寄主對桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌多樣性的影響

丁芷柔 王蕊蕊 周 靜 郭春暉 彭 欣 王瀚棠 王 雪 楊振德

（廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西南寧 530004）

桉樹枝癭姬小蜂（Leptocybeinvasa）隸屬膜翅目（Hymenoptera）小蜂總科（Chalcidoidea）姬小蜂科（Eulophidae），是一種外來入侵致癭性害蟲。2000年于中東及地中海地區(qū)的赤桉（Eucalyptuscamaldulensis）上首次發(fā)現(xiàn)，2007年在我國廣西首次被發(fā)現(xiàn)，侵入范圍現(xiàn)已擴大至海南、廣東、江西、云南、四川等地[1]。該蟲主要危害分布于熱帶亞熱帶的桉屬植物[2]，在植物的嫩枝、葉脈、葉柄處形成粒狀或索狀蟲癭，其中1～2年生的桉樹幼林受害嚴(yán)重[3]。

昆蟲體內(nèi)具有豐富的共生微生物，它們對昆蟲的生長發(fā)育、抗逆性、進化及物種多樣性均有重要影響[4]，如為昆蟲提供生長發(fā)育所需的維生素[5]、增強或降低昆蟲對天敵的抗性[6-7]、降低昆蟲的繁殖能力[8]等。寄主植物除了影響昆蟲代謝、繁殖及防御策略等以外，對昆蟲體內(nèi)共生微生物的豐富度、多樣性及功能均有重要影響[9]。如：取食4種不同寄主的柑橘木虱（Diaphorina citri）體內(nèi)細菌在群落組成和結(jié)構(gòu)中存在差異[10]；取食不同植物的煙粉虱（Bemisia tabaci）內(nèi)生菌組成存在顯著差異，而取食相同植物的煙粉虱內(nèi)生菌組成較為相似[11]；蟪蛄（Platypleura kaempferi）體內(nèi)的細菌群落組成與其寄主植物有關(guān)[12]；寄主植物影響白背飛虱（Sogatella furcifera）共生菌的感染率[13]。目前，關(guān)于桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌已有一些研究，如王蕊蕊等[14]、Liu等[15]分別對桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌多樣性進行了研究；寇冀蒙等[16]探究了細菌在桉樹枝癭姬小蜂入侵過程中幫助宿主克服桉樹次生代謝物的機制；Guo等[17]分析了桉樹枝癭姬小蜂的性別對體內(nèi)細菌的影響。然而，不同寄主對桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌組成及多樣性的影響如何還未見報道。

對昆蟲體內(nèi)共生菌的研究常以傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合分子生物學(xué)的方法進行，既可以提高對分離出的可培養(yǎng)微生物鑒定的準(zhǔn)確性，也可以獲得一些菌株以便深入研究微生物的功能[18]。本研究使用傳統(tǒng)分離鑒定結(jié)合16SrDNA鑒定研究寄主分別為巨園桉DH 201-2（Eucalyptus grandis×Eucalyptustereticornis）和窿緣桉（Eucalyptusexserta）的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的差異，旨在為闡明桉樹枝癭姬小蜂對不同桉樹的適應(yīng)機制，為利用體內(nèi)可培養(yǎng)細菌研發(fā)桉樹枝癭姬小蜂的生物防控技術(shù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蟲源采集于廣西大學(xué)校內(nèi)教學(xué)實驗基地隔離種植的巨園桉無性系（DH 201-2）和窿緣桉上剛羽化的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲。

1.2 可培養(yǎng)細菌的分離純化

采集2種寄主上剛羽化的桉樹枝癭姬小蜂成蟲各10頭，參照王蕊蕊等[19]的方法對蟲體進行處理，使用NA培養(yǎng)基分離成蟲體內(nèi)細菌后在28℃和黑暗條件下倒置培養(yǎng)72 h，每隔24 h對細菌生長情況進行觀察，記錄培養(yǎng)基平板上各種細菌的株數(shù)。挑取菌落形態(tài)不同的單菌落在NA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)3次后保存?zhèn)溆茫詿o菌水涂布培養(yǎng)基為對照。

1.3 可培養(yǎng)細菌的種屬鑒定

形態(tài)鑒定：將不同單菌落分離出的菌株在NA培養(yǎng)基劃線，于28℃下培養(yǎng)72 h，觀察記錄菌體的形態(tài)特征，根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》[20]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]對菌株進行鑒定。

分子鑒定：按照Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒的方法提取菌株的DNA，參照王蕊蕊等[19]的方法使用細菌16SrDNA通用引物（27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對DNA模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系30.0 μL (表1)，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；35個循環(huán)包括，94℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)上比對供試菌株的16S rDNA序列，并將數(shù)據(jù)上傳至RDP seqmatch和RDP Classifier (https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp)進行比對，獲得各菌株相似度最高的同源序列，用ClustalX進行多序列比對，使用MEGA 5.0的鄰位相連法Neighbor-Joining，bootstrap置信度1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹[22-23]。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system

