呼吸道感染病原體檢測技術(shù)與發(fā)展趨勢

陳舒影， 余方友

呼吸道感染是指由多種病原微生物包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、寄生蟲等引起的感染性疾病。呼吸道感染分為上呼吸道感染和下呼吸道感染。上呼吸道感染主要由病毒引起，占70%～80%，包括鼻病毒、冠狀病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯薩奇病毒等。上呼吸道感染一般起病急、病程短，通常自限且預(yù)后良好。下呼吸道感染包括社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)、醫(yī)院獲得性肺炎(hospital-acquired pneumonia，HAP)、支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎和氣管炎，病原體主要為細(xì)菌、支原體、衣原體、病毒。下呼吸道感染多表現(xiàn)為重癥，死亡率高、預(yù)后差。2019年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)公布的全球主要死亡原因中就包括了呼吸道感染，下呼吸道感染仍然是世界上病死率最高的感染性疾病之一，排在主要死亡原因的第四位[1]。美國的一項研究表明，盡管進(jìn)行了全面的診斷工作，但高達(dá)62%的CAP的病因仍未得到明確[2]。在沒有明確的病原微生物學(xué)診斷情況下，對嚴(yán)重的下呼吸道感染患者通常在最初的治療中會使用經(jīng)驗性的廣譜抗菌藥物來緩解癥狀。一旦確定病原體，臨床醫(yī)師應(yīng)調(diào)整或停止這種經(jīng)驗性治療[3-4]。但是，在患者反應(yīng)良好或沒有檢測到導(dǎo)致感染的病原體時，臨床醫(yī)師則通常會繼續(xù)進(jìn)行經(jīng)驗性治療，最終導(dǎo)致廣譜抗菌藥物的濫用。此外，在沒有微生物病原學(xué)檢查的情況下，臨床醫(yī)師可能會錯誤地將癥狀歸類為非感染性炎癥反應(yīng)，并經(jīng)驗性使用激素類藥物治療，這可能會導(dǎo)致再次感染[5]。在我國，與醫(yī)院相關(guān)的感染中，呼吸道感染，特別是下呼吸道感染是院內(nèi)感染的主要類型[6]。因此，快速、準(zhǔn)確地識別病原體可以進(jìn)行精準(zhǔn)治療，減少廣譜抗菌藥物的濫用和院內(nèi)感染的傳播，并促進(jìn)患者康復(fù)。

1 傳統(tǒng)的檢測方法

病原體的培養(yǎng)作為呼吸道病原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，特異性高、成本低，但對于一些難以培養(yǎng)的病原體(如病毒、衣原體)來說，時效性和敏感性較差[7]。因此這些病原體的分離培養(yǎng)不適用于常規(guī)檢測。涂片檢測的優(yōu)點是快速、直觀、成本低，臨床易于開展，但缺點是敏感性偏低，并且非常依賴于檢驗工作人員的經(jīng)驗。免疫學(xué)檢測是通過血清學(xué)來檢測抗原和(或)抗體的檢測方法。在疾病早期，抗原檢測的診斷價值較好，可以通過直接免疫熒光法或間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)、免疫層析法檢測病原體的抗原蛋白。病原體抗原檢測的特異性強(qiáng)，但敏感性偏低。在疾病的中后期，隨著特異性抗體[免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)]的產(chǎn)生，抗體的檢測為疾病的發(fā)展和預(yù)后提供了重要的線索。臨床上已開展9項呼吸道病原體抗體聯(lián)檢項目，其原理是用IFA檢測9種呼吸道感染常見病原體的IgM抗體，包括嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒。免疫學(xué)檢測操作簡便、成本低，缺點是敏感性低、易漏檢，存在窗口期。

