利用核磁共振研究脂肪氧合酶酶促氧化蛋黃磷脂

俞舜杰，趙子建，萬 鵬，楊曉瑩，陳德慰

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

磷脂是一種具有兩親性的極性脂質(zhì)，由甘油主鏈和sn-3上的磷酸基團(tuán)組成。磷脂的動(dòng)物來源主要是蛋黃、牛奶、海洋類生物、腦組織等，常見磷脂有磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、鞘磷脂和其他復(fù)雜脂肪酸組成的甘油磷脂，而蛋黃磷脂主要由PC和PE組成[1-3]。31P核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）已被證明是一種定量不同產(chǎn)品中磷脂的良好方法，并廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[2]。31P NMR和1H NMR相比，對含磷化合物具有選擇性的重要優(yōu)勢，盡管31P NMR的靈敏度相對較低，但在低至5 μmol/100 g的含量下，仍可以很好地觀察到磷脂[3]。

脂質(zhì)氧化，尤其是磷脂的氧化對食品風(fēng)味有著重要的影響[4]。磷脂中富含亞油酸等多不飽和脂肪酸，是重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，極易氧化生成氫過氧化物。這些氫過氧化物不穩(wěn)定，易降解成醛、酮等小分子物質(zhì)，從而為不同食品提供風(fēng)味特征。目前已有許多關(guān)于磷脂應(yīng)用于提高食品風(fēng)味的研究，Chen Dewei等[5]通過蛋黃磷脂提高了雞肉香氣，Guo Dong等[6]通過蛋黃磷脂提高了真空油炸薯?xiàng)l的風(fēng)味，另外還有鳙魚頭磷脂[7]、豬肉磷脂[8]、牛奶磷脂[9]、雞油磷脂[10]等也被用來研究對食品風(fēng)味的影響。關(guān)于磷脂組成、磷脂抗氧化、磷脂促氧化以及磷脂對食品風(fēng)味的提升等已經(jīng)有了一定研究，但是對于磷脂氧化的機(jī)理還少有全面合理的解釋。

脂肪酸可通過3種方式氧化：自氧化、光氧化以及酶促氧化。在氧化過程中，磷脂甘油鏈上的?；鶗l(fā)生變化[11]，可以通過?；兓^察磷脂氧化的路徑和程度。?；赡馨l(fā)生變化的情況有3種：1）不飽和?；湑?dǎo)致分子內(nèi)或分子間甘油三酯分子不同?；溕咸荚娱g形成鍵，后一種情況下會導(dǎo)致聚合，可能減少多不飽和鏈的飽和度，以及可能產(chǎn)生二聚體、三聚體、低聚物或聚合物；2）?；溞纬珊豕倌軋F(tuán)，如氫過氧基、羥基、酮基或環(huán)氧基；3）?；湐嗔研纬尚》肿樱瑥亩删哂薪?cái)圊；湹母视腿ァ?/p>

脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）屬于氧化還原酶，能特異性地在順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)處通過分子加氧催化多不飽和脂肪酸，生成含有共軛雙鍵的氫過氧化物。LOX主要作用于亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸和其他高級脂肪酸，一般認(rèn)為亞油酸的加氧位置在C9和C13位上[12]，生成的一級產(chǎn)物氫過氧化物穩(wěn)定性低，可繼續(xù)降解并氧化成醛、酮等二級氧化產(chǎn)物，還可進(jìn)一步氧化為環(huán)氧酸[13]。

在食品科學(xué)領(lǐng)域，脂質(zhì)氧化常用的分析方法有過氧化值、酸價(jià)、碘值、對茴香胺值和2-硫代巴比妥酸值等的測定[14]。還有通過光譜法定量評估共軛二烯和三烯、使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]測定揮發(fā)性低分子脂質(zhì)氧化產(chǎn)物等技術(shù)。NMR技術(shù)因其高效精確及專一性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于測定物質(zhì)組成和監(jiān)測物質(zhì)化學(xué)變化。盡管1H NMR的δ窄，信號容易重疊，但是其靈敏度高，得到的信號較多，與傳統(tǒng)分析方法相比能得到更多有利的信息。另外，相比于傳統(tǒng)方法和色譜法，NMR技術(shù)對樣品純度要求不高，樣品幾乎不需要預(yù)處理且在室溫下進(jìn)行分析，并只需使用少量有機(jī)溶劑或試劑，而且分析樣品的時(shí)間通常較短。利用1H NMR對脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的進(jìn)一步研究確定了許多其他氧化產(chǎn)物，如共軛二烯體系的氫過氧化物、醛類和環(huán)氧化物[16]，并有助于建立目前對脂質(zhì)氧化的基本認(rèn)識。1H NMR技術(shù)根據(jù)化合物特征官能團(tuán)質(zhì)子產(chǎn)生的光譜信號可對其進(jìn)行定性和定量分析。