1.4 可培養(yǎng)細菌群落組成及多樣性分析

使用Excel 2013軟件進行Margalef指數(shù)（D'）、Simpson指數(shù)（D）、Shannon-Wiener指數(shù)（H'）、Pielou指數(shù)（J）及群落組成分析，具體分析公式參照王蕊蕊等[19]的方法。

式中：Ni為細菌i的個體數(shù)，N為群落中所有細菌的總個體數(shù)，S為細菌種類總數(shù)，Pi為細菌i的個體數(shù)占全部個體數(shù)的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細菌菌體形態(tài)、菌落性狀及生理生化特征

根據(jù)菌體形態(tài)、顏色、性狀及革蘭氏染色等特征共分離鑒定出菌株28株，從寄主DH 201-2獲得17株（編號為D1-D17），從寄主窿緣桉獲得11株（編號為E1-E11）。其中26株為桿狀；6株有芽孢；13株有鞭毛；12株有莢膜；15株菌株呈革蘭氏陽性反應(yīng)，13株呈陰性反應(yīng)，其余菌株形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀詳見表2。

表2 桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀Table 2 Morphology and condition of culturable bacteria in L.invasa

續(xù)表 2

對28種供試菌株進行了14種生理生化項目測定，結(jié)果顯示，所有供試菌株均為糖、醇類發(fā)酵型；其中僅D7、D15產(chǎn)生吲哚；僅E6、E9不能產(chǎn)生過氧化氫酶；僅D2、E2、D3、D13能產(chǎn)生色氨酸脫氨酶，在其余檢測項目中，不同菌株均表現(xiàn)出顯著的差異性（表3）。

表3 桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的生理生化性狀Table 3 Physiological and biochemical characteristics of culturable bacteria in L.invasa

2.2 可培養(yǎng)細菌16Sr DNA序列鑒定

分子鑒定結(jié)果表明，從不同寄主的桉樹枝癭姬小蜂成蟲體內(nèi)共分離鑒定4門8綱17屬（表4）。其中，分別從寄主為DH 201-2和窿緣桉的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)鑒定出4門6綱15屬和4門5綱9屬，與形態(tài)鑒定結(jié)果相一致。除寄主DH 201-2的D2、D5、D8菌株分別與寄主窿緣桉的E2、E8、E4菌株高度同源外，其余菌株的同源序列均不相同，這表明不同寄主對桉樹枝癭姬小蜂成蟲體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的種類有明顯影響。

表4 桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌16Sr DNA 鑒定結(jié)果Table 4 The identification of culturable bacteria in L.invasa in the way of 16SrDNA sequence

2.3 可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)發(fā)育分析

寄主為DH 201-2的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)的可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1 a）分為4個類群，第1個類群由變形菌門的泛菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、根瘤菌屬組成；第2個類群由厚壁菌門的芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬組成；第3個類群由放線菌門的壤球菌屬、微桿菌屬、短小桿菌屬、類諾卡氏菌屬、微球菌屬、短狀桿菌屬組成；4個類群由擬桿菌門的Dyadobacter屬和金黃桿菌屬組成，共15屬。其中僅D10、D11、D12菌株之間親緣關(guān)系較近同為芽孢桿菌屬。

圖1 基于16Sr DNA序列寄主分別為DH 201-2（a）和窿緣桉（b）的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of culturable bacteria in L.invasa paratisize DH 201-2(a)and Eucalyptus exserta(b) based on the identification of 16SrDNA sequences

寄主為窿緣桉的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)的可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1 b）也分為4個類群，第1個類群由變形菌門的泛菌屬、不動桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、鮑特氏菌屬組成；第2個類群由放線菌門的短小桿菌屬、微桿菌屬和類諾卡氏菌屬組成；第3個類群和第4個類群分別由厚壁菌門和擬桿菌門的芽孢桿菌屬和類土地桿菌屬獨自形成兩個分支，共9屬。其中，E1和E4菌株、E9和E10兩對菌株之間親緣關(guān)系較近，分別同屬于短小桿菌屬和芽孢桿菌屬。

雖然兩寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌在門水平上沒有差異，均分離鑒定出變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門等4個菌門，但在屬水平上有明顯差異。可見，不同寄主對桉樹種癭姬小蜂體內(nèi)菌群的系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生明顯影響。

2.4 桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌多樣性分析

從寄主為DH 20-2的桉樹枝癭姬小蜂成蟲體內(nèi)共分離鑒定出15個菌屬的菌株，其中葡萄球菌屬和泛菌屬的菌株數(shù)量占比（圖2 a）最大，分別為24.21%和19.98%，為優(yōu)勢菌屬。從寄主為窿緣桉的桉樹枝癭姬小蜂成蟲體內(nèi)分離鑒定出9個菌屬的菌株，其中短小桿菌屬和泛菌屬的菌株數(shù)量占比（圖2 b）最大，分別為48.95%和27.29%，為優(yōu)勢菌屬。不同寄主的共有菌屬為泛菌屬、不動桿菌屬、短小桿菌屬、類諾卡氏菌屬和微桿菌屬，其中泛菌屬為二者共有的優(yōu)勢菌屬。

