武定雞肉中鮮味肽分離鑒定及呈味特性

何 穎，呂東霖，廖國周，賈 蓉，葛長榮，黃 明，王桂瑛,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

味道是決定食物可接受性的重要因素，其中鮮味作為5大基本味道之一，于1908年首次提出[1]。鮮味是游離氨基酸類、核苷酸類、肽類、有機(jī)酸及其衍生物等物質(zhì)與鮮味受體結(jié)合而產(chǎn)生的，這些鮮味物質(zhì)可以改善食品的總體味感[2-3]。鮮味肽是一類分子質(zhì)量范圍在300～3 000 Da的肽[4]。最早從木瓜蛋白酶處理的牛肉中發(fā)現(xiàn)了鮮味六肽[5]，此后在多種食品中均鑒定出鮮味肽，如動(dòng)物性食品中的豬肉[6]、雞湯[7]、魚肉[8]等，植物性食品中的花生[9]等，真菌界的遠(yuǎn)東疣柄牛肝菌[10]等，以及發(fā)酵食品中的醬油[11]、白腐乳[12]等。此外，溫志鵬[13]發(fā)現(xiàn)海帶中的鮮味肽具有一定的抗氧化能力。由于鮮味肽獨(dú)特的呈味特性和生物學(xué)功能，人們對于食物中鮮味肽的發(fā)掘和表征越來越感興趣。

武定雞是云南省極具代表性的雞種之一[14]，位居“云南六大名雞”之首，主產(chǎn)于楚雄彝族自治州武定縣，具有體大、肉嫩、味鮮等特點(diǎn)，深受群眾喜愛[15]。目前有關(guān)武定雞的研究主要在品質(zhì)性狀和風(fēng)味物質(zhì)上，朱仁俊等[16]對武定雞肉品質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明閹割處理可以使武定雞肉質(zhì)更細(xì)嫩；本課題組前期已對武定雞肉中的風(fēng)味前體物及加工過程中形成的特征風(fēng)味物質(zhì)開展研究[17]；Yu Yuanrui等[18]研究了天然香料對武定雞風(fēng)味前體物質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響；Xiao Zhichao等[19]對武定雞的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸和小分子肽是雞胸肉和雞腿肉的主要代謝產(chǎn)物。然而，對于武定雞肉中的鮮味肽仍未深入發(fā)掘。

本研究采用超濾分級、凝膠過濾色譜（gel filtration chromatography，GFC）及反相高效液相色譜（reversedphase high performance liquid chromatography，RPHPLC）對武定雞的鮮味成分進(jìn)行分離與純化，結(jié)合感官評價(jià)確定鮮味最強(qiáng)烈的組分，以納升高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（nanoscale high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，Nano-HPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)測定肽的分子質(zhì)量和氨基酸序列，并對鑒定的多肽進(jìn)行合成，進(jìn)一步研究其呈味特性。本研究為完善武定雞的特征風(fēng)味體系和深入研究鮮味肽呈鮮機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為武定雞的精深加工及鮮味肽類調(diào)味品的開發(fā)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

140 日齡的雌性武定雞由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)雞場提供。

葡聚糖凝膠G-15 上海索萊寶生物科技有限公司；檸檬酸、蔗糖、氯化鈉、奎寧、味精 昆明賽捷生物科技有限公司；95%乙醇溶液 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈 德國Merck公司；所有感官用試劑均為食品級，所有分離用有機(jī)溶劑均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；BS224S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Milli-Q Gradient超純水系統(tǒng) 上海熙揚(yáng)儀器有限公司；TGL-16K冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；MSC超濾杯 上海摩速科學(xué)器材有限公司；79-1磁力攪拌器 天津市濱海新區(qū)大港紅杉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；普通玻璃層析柱 上海滬西分析儀器廠；752型紫外分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；HL-2恒流泵、BS-100A自動(dòng)餾分收集器 上海青浦滬西儀器廠；1200型高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；Nano-HPLC-MS/MS儀 美國賽默飛世爾科技公司；ZipTip C18除鹽柱 美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 武定雞肉水提物（chicken water extract，CWE）的制備