2 分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地識別病原體并及時診斷感染性疾病，與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、涂片檢測和免疫學(xué)檢測等方法學(xué)相比有著明顯的優(yōu)勢。對于難以分離培養(yǎng)的病毒，可以培養(yǎng)但是生長緩慢的結(jié)核分枝桿菌、軍團(tuán)菌以及一些不能常規(guī)培養(yǎng)的呼吸道病原體來說，分子生物學(xué)技術(shù)具有絕對的優(yōu)勢。基于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的核酸檢測方法多樣，其中實時熒光定量PCR法因其可靠性和重復(fù)性好，已廣泛用于流感、結(jié)核病等呼吸系統(tǒng)疾病的診斷。此外，基于等溫擴(kuò)增的快速核酸檢測技術(shù)以及可以同時檢測所有病原體的宏基因組二代測序技術(shù)(metagenomics next-generation sequencing,mNGS)近年來發(fā)展迅速，革新了呼吸道感染病原體的檢測時代。由于臨床對核酸檢測的要求越來越高，即快速(越快越好)、現(xiàn)場檢驗(point-of-care testing，POCT)和便攜式，近年來一些便攜式(快速)微生物分子診斷技術(shù)和平臺發(fā)展迅速。目前，便攜式(快速)分子診斷產(chǎn)品已應(yīng)用于病毒檢測，包括呼吸道病毒[流感病毒A/B、呼吸道合胞病毒、新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)]及人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等；同時也應(yīng)用于細(xì)菌及耐藥性檢測方面，包括結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥、常見多重耐藥菌、胃腸道病原體A/B群鏈球菌等。便攜式(快速)分子診斷儀器在呼吸道感染病原體中的應(yīng)用介紹如下。

2.1基于單個靶標(biāo)的分子檢測平臺 首先介紹的是基于GeneXpert快速分子檢測平臺。GeneXpert MTB/RIF是WHO于2010年批準(zhǔn)并推薦的一種用于快速診斷結(jié)核病和利福平耐藥性的分子檢測方法[8]。然而GeneXpert需要實驗室基礎(chǔ)設(shè)施，包括電力供應(yīng)，因此不能用于床旁檢測。GeneXpert Edge/Omni是新一代的檢測平臺，可用于床旁檢測，旨在供基礎(chǔ)設(shè)施有限的醫(yī)療服務(wù)中心使用。GeneXpert Edge/Omni的特點是單模塊設(shè)計、觸摸平板操作、體積小、重量輕、電池供電，單個樣本檢測只需80 min。GeneXpert平臺不僅可以檢測結(jié)核分枝桿菌，還可以檢測艱難梭菌、HIV、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒等[9]。羅氏的Cobas Liat平臺基于實時PCR以及實時逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測DNA或RNA靶標(biāo)，使用特殊的氣壓微流控芯片結(jié)構(gòu)，通過空間溫控大大加快PCR擴(kuò)增過程，檢測時間僅為15～20 min。Cobas Liat平臺可用于A群鏈球菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的快速檢測。盡管在一些技術(shù)方面和可移動性上存在一些限制，但Cobas Liat仍是得到廣泛驗證的便攜式分子儀器[9]。還有雅培的ID Now平臺，與羅氏的Cobas Liat平臺相似，早期也是用于流感的檢測，也可以同時檢測呼吸道合胞病毒和A群鏈球菌。其原理基于Nicking酶擴(kuò)增反應(yīng)技術(shù)和恒溫擴(kuò)增技術(shù)，不需要復(fù)雜的熱循環(huán)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，可在很窄的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行靶標(biāo)的迅速放大，檢測時間僅需5～13 min。ID Now平臺重量輕，體積小，便于攜帶，適用于診所、醫(yī)院急診等多種醫(yī)療場景[10]。POCT快速分子檢測平臺在減少流感的院內(nèi)傳播中起到了很大的作用[11]。同樣，在當(dāng)前全球新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎)疫情的背景下，一些快速的檢測平臺在疫情防控中也發(fā)揮了巨大的作用。出于對疫情防控的要求，多個快速核酸檢測試劑盒通過國家應(yīng)急審批，極大推動了國內(nèi)分子診斷POCT的開發(fā)及應(yīng)用[12]。如優(yōu)思達(dá)Easy NET平臺，最初主要用于檢測結(jié)核分枝桿菌，在新冠肺炎疫情發(fā)生以來，該平臺增加了SARS-CoV-2的檢測功能。采用獨特的交叉引物恒溫擴(kuò)增實時熒光技術(shù)，檢測時間為80～90 min。另外還有圣湘iPonatic平臺、遂真LifeReady 1000系統(tǒng)等，均可用于SARS-CoV-2的快速檢測，并已在多個醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床比對驗證并投入使用。