圖2 寄主分別為DH 201-2（a）和窿緣桉（b）的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌屬水平上的群落組成Fig.2 Community composition at the genera level of culturable bacteria in L.invasa paratisize DH 201-2(a)and Eucalyptus exserta(b)

從表5可知，寄主對桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性有明顯影響。寄主為DH 201-2的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)菌群群落的D'值、J值、H'值和D值均明顯高于寄主為窿緣桉的菌群菌落，說明寄主為DH 201-2的桉樹枝癭姬小蜂成蟲體內(nèi)細菌種類及其多樣性較高。

表5 桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 5 Alpha diversity index statisticsof culturable bacteria in L.invasa

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，寄主為DH 201-2的桉樹枝癭姬小蜂成蟲體內(nèi)細菌多樣性高于寄主為窿緣桉的多樣性。Li等[24]研究表明高感品系DH 201-2組織中的單寧含量低于窿緣桉，而氮含量則高于窿緣桉；麗麗等[25]研究發(fā)現(xiàn)食物中的單寧會降低生物體內(nèi)菌群的多樣性和豐度，而當(dāng)施氮含量升高時微生物多樣性顯著提高[26]。因此，可以推測寄主為DH 201-2的桉樹枝癭姬小蜂成蟲體內(nèi)細菌多樣性較高與DH 201-2具有較低的單寧和較高的氮含量有關(guān)。

昆蟲體內(nèi)共生菌的種類組成不僅與昆蟲種類有關(guān)，還受昆蟲的寄主或食物的影響。用不同寄主植物或飼料飼喂草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）[27]、美國白蛾（Hyphantriacunea）[28]后其體內(nèi)優(yōu)勢細菌在屬水平明顯不同。孟麗雪[10]對寄生在，3種柑橘屬上的柑橘木虱（Diaphorina citri）體內(nèi)細菌研究發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢菌屬均為Wolbachia和Escherichia-shigell。本研究結(jié)果顯示，不同寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性存在一定的差異。但是，DH 201-2和窿緣桉均為桉屬植物，親緣關(guān)系較近，因此桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)的菌群組成和優(yōu)勢菌有相似之處。

昆蟲體內(nèi)廣泛存在的變形菌門和放線菌門菌群可能對昆蟲的生長發(fā)育、食物消化、代謝吸收等方面發(fā)揮重要作用。寄主為DH 201-2和窿緣桉的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢菌門均為變形菌門和放線菌門。這與前人在兩種果蠅L.boulardi和L.heterotoma[29]、稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocismedinalis）[30]、棉 鈴 蟲（Helicoverpa armigera）[31]、光肩星天牛（Anoplophoraglabripennis）[32]等其它昆蟲上的研究結(jié)果相似。

葡萄球菌屬是蜚蠊目、鞘翅目和鱗翅目等昆蟲體內(nèi)的優(yōu)勢菌屬[33-36]。李冠楠等[37]發(fā)現(xiàn)一種葡萄球菌可產(chǎn)多種酶幫助昆蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。此外，葡萄球菌還能通過在昆蟲發(fā)育初期刺激胰島素信號通路來對昆蟲生長發(fā)育產(chǎn)生影響[38]。Wei等[39]發(fā)現(xiàn)一種短小桿菌可分泌蛋白酶水解蛋白質(zhì)，除此之外，在鱗翅目昆蟲腸道內(nèi)的短小桿菌還可以降解天然乳膠幫助昆蟲抵御植物防御[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬和短小桿菌屬分別是寄主為DH 201-2和窿緣桉的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)優(yōu)勢菌屬，它們可能與不同寄主條件下營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收與轉(zhuǎn)化利用有關(guān)。一些泛菌屬的細菌為桉樹、水稻、玉米等植物的致病菌[41]。Dillon等[42]發(fā)現(xiàn)一種泛菌屬細菌可分泌保護性物質(zhì)使宿主沙漠蝗（Schistocerca gregaria）抵御脅迫；還有一些泛菌屬細菌可通過調(diào)控植物免疫防御反應(yīng)的代謝通路間接保護宿主昆蟲在取食過程中不受傷害，如通過調(diào)控應(yīng)答基因JA、SA的表達[43]或調(diào)控多酚氧化酶和過氧化物酶的活性[44]。在本研究中，泛菌屬為不同寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)共有的優(yōu)勢菌屬，泛菌屬細菌可能在桉樹枝癭姬小蜂克服寄主桉樹的化學(xué)防御而成功侵入危害桉樹的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，寄主植物能顯著影響桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌的種類、群落結(jié)構(gòu)及多樣性，這些共生菌是否在桉樹枝癭姬小蜂入侵桉樹、抵御脅迫、生長代謝中發(fā)揮作用，還有待于進一步研究。