參考Zhang Meixiu等[20]的方法并略有改動(dòng)。取200 g雞胸肉切碎，在10 000 r/min經(jīng)高速分散器均質(zhì)30 s處理3次，加入800 mL超純水后得到勻漿，將其在50 ℃水浴攪拌3 h提取肽，得到肽粗提液。將肽粗提液在4 ℃、10 000 r/min離心15 min后取上清液。重復(fù)提取3次，合并上清液，即得到富含鮮味肽的呈味基料（CWE）。

1.3.2 CWE的超濾分級

一般食源性蛋白中呈味肽的分子質(zhì)量均小于5 000 Da[21]。本實(shí)驗(yàn)選用1 000、3 000 Da及5 000 Da的超濾膜對CWE在4 ℃進(jìn)行超濾分級：首先將樣品通過5 000 Da的超濾膜，隨后將透過液分別透過3 000 Da和1 000 Da的超濾膜，分級后得到3個(gè)組分，分別命名為CWE-I（分子質(zhì)量＜1 000 Da），CWE-II（1 000 Da＜分子質(zhì)量＜3 000 Da），CWE-III（3 000 Da＜分子質(zhì)量＜5 000 Da），濃縮后冷凍干燥成粉末，用于感官評價(jià)，收集鮮味最強(qiáng)烈的組分用于下一步分離純化。

1.3.3 CWE超濾組分的GFC分離

選擇葡聚糖凝膠G-15作為柱填料，稱取60 g葡聚糖凝膠干粉浸泡于400 mL超純水中至少24 h，不斷攪拌使凝膠充分溶脹。平衡后去除多余的顆粒和懸浮液進(jìn)行裝柱（1.6 cm×80 cm），待穩(wěn)定后便可上樣。

將上述鮮味最佳的超濾組分凍干粉加超純水配制成25 mg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后，以凝膠層析柱進(jìn)行分離純化。以超純水為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，上樣量為1 mL，紫外檢測波長為220 nm。樣品經(jīng)GFC分離后得到不同的分離組分，用自動(dòng)餾分收集器收集并凍干備用。通過對分離組分進(jìn)行感官評價(jià)，篩選出鮮味感官分?jǐn)?shù)最強(qiáng)烈的組分用于后續(xù)純化。

1.3.4 GFC分離組分的RP-HPLC分離純化

將GFC分離得到的鮮味較強(qiáng)的肽組分凍干粉與蒸餾水配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后，濾液進(jìn)入RP-HPLC系統(tǒng)進(jìn)一步分離純化得到不同的分離組分，收集并合并各組分，經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后，貯藏在-20 ℃。對各凍干組分進(jìn)行感官評價(jià)分析，對鮮味得分最高的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

分離條件：Thermo GOLD C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相A：含0.05% TFA的乙腈溶液；流動(dòng)相B：含0.05% TFA的超純水；等度洗脫程序：5% A+95% B，25 ℃洗脫20 min，流速0.8 mL/min。檢測波長220 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5 RP-HPLC分離純化組分的Nano-HPLC-MS/MS鑒定

以Nano-HPLC-MS/MS分析鮮味得分最高的RP-HPLC分離純化組分的分子質(zhì)量和氨基酸序列。上樣前取適量樣本采用ZipTip C18除鹽柱（10 μL）進(jìn)行除鹽，共上樣3 μL樣品。

色譜條件：Acclaim PepMap C18色譜柱（75 μm×25 cm）；柱流量300 nL/min；柱溫40 ℃；電噴霧電壓2 kV；流動(dòng)相A：含0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B：含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～3 min，98%～94% A、2%～6% B；3～42 min，94%～80% A、6%～20% B；42～47 min，80%～65% A、20%～35% B；47～48 min，65%～0% A、35%～100% B；48～60 min，0% A、100% B。