2.2呼吸道感染多靶標(biāo)檢測系統(tǒng) 多靶標(biāo)檢測系統(tǒng)可以聯(lián)合檢測多項呼吸道病原體，從而提升呼吸道病原精準(zhǔn)鑒別，優(yōu)化和改進(jìn)感染性疾病的精準(zhǔn)治療。臨床上已注冊的聯(lián)合檢測試劑盒有呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒、六項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒、七項呼吸道病毒核酸檢測試劑盒、三項呼吸道病毒核酸檢測試劑盒、13種呼吸道病原體多重檢測等。FilmArray系統(tǒng)是生物梅里埃公司旗下Biofire公司的旗艦產(chǎn)品，與GeneXpert類似，F(xiàn)ilmArray多重PCR系統(tǒng)也集樣品制備、擴(kuò)增、檢測和分析功能于一體，F(xiàn)ilmArray檢測系統(tǒng)是真正的POCT產(chǎn)品，并且是美國食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的呼吸道病原體的多重檢測系統(tǒng)。FilmArray檢測系統(tǒng)可以同時檢測引發(fā)呼吸道感染的20余種病原靶標(biāo)，包括冠狀病毒、流感病毒、副流感病毒、偏肺病毒、鼻病毒、百日咳桿菌、肺炎衣原體、肺炎支原體等，為準(zhǔn)確判斷疾病和及時控制疫情爭取了時間[13]。另外一款FDA批準(zhǔn)的呼吸道病原體的多重檢測系統(tǒng)是eSensor RVP呼吸道病毒檢測系統(tǒng)，可檢測甲型流感病毒的不同亞型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、鼻病毒、腺病毒等14個靶標(biāo)[14]。而GenMark公司的ePlex RPP呼吸道病毒檢測系統(tǒng)檢測的病毒靶標(biāo)與eSensor RVP檢測系統(tǒng)相似，可以檢測包括肺炎衣原體、肺炎支原體在內(nèi)的17個病原體靶標(biāo)[15]。2020年GenMark公司推出了RP2 Panel(The ePlex? SARS-CoV-2 Test)，增加了檢測靶標(biāo)“SARS-CoV-2”。雖未獲FDA批準(zhǔn)，但FDA授權(quán)其可用于緊急使用。VERIGENE系統(tǒng)通過PCR擴(kuò)增結(jié)合納米金顆粒標(biāo)記的探針，與排列在載玻片上的寡核苷酸靶序列進(jìn)行雜交。探針捕獲目標(biāo)片段后，信號隨即放大，從而可用于超靈敏的DNA檢測。該系統(tǒng)已開發(fā)出用于檢測13種病毒和3種細(xì)菌靶標(biāo)的多重呼吸道檢測組合且正在申請F(tuán)DA的認(rèn)證。現(xiàn)有的便攜式診斷技術(shù)產(chǎn)品各自具有不同的優(yōu)點和不足，或注重可移動性和環(huán)境適應(yīng)性，或強(qiáng)調(diào)快速、短時間獲得結(jié)果，或側(cè)重高通量多靶標(biāo)檢測。不同特性的產(chǎn)品適合不同的場景。然而需要意識到，在成本控制和質(zhì)量控制方面仍存在諸多挑戰(zhàn)，未來需要更多的性能驗證、臨床應(yīng)用評價以及衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)評估，支持便攜式分子診斷技術(shù)產(chǎn)品性能的持續(xù)創(chuàng)新和持續(xù)優(yōu)化。

3 呼吸道傳染病病原體快速檢測新技術(shù)

3.1mNGS mNGS能夠不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，無偏倚性提取標(biāo)本中全部的核酸進(jìn)行高通量測序，通過生物信息分析，去除人源序列后，其余序列與病原數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得疑似致病微生物的種屬信息，因而在急危重癥、疑難及混合感染診斷方面具有明顯的優(yōu)勢[16]。近年來，在呼吸系統(tǒng)感染診斷方面，mNGS愈加廣泛地應(yīng)用于病原體物種的鑒定、呼吸道微生物群分析、人類宿主反應(yīng)分析、耐藥基因研究等[17]。mNGS對呼吸道感染病原體的檢測覆蓋面廣、信息量大，對呼吸道病原體的早期發(fā)現(xiàn)，特別是新發(fā)傳染病病原體的快速診斷中，起到非常重要的作用，如對SARS-CoV-2的認(rèn)知和檢測[18]。支氣管肺泡灌洗液樣本的mNGS可為肺部感染提供更準(zhǔn)確的診斷信息，并顯示不同基礎(chǔ)疾病中呼吸道微生物群的變化[19]。mNGS具有準(zhǔn)確性和可靠性高、可提供大量的生物信息、對未知病原確認(rèn)快、周轉(zhuǎn)時間短等優(yōu)點，因此，mNGS是解決呼吸道感染問題的重要手段，在臨床實踐中被廣泛接受[20]。但是由于mNGS檢測費用高、人類及外源微生物核酸序列的干擾以及潛在的新耐藥基因或突變，故不能取代表型藥敏試驗。此外，高通量測序結(jié)果的分析至關(guān)重要，雖然國內(nèi)已有mNGS用于檢測呼吸道病原體的專家共識[21]，但mNGS結(jié)果與臨床相關(guān)性的解釋仍然是難點。mNGS往往檢出多種微生物，如何判斷病原菌與定植菌以及是否為混合感染，需要結(jié)合mNGS參數(shù)、臨床表現(xiàn)、炎癥指標(biāo)、微生物特點、常規(guī)培養(yǎng)等綜合考慮。