一直以來，研究熱氧化食用油等脂質(zhì)氧化規(guī)律的很多，但利用LOX催化探究磷脂氧化機(jī)理的研究還很罕見。蛋黃是磷脂的主要來源之一，本研究期望通過LOX催化氧化蛋黃磷脂，利用31P NMR測定蛋黃磷脂組成，通過1H NMR和兩種化學(xué)方法監(jiān)測蛋黃磷脂中主要酰基、一級和二級氧化化合物的變化，為酶促氧化磷脂生成醛類風(fēng)味化合物提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋購自當(dāng)?shù)夭耸袌觥?/p>

大豆LOX 浙江聯(lián)碩生物有限公司；無水乙醇、氫氧化鉀 成都市科龍化工試劑廠；氘代氯仿（CDCl3）、磷酸三苯酯 上海麥克林生化科技有限公司；正己烷、乙醚、丙酮、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、硼砂、硼酸 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR21N型高速冷凍離心機(jī) 天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；AVANCE III HD 500 NMR波譜儀 德國Bruker公司；HJ-6A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 江蘇金怡儀器科技有限公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置6 組樣品：空白組：新鮮蛋黃磷脂；實(shí)驗(yàn)組1：水浴95 ℃氧化2 h的蛋黃磷脂；實(shí)驗(yàn)組2：pH 6條件下大豆LOX氧化3 h的蛋黃磷脂；實(shí)驗(yàn)組3：pH 9條件下大豆LOX氧化3 h的蛋黃磷脂；實(shí)驗(yàn)組4：實(shí)驗(yàn)組2酶促氧化蛋黃磷脂的熱氧化（95 ℃水浴2 h）樣品；實(shí)驗(yàn)組5：實(shí)驗(yàn)組3酶促氧化蛋黃磷脂的熱氧化（95 ℃水浴2 h）樣品。實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3的兩種pH值分別為磷脂C9與C13位的最適氧化條件。蛋黃磷脂的熱氧化用于使用1H NMR觀察蛋黃磷脂中二級氧化產(chǎn)物。

1.3.1.1 蛋黃磷脂的制備

參考Chen Dewei等[5]的方法，并做少量修改。取6個(gè)新鮮雞蛋去除蛋清，將蛋黃攪拌均勻后，利用3～6 倍體積的乙醇提取蛋黃磷脂。取出提取液至圓底燒瓶，向沉淀中繼續(xù)加乙醇并于4 000 r/min離心15 min，合并上清液與提取液。將溶液減壓蒸餾后，加入正己烷溶解，冰浴10 min，加入適量冷丙酮以沉淀磷脂。用丙酮不斷洗滌沉淀物，沖洗至沖洗液無色，取沉淀至培養(yǎng)皿。在室溫下，高真空6 h去除沉淀中少量殘留溶劑，得到蛋黃磷脂樣品，放入4 ℃冰箱保存。

1.3.1.2 蛋黃磷脂的酶促氧化

參考蔡琨[17]的方法，并做少量修改。稱量1 g蛋黃磷脂（溶解度約0.5%）置于燒杯中，加入200 mL pH 6 0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（或200 mL pH 9 0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液）。取大豆LOX在2 mL離心管中用蒸餾水溶解，振蕩至完全溶解。將酶液加入燒杯，在37 ℃下磁力攪拌3 h后停止反應(yīng)。用乙醚萃取氫過氧化物，并用水洗滌乙醚提取物，去除可能殘留的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。利用高真空去除樣品中的殘留乙醚[18]。通過延長反應(yīng)時(shí)間達(dá)到與文獻(xiàn)相似的氧化效果。

1.3.1.3 蛋黃磷脂的熱氧化

參考Xu Na等[19]的方法，并適當(dāng)修改。取0.2 g蛋黃磷脂，加2 mL氯仿，氮吹蒸發(fā)溶劑，并減壓蒸發(fā)殘余氯仿后得到一層磷脂膜。放入具塞試管中，95 ℃水浴加熱2 h，迅速冰浴冷卻后保存。