質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運(yùn)行，在MS和MS/MS采集間自動(dòng)切換。質(zhì)譜條件：MS：掃描范圍m/z200～1 500；分辨率70 000；自動(dòng)增益控制目標(biāo)3×10-6；最大注入時(shí)間60 ms；掃描電荷2～6。高能碰撞解離MS/MS：分辨率1 7500；隔離窗口m/z2；自動(dòng)增益控制目標(biāo)5×10-4；最大注入時(shí)間50 ms；碰撞能量27 eV，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間20 s。

串聯(lián)質(zhì)譜圖經(jīng)過PEAKS Studio X+軟件分析，使用PEAKS DB算法對Uniprot-Gallus數(shù)據(jù)庫（版本201907，18 124 條目）搜庫，設(shè)置None酶解。碎片離子質(zhì)量容許誤差0.02 Da，母離子質(zhì)量容許誤差7×10-6；最大漏切數(shù)為2；可變修飾：氧化修飾15.99，脫酰胺化0.98。蛋白卡值為-10 lgP≥0，至少含1個(gè)特異性肽段；肽段卡值為-10 lgP≥15。

1.3.6 多肽的合成及活性預(yù)測

采用固相合成法對鑒定的已知結(jié)構(gòu)的肽段進(jìn)行合成，脫鹽處理后使其純度在95%以上，委托上海吉爾生化有限公司合成，并通過BIOPEP呈味肽和氨基酸數(shù)據(jù)庫預(yù)測所鑒定肽的潛在生物活性。

1.3.7 感官評價(jià)分析

1.3.7.1 感官評價(jià)小組培訓(xùn)

感官培訓(xùn)參考Liu Ziyuan等[22]的方法并有少許改動(dòng)。共招募10 名成員（4 名男性和6 名女性，年齡為20～28 歲），所有小組成員均健康、不吸煙、無味覺和嗅覺障礙，在感官評價(jià)方面都有一定的經(jīng)驗(yàn)，并知情同意參加本研究的感官測試。酸味、甜味、苦味、鮮味和咸味的參考標(biāo)準(zhǔn)分別為檸檬酸、蔗糖、奎寧、谷氨酸鈉、氯化鈉。感官評價(jià)小組經(jīng)訓(xùn)練后記住以下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的味道[23-24]：5 mmol/L 檸檬酸、10 mmol/L蔗糖、1 mmol/L奎寧、10 mmol/L谷氨酸鈉和12 mmol/L氯化鈉，所有感官實(shí)驗(yàn)均在（23±2） ℃的環(huán)境下進(jìn)行。

1.3.7.2 CWE及其超濾組分的感官評價(jià)

將CWE以及超濾分離后各凍干組分溶于超純水中，得到質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液進(jìn)行感官評價(jià)。小組成員根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)味道對實(shí)驗(yàn)樣品（約1 mL）的味道進(jìn)行評分，酸、甜、苦、鮮和咸的強(qiáng)度均為0～7 分，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[25]。在鮮味評分中，將超純水的鮮味值定為0 分，1 mg/mL和2 mg/mL谷氨酸鈉溶液分別定為4 分和7 分。

表1 感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation

1.3.7.3 GFC分離組分的感官評價(jià)

參照Frank等[26]的滋味稀釋分析法并略有改動(dòng)。將超濾組分和GFC各分離組分用超純水配成5 mg/mL的溶液，按體積比1∶1逐步稀釋，每次取5 mL逐步稀釋的樣液，按質(zhì)量濃度遞減的順序遞給感官評價(jià)者，每個(gè)樣品品嘗約5 s。當(dāng)某一稀釋水平的溶液與兩個(gè)空白（超純水）之間的味道差異剛好能被分辨出來，此時(shí)稀釋倍數(shù)即稀釋因子。對評估人員的評價(jià)結(jié)果進(jìn)行記錄，評價(jià)過程不允許討論和交流，結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。同時(shí)，感官評價(jià)員還對各組分的味覺特征進(jìn)行了描述。