3.2基于規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)的核酸檢測技術(shù) CRISPR/CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR associated protein，Cas)能夠識別高度特異的核酸序列，通過聯(lián)合高靈敏小型生物傳感器運用于感染性疾病中?；贑RISPR/Cas技術(shù)發(fā)展的分子檢測方法具有快速、靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)等特點，在病原體檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速。目前用于呼吸道病原體檢測的主要有CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13等系統(tǒng)。張鋒團(tuán)隊開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術(shù)，為SARS-CoV-2提供了快速準(zhǔn)確的診斷方法[22]。其原理是當(dāng)Cas13酶與設(shè)計合成的SARS-CoV-2靶病毒RNA結(jié)合時，Cas13酶激活RNA酶切割活性，導(dǎo)致RNA傳感器降解，并產(chǎn)生熒光信號，從而能夠檢測到該病毒。該技術(shù)最后需要將試紙條浸入反應(yīng)體系中，通過辨識條帶位置的不同來確認(rèn)是否感染SARS-CoV-2[23]。另外，一項包括肺結(jié)核病和肺外結(jié)核病病例的隊列研究顯示，在結(jié)核病診斷應(yīng)用中，CRISPR-MTB檢測比培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF具有更好的診斷性能，成為一種新的肺結(jié)核病和肺外結(jié)核病診斷技術(shù)[24]。CRISPR的核酸檢測技術(shù)的缺點包括：(1)離子水平、溫度、pH值等諸多因素可能會干擾系統(tǒng)中Cas效應(yīng)蛋白的切割活性，影響檢測結(jié)果的可靠性；(2)難以進(jìn)行病原體的核酸定量分析，適合病原體的核酸定性分析；(3)采集信號的方法受限，且多個檢測步驟之間可能存在互相干擾和交叉反應(yīng)；(4)受到待測樣本中病原體靶標(biāo)濃度的限制，通常CRISPR檢測方法仍需結(jié)合核酸擴(kuò)增技術(shù)。

3.3三代測序技術(shù)[基于納米孔(nanopore)] 又稱納米孔單分子測序技術(shù)，核心就是利用一個納米孔，孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭，將納米孔蛋白固定在電阻膜上后，再利用動力蛋白牽引核酸穿過納米孔。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個堿基通過。4種堿基(A/T/C/G)帶電性質(zhì)不一樣，因此不同堿基通過蛋白納米孔時對電流產(chǎn)生的干擾不同，通過實時監(jiān)測并解碼這些電流信號便可確定堿基序列，從而實現(xiàn)測序[25]。納米孔測序技術(shù)可實現(xiàn)細(xì)菌性下呼吸道感染的快速臨床診斷，在6 h內(nèi)即可鑒定出病原菌和耐藥基因，有助于減少廣譜抗生素的使用[26]。納米孔測序還可以同時檢測甲型流感和其他呼吸道病毒，識別耐藥突變、表征遺傳多樣性以及發(fā)現(xiàn)潛在的院內(nèi)傳播事件[27]。英國牛津納米孔技術(shù)公司(Oxford Nanopore Technology，ONT)的Minion測序儀依靠使用納米孔進(jìn)行測序，是一種手持便攜式設(shè)備，無需ONT技術(shù)人員即可在任何地方安裝。因此，Minion手持測序儀是一種有吸引力的快速和現(xiàn)場檢測的替代技術(shù)。此外，ARTIC與ONT公司攜手合作，利用納米孔實時傳遞數(shù)據(jù)的優(yōu)勢，共同開發(fā)出8 h端到端的快速工作流，利用這項技術(shù)對包括埃博拉、流感和SARS-CoV-2在內(nèi)的RNA病毒進(jìn)行測序[28]。該技術(shù)的缺點是存在等位基因變異體難以區(qū)分、基因型與表型不一致等弊端，正在研發(fā)和完善中。

