)、酶解1 h(圖5b)、酶解1.5 h(圖5c)、酶解0.5 h后再使用鹽酸室溫解離10 min(圖5d)效果，由此可知單獨(dú)酶解1 h的效果最好，而酸解、酶解共同使用的效果次之。綜合分析，由于酸解時(shí)間為9 min時(shí)解離效果好，后續(xù)試驗(yàn)均采用酸解9 min進(jìn)行染色體制片。

圖5 蓼子樸根尖細(xì)胞酶解效果圖

2.2.4 染色劑篩選

不同染色劑的效果如圖6所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)希夫試劑染色效果較好，背景清晰，對(duì)細(xì)胞核著色能力很強(qiáng)，但染色時(shí)間較長(zhǎng)，且需要避光進(jìn)行（圖6a）；醋酸洋紅染色僅需要3～5 min，一般情況下，經(jīng)過醋酸洋紅染色的細(xì)胞分散程度都比較好，但對(duì)染色體的著色能力卻比較低（圖6b）；龍膽紫染色液的效果較為理想，該染色劑對(duì)染色體親和能力很高，經(jīng)過染色后可以清晰地分辨染色體的數(shù)目和形態(tài)（圖6c）。綜上所述，龍膽紫為本試驗(yàn)染色體染色的最佳染色劑。

圖6 不同染色劑對(duì)根尖細(xì)胞染色效果圖

2.3 染色體數(shù)目及形態(tài)特征

經(jīng)大量試驗(yàn)后，挑選細(xì)胞分散度高、染色體數(shù)目清晰的圖片，至少統(tǒng)計(jì)30個(gè)含清晰有絲分裂中期細(xì)胞的染色體。通過分析染色體的數(shù)目，基本確定塔里木盆地周邊的蓼子樸染色體數(shù)目為2n=2x=16（如圖7，箭頭指示隨體）。

圖7 蓼子樸染色體圖(100×油鏡觀察)

2.4 染色體相對(duì)長(zhǎng)度及核型分析

通過對(duì)5張清晰的蓼子樸染色體圖片的測(cè)量分析、配對(duì)，并繪制核型模式圖，染色體參數(shù)如圖8、表3所示。

表3 蓼子樸染色體參數(shù)表

圖8 蓼子樸染色體形態(tài)圖及核型模式圖

按KUO S R等［16］分類標(biāo)準(zhǔn)，蓼子樸染色體可分為4種不同類型：第1對(duì)和第2對(duì)染色體為長(zhǎng)染色體組（L）、第3對(duì)染色體屬于中長(zhǎng)染色體組（M2）、第4對(duì)和第5對(duì)以及第6對(duì)染色體屬于中短染色體組（M1）、第7對(duì)和第8對(duì)染色體為短染色體組（S），蓼子樸染色體的相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=16=4L+2M2+6M1+4S。

按照 LEVAN 等［17］（表 1）分類標(biāo)準(zhǔn)，核型公式為K(2n)=2x=16=14m(2SAT)+2sm，在16條染色體中有14條中著絲粒染色體（m），2條近中著絲粒染色體(sm)，第1對(duì)染色體上有隨體存在。最長(zhǎng)染色體與最短染色體的比值為2.41，臂比值范圍在1.07～2.88之間，12.5%的染色體臂比值大于2，在核型分類上屬于2B，核型不對(duì)稱系數(shù)（AS.K%）為53.94%。

3 討論

核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型，包括染色體數(shù)目、大小及形態(tài)特征的總和，不同植物具有不同的核型特征，對(duì)某一物種進(jìn)行核型分析則有利于該種的分類研究與進(jìn)化分析［19-20］。根據(jù)STEBBINS G L［4］的核型進(jìn)化理論，蓼子樸屬于由對(duì)稱向不對(duì)稱過渡的核型，在進(jìn)化上較為原始，這也與蓼子樸常作為伴生成分出現(xiàn)于沙生系列和鹽生系列過渡群落中的特征相吻合。本試驗(yàn)結(jié)果得到蓼子樸為二倍體核型，這一結(jié)果可能為蓼子樸通過遺傳學(xué)的方法改變倍性來完成馴化提供理論依據(jù)。前人研究表明，對(duì)稱性核型向不對(duì)稱性核型發(fā)展是植物界核型進(jìn)化的基本趨勢(shì)，而臂比值與核不對(duì)稱系數(shù)能夠反映植物的進(jìn)化程度，本研究發(fā)現(xiàn)，蓼子樸核型不對(duì)稱系數(shù)為53.94%，表明蓼子樸核不對(duì)稱性較小、進(jìn)化程度較低。另外，蓼子樸染色體類型由m和sm兩種組成，且大多數(shù)染色體類型為m，可以看出大部分染色體的著絲點(diǎn)集中在中部區(qū)域，反映了蓼子樸的染色體比較明顯的表型特征。

本試驗(yàn)蓼子樸群落核型一致，但并未觀測(cè)到清晰的減數(shù)分裂期細(xì)胞，染色體的倍性還需要進(jìn)一步確認(rèn)。在CCDB數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)旋覆花屬植物染色體有較多的報(bào)道［21］，這些植物存在單倍體和二倍體兩種倍性，且有近一半的物種具有16條染色體，除染色體基數(shù)為9的物種是單倍體外，其余物種均為二倍體，因此旋覆花屬植物在染色體水平上的演化可能是以二倍體為主的。本試驗(yàn)雖然獲得了較多清晰的含中期染色體的圖片，但能分辨染色體縊痕和隨體等的圖片較少，要獲得更多蓼子樸染色體形態(tài)特征，還需要更多的研究或輔以其它染色體分析技術(shù)，比如染色體帶型分析和減數(shù)分裂制片以及植物染色體的銀染技術(shù)等［22-24］。蓼子樸分布廣泛，大多生長(zhǎng)在比較干旱、高鹽堿的環(huán)境中，分析確定蓼子樸的核型和染色體數(shù)目，有助于為闡明蓼子樸對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)性研究奠定基礎(chǔ)。本研究旨在為蓼子樸提供更多的染色體數(shù)據(jù)和核型特征，為進(jìn)一步的研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

在蓼子樸前期的培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)水培大約14 d的根尖最適合進(jìn)行染色體制片。對(duì)蓼子樸進(jìn)行染色體制片，結(jié)果表明在其他條件一致的情況下，發(fā)現(xiàn)8-羥基喹啉單獨(dú)預(yù)處理時(shí)的效果最佳，細(xì)胞分散程度很高，背景清晰而且中期染色體較多；龍膽紫染色液的效果較為理想，該染色劑對(duì)染色體親和能力很高，經(jīng)過染色后可以清晰地分辨染色體的數(shù)目和形態(tài)。通過對(duì)蓼子樸進(jìn)行核型分析，結(jié)果表明蓼子樸染色體數(shù)目是2n=2x=16，染色體相對(duì)長(zhǎng)度由2n=16=4L+2M2+6M1+4S組成，蓼子樸核型公式為K(2n)=2x=16=14m(2SAT)+2sm，最長(zhǎng)染色體與最短染色體的比值為2.41，臂比值大小在1.07～2.88之間，12.5%的染色體臂比值大于2，在核型分類上屬于2B，且核型不對(duì)稱系數(shù)（AS.K%）為53.94%。對(duì)蓼子樸進(jìn)行核型分析以確定其倍性、染色體數(shù)目等核型特征，為進(jìn)一步確定其進(jìn)化程度及遺傳工程等奠定理論基礎(chǔ)。