1.3.7.4 RP-HPLC分離組分的感官評價(jià)

參照1.3.7.2節(jié)的方法對各RP-HPLC分離組分的鮮味進(jìn)行感官評價(jià)。

1.3.7.5 合成肽的鮮味閾值測定和感官描述

合成肽鮮味閾值測定采用三角試驗(yàn)法[27]：將合成肽溶解在超純水中配制為1 mg/mL溶液，以1∶1（V/V）逐漸稀釋，直至溶液鮮味無法識別出為止。將倒數(shù)第2個(gè)溶液的質(zhì)量濃度記為合成肽的鮮味閾值，同時(shí)，感官評價(jià)員評價(jià)了合成肽溶液的感官特性，包括酸、甜、苦、鮮和咸味。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05，差異顯著），并使用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CWE的超濾分級與感官分析

如圖1所示，隨著CWE的逐步超濾分級，分離組分的鮮味逐漸增強(qiáng)；與CWE-II和CWE-III相比，CWE-I表現(xiàn)出較強(qiáng)的鮮味強(qiáng)度（P＜0.05），而咸味強(qiáng)度稍高但無差異顯著性（P＞0.05）；并且CWE-I和CWE具有相似的整體風(fēng)味輪廓，即組分CWE-I的鮮味評分最高，也就是說低分子質(zhì)量組分CWE-I是關(guān)鍵的風(fēng)味活性組分[28]，并具有較強(qiáng)的鮮味[29-30]。這些結(jié)果與之前的研究高度一致，Su Guowan等[9]將花生粕酶解液超濾后發(fā)現(xiàn)，低于1 000 Da的組分鮮味較強(qiáng)烈，而1 000～3 000 Da的組分有較好的鮮味增強(qiáng)效果；另外，丁奇[7]的研究結(jié)果表明無論是雞湯還是酶解液中，均是分子質(zhì)量小于1 000 Da的組分具有更強(qiáng)的鮮味。因此，收集鮮味最強(qiáng)烈的是CWE-I組分，使用GFC進(jìn)行下一步的分離純化。

圖1 CWE超濾組分的感官雷達(dá)圖Fig. 1 Radar map of sensory evaluation of CWE and its ultrafiltration fraction

2.2 CWE超濾組分的GFC分離與感官分析

CWE經(jīng)過超濾后，雖然去除了比較多的大分子物質(zhì)，但仍是復(fù)雜的混合肽樣品，為了找出鮮味最強(qiáng)烈的武定雞肉蛋白肽的分子質(zhì)量范圍，使用GFC對鮮味最強(qiáng)的超濾組分CWE-I進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。由圖2可知，CWE-I組分經(jīng)過GFC分離后得到了4個(gè)組分（F1、F2、F3、F4）。如表2所示，CWE-I，F(xiàn)1和F2組分的滋味以鮮味為主，咸、甜次之。由于鮮味、咸和甜的相互作用，咸和甜可以增強(qiáng)鮮味[31]，且鮮味物質(zhì)含量高的組分也有較高的甜味物質(zhì)含量[32,22]。此外，F(xiàn)2組分表現(xiàn)出僅次于超濾組分CWE-I的鮮味強(qiáng)度，稀釋因子為64；并且隨著組分不斷分離，F(xiàn)3和F4組分的咸味有所降低，從側(cè)面反映出凝膠過濾有一個(gè)較好的脫鹽效果。根據(jù)感官評價(jià)結(jié)果，將F2組分用于后續(xù)的分離純化。

圖2 武定雞肉超濾組分CWE-I的GFC圖Fig. 2 GFC chromatogram of ultrafiltration fraction CWE-I

表2 超濾組分CWE-I和GFC分離組分的感官評價(jià)Table 2 Sensory evaluation of CWE-I and subfractions from it separated by GFC