3.4基因芯片技術(shù) 又稱DNA微陣列，基因芯片技術(shù)的核心是雜交測序，原理是將一組已知序列的核酸探針固定于基質(zhì)材料(如玻片、硅片、尼龍膜、微型磁珠等)，然后與待分析標(biāo)記的樣品雜交，標(biāo)記的樣品通過與基因芯片上已知堿基序列的核酸片段互補(bǔ)雜交，通過分析熒光強(qiáng)度從而得到樣品的遺傳信息，確定樣品的核酸序列，或?qū)虮磉_(dá)量及其特性進(jìn)行分析。基因芯片技術(shù)是多種學(xué)科交叉的產(chǎn)物，是生物芯片的一種，也是生物芯片技術(shù)中發(fā)展最成熟、最先進(jìn)入應(yīng)用和實現(xiàn)商品化的技術(shù)。一項基因芯片技術(shù)在基層結(jié)核病實驗室的大規(guī)模評估研究表明，基因芯片檢測技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥和異煙肼耐藥具有較高的敏感性和特異性。筆者推薦在實驗室條件允許的情況下，基因芯片技術(shù)可作為利福平和異煙肼常規(guī)傳統(tǒng)藥敏試驗的一種更有效、快速、安全和經(jīng)濟(jì)的替代方法，是一種值得在我國基層實驗室推廣使用的方法[29]。傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)存在檢測靈敏度低、操作步驟繁瑣、易污染等缺點，我國研究者研制出了一種新的納米金復(fù)合底物Nanogold-DAB，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)能夠直接催化此復(fù)合底物反應(yīng)導(dǎo)致大量納米金顆粒特異沉積，從而建立了一種基于生物芯片的納米金復(fù)合底物的高靈敏、可視化檢測方法。同時，創(chuàng)新設(shè)計全封閉防污染芯片結(jié)構(gòu)，成功研制了全新的自動化生物芯片檢測儀，實現(xiàn)了擴(kuò)增、雜交、檢測和分析一體化?；诳梢暬镄酒夹g(shù)研制的流感病毒分型基因芯片獲得了首個可視化生物芯片產(chǎn)品的注冊證書。此外，有研究展示了一種全印刷納米光子生物芯片，該技術(shù)結(jié)合集成芯片和光子晶體納米結(jié)構(gòu)增強(qiáng)熒光的特點，可以在10 min內(nèi)對SARS-CoV-2的N蛋白進(jìn)行快速床旁檢測。隨著納米光子結(jié)構(gòu)和理論的進(jìn)一步探索，以及印刷技術(shù)的不斷改進(jìn)，納米光子生物芯片將發(fā)展成為一種便攜式、低成本、高效的檢測方法，用于微量樣品中生物標(biāo)志物的POCT檢測[30]。

4 總結(jié)與展望

傳統(tǒng)呼吸道病原體檢測手段如培養(yǎng)、涂片因敏感性和時效性差，常導(dǎo)致臨床診斷和治療用藥難。呼吸道感染多聯(lián)檢產(chǎn)品時效性高，可及早識別感染，并指導(dǎo)抗感染藥物的合理使用。各種便攜式(快速)診斷技術(shù)產(chǎn)品發(fā)展迅速，臨床應(yīng)用前景廣闊，適用于診所、醫(yī)院急診等多種醫(yī)療場所，但是仍需進(jìn)行一系列的性能驗證、臨床應(yīng)用評價以及衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)評估。mNGS對呼吸道感染病原體的檢測覆蓋面廣、信息量大，已廣泛應(yīng)用于臨床。mNGS對呼吸道病原體的早期發(fā)現(xiàn)，特別是新發(fā)傳染病的病原體快速診斷以及急危重癥、疑難及混合感染診斷方面具有明顯的優(yōu)勢，但mNGS的測序結(jié)果與臨床相關(guān)性的解釋仍然是難點。在未來，一些新的快速檢測技術(shù)，如基于CRISPR的核酸檢測技術(shù)、三代測序技術(shù)及基因芯片技術(shù)是趨勢，也是挑戰(zhàn)。只有將傳統(tǒng)的培養(yǎng)、涂片等方法與各種分子生物學(xué)方法相結(jié)合，才能優(yōu)勢互補(bǔ)，從而達(dá)到快速而準(zhǔn)確地識別呼吸道病原體的臨床目標(biāo)。