2.3 GFC分離組分的RP-HPLC分離純化與感官分析

收集GFC分離的鮮味最強(qiáng)烈的F2組分進(jìn)行RP-HPLC分離純化。如圖3所示，在3～6 min保留時(shí)間內(nèi)，F(xiàn)2分離后得到了4個(gè)在220 nm波長處有明顯吸收的組分，將這些組分分別命名為F2-1、F2-2、F2-3、F2-4。極性強(qiáng)（疏水性弱）的物質(zhì)先被洗脫出來，所以武定雞中的鮮味肽極性都很強(qiáng)。研究表明，疏水性強(qiáng)弱與氨基酸性質(zhì)有關(guān)[33]，多數(shù)的苦味氨基酸如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸為疏水性氨基酸，多數(shù)的甜鮮味氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸為親水性氨基酸[34]，這代表組分中可能會(huì)含有親水性的甜鮮氨基酸。如圖4所示，F(xiàn)2-3的鮮味得分顯著高于F2-1、F2-2和F2-4（P＜0.05）。因此，鮮味最佳的組分為F2-3，其鮮味強(qiáng)度是未經(jīng)RP-HPLC分離純化的F2的1.14 倍，故選擇F2-3組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，測定肽的氨基酸序列組成。

圖3 武定雞肉GFC分離組分F2的RP-HPLC圖Fig. 3 RP-HPLC chromatogram for F2 fractionation

圖4 武定雞肉GFC分離組分F2及其RP-HPLC分離純化組分的鮮味強(qiáng)度Fig. 4 Umami intensity of F2 and its subfractions obtained by RP-HPLC

2.4 RP-HPLC分離純化組分的Nano-HPLC-MS/MS結(jié)構(gòu)鑒定

采用Nano-HPLC-MS/MS對RP-HPLC分離純化的鮮味最佳F2-3組分中鮮味肽的氨基酸序列和分子質(zhì)量進(jìn)行分析。由表3可知，通過質(zhì)譜鑒定出8種主要肽段，包括2 條三肽、1 條九肽、1 條十肽、1 條十一肽、1 條十二肽、1 條十三肽和1 條十五肽，這些肽段的分子質(zhì)量范圍為365.20～1 735.92 Da。

表3 武定雞肉RP-HPLC分離純化組分F2-3中鑒定的特征肽段Table 3 Signature peptide sequences identified in F2-3

2.5 武定雞肉中鮮味肽的活性預(yù)測及呈味特性

為了研究多肽的呈味特性與氨基酸的組成之間的關(guān)系，采用生物活性肽數(shù)據(jù)庫BIOPEP建立蛋白質(zhì)片段的潛在感覺輪廓[35]。已鑒定的肽段通過BIOPEP數(shù)據(jù)庫得到的感官活性預(yù)測結(jié)果如表4所示。該結(jié)果由A＝a/N計(jì)算所得（a為目標(biāo)肽序列中具有特定味覺活性片段的片段數(shù)；N為肽段中含有的氨基酸殘基數(shù)）。

表4 生物活性片段在鑒定肽中的出現(xiàn)頻率Table 4 Frequency of occurrence of bioactive fragments in identified peptides

由表4可知，鮮味活性片段出現(xiàn)頻率最高的肽段是LDF，其具有的鮮味片段為D，其次是FAGDDAPRAVFPS和DLAGRDLTDYLMKIL（包含D、DA和DD的鮮味活性片段），出現(xiàn)頻率最低的是RKGFPSRIL，Toda等[36]報(bào)道天冬氨酸等鮮味氨基酸可以激活味覺受體T1R1/T1R3，所以LDF很有可能呈現(xiàn)鮮味。苦味活性片段出現(xiàn)頻率最高的肽段是LLLYVRIYLVLR，其次是LLYVRIYLVLR、RKGFPSRIL、LYVRIYLVLR，最低的是FAGDDAPRAVFPS。對目前已報(bào)道的鮮味肽進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一些具有苦味的氨基酸如組氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸等均是鮮味肽的組成成分[37]。酸味活性片段出現(xiàn)頻率最高的肽段是LDF，其次是DLAGRDLTDYLMKIL，酸性氨基酸被認(rèn)為是重要的鮮味刺激物質(zhì)，它們通常包含在鮮味肽的氨基酸序列中[10]。丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸等甜味氨基酸也有助于鮮味[38]，甜味活性片段出現(xiàn)頻率較高的肽段有FAGDDAPRAVFPS、FVT和RKGFPSRIL。因此，不能直接判斷所鑒定肽的味覺活性，也不能僅憑味覺活性片段在所鑒定肽中出現(xiàn)的頻率判斷，綜合以上分析推測LDF、FAGDDAPRAVFPS和DLAGRDLTDYLMKIL可能具有鮮味。

表5 合成肽水溶液的滋味特性Table 5 Taste characteristics of synthetic peptides in aqueous solution

為了更全面地研究肽的滋味特性，采用固相合成法對上述所有已鑒定的多肽進(jìn)行合成，對純度大于95%的肽進(jìn)行了味道描述和閾值分析。如表5所示，LDF、FVT和DLAGRDLTDYLMKIL這3 條肽具有明顯鮮味，鮮味閾值分別為0.250、0.062、0.125 mg/mL。之前通過生物活性肽數(shù)據(jù)庫BIOPEP預(yù)測LDF、FAGDDAPRAVFPS和DLAGRDLTDYLMKIL可能具有鮮味，但感官結(jié)果卻顯示FAGDDAPRAVFPS不具有鮮味，其原因可能是空間結(jié)構(gòu)的差異，具體還需要進(jìn)一步研究。莫加利等[39]從風(fēng)干武昌魚中分離出一條鮮味肽P2a-2，發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構(gòu)以β-轉(zhuǎn)角為主，相對含量高達(dá)90.16%，推測肽的鮮味與β-轉(zhuǎn)角有關(guān)。RKGFPSRIL苦味強(qiáng)烈的原因可能是因?yàn)榭辔栋被岜壤呋蛘呤荖端是堿性氨基酸（精氨酸）。Dang Yali等[40]的研究表明，精氨酸殘基對肽和受體相互作用的活性位點(diǎn)有非常重要的影響。Liang Jiaming等[10]發(fā)現(xiàn)合成肽YNEYPPLGR具有強(qiáng)烈的鮮味很可能是因?yàn)镃端含有精氨酸殘基，Tamura等[41]研究堿性和酸性氨基酸的位置對呈鮮效果的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)肽的N端為帶負(fù)電的酸性氨基酸，C端為帶正電的堿性氨基酸時(shí)，二肽才有呈味特性，反之則沒有呈味效果。LYVRIYLVLR、LLYVRIYLVLR、LLLYVRIYLVLR這3 條肽，它們沒有鮮味和苦味，可能是不同感官特性氨基酸之間相互影響的結(jié)果。然而，F(xiàn)VT含有苯丙氨酸和纈氨酸兩個(gè)疏水性氨基酸但仍呈現(xiàn)鮮味。之前有研究表明，疏水性氨基酸也可能會(huì)影響鮮味肽的呈味效果：如從魚露中鑒定的鮮味肽MEREQEESTMR和LLDAFFFDNK，它們的氨基酸序列中含有呈苦味的甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等疏水氨基酸，但是總體仍呈現(xiàn)鮮味[42]?？梢姡r味肽的呈味效果與肽鏈長度、氨基酸的組成和排列順序以及空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

綜上，肽的呈味特性受到很多因素的影響，將生物活性肽數(shù)據(jù)庫BIOPEP的預(yù)測結(jié)果和感官分析結(jié)果相結(jié)合，有助于更全面地研究多肽的呈味效果與其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

3 結(jié) 論

CWE經(jīng)過超濾分級、GFC及RP-HPLC分離純化并結(jié)合感官評價(jià)得到具有較強(qiáng)鮮味的組分F2-3，經(jīng)Nano-HPLC-MS/MS鑒定出8 條多肽，分子質(zhì)量范圍為365.20～1 735.92 Da，氨基酸序列分別為RKGFPSRIL、LDF、FAGDDAPRAVFPS、FVT、LYVRIYLVLR、LLYVRIYLVLR、DLAGRDLTDYLMKIL和LLLYVRIYLVLR。采用BIOPEP數(shù)據(jù)庫對其感官活性進(jìn)行預(yù)測，并通過固相合成確定其味道特征，發(fā)現(xiàn)LDF、FVT和DLAGRDLTDYLMKIL這3 條肽具有鮮味。本研究豐富了武定雞的風(fēng)味體系，為進(jìn)一步闡明武定雞肉中鮮味肽的構(gòu)效關(guān)系提供參考。