1.3.231P NMR分析

參考Bettjeman[20]和Ahmmed[21]等的脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)法。將內(nèi)標(biāo)物磷酸三苯酯溶于CDCl3，渦旋1 min，質(zhì)量濃度為25 mg/mL。取0.1 g蛋黃磷脂樣品轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，溶劑為0.4 mL CDCl3和0.4 mL甲醇-K4EDTA混合物。溶液振蕩均勻后轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中。使用帶有5 mm低溫探針的600 MHz的NMR波譜儀進(jìn)行分析：單脈沖模式；實(shí)驗(yàn)溫度25 ℃；掃描次數(shù)192次，弛豫時(shí)間3.5 s。

采用絕對定量法：由內(nèi)標(biāo)化合物特征峰面積與樣品中某一特征峰面積的比值按下式計(jì)算樣品質(zhì)量濃度[22]：

式中：cx為待測物質(zhì)量濃度/（mg/L）；cstd為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/（mg/L）；Mx為待測物分子質(zhì)量；Mstd為內(nèi)標(biāo)分子質(zhì)量；Ax為待測物峰面積；Astd為內(nèi)標(biāo)物峰面積；nx為待測物定量峰包含的磷原子數(shù)；nstd為內(nèi)標(biāo)物定量峰包含的磷原子數(shù)。

1.3.31H NMR分析

參考文獻(xiàn)[23-24]的方法。取0.1 g蛋黃磷脂樣品轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管中。溶劑為600 μL CDCl3。將溶液在振蕩儀上搖勻，轉(zhuǎn)移到5 mm核磁管中。使用帶有5 mm低溫探針的500 MHz的NMR波譜儀進(jìn)行分析：內(nèi)部溫度295 K；單脈沖模式；掃描次數(shù)64次；弛豫時(shí)間1 s，采集時(shí)間3.744 s。

利用1H NMR計(jì)算油脂脂肪酸組成及含量的方法已被大量報(bào)道[23,25-26]，總結(jié)整理得出計(jì)算公式。

主要脂肪?；南鄬ξ镔|(zhì)的量按式（2）計(jì)算：

式中：xi待測脂肪酸的相對物質(zhì)的量/%；Ii為待測脂肪酸的積分換算值；IFA為總脂肪酸的積分換算值。

脂肪酸的積分換算如式（3）～（10）所示，Ax表示相應(yīng)信號的積分值，δ分配見表1。

選擇甘油主鏈的—CH2OCOR，按下式計(jì)算總脂肪酸的積分換算值：

選擇不飽和ω-3酰基的—CH3，按下式計(jì)算總ω-3脂肪酸的積分換算值：

選擇二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）?；摹狾CO—CH2—CH2—，按下式計(jì)算DHA的積分換算值：

選擇二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十碳四烯酸（eicosatetraenoic acid，ARA）?；摹狾CO—CH2—CH2—，按下式計(jì)算EPA和ARA的積分換算值：

選擇不飽和ω-3酰基的—CH3，按下式計(jì)算亞麻酸的積分換算值：

選擇雙不飽和ω-6?；模紿C—CH2—CH＝，按下式計(jì)算亞油酸的積分換算值：

選擇除DHA外脂肪酸烯丙基的—CH2—CH＝CH—，按下式計(jì)算油酸的積分換算值：

選擇飽和、單不飽和ω-9和/或ω-7、不飽和ω-6?；摹狢H3，按下式計(jì)算飽和脂肪酸的積分換算值：

氫過氧化物、醛類的濃度比按下式計(jì)算：

式中：bi為待測物質(zhì)的濃度比/（mmol/mol磷脂）；Ii為待測物質(zhì)的積分換算值；103為換算系數(shù)；IFA為總脂肪酸的積分換算值。相應(yīng)氧化產(chǎn)物的δ分配見表1。

表1 蛋黃磷脂主要酰基與氧化產(chǎn)物在CDCl3中1H NMR信號的δ分配和多重峰種類Table 1 Chemical shift distribution and multiple peak types of 1H NMR signals of main acyl groups and oxidation products of egg yolk phospholipids in CDCl3

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋黃磷脂氧化前后成分分析

表2 酶促氧化前后蛋黃磷脂成分含量Table 2 Change in purity of egg yolk phospholipids before and after enzymatic oxidation

從表2可以看出，蛋黃磷脂中PC最多，PE其次。其中，新鮮蛋黃磷脂中含有（80.02±0.76）%的PC和（14.37±0.54）%的PE，這與文獻(xiàn)[27]中蛋黃磷脂PC（78%）和PE（18%）的含量一致。不同來源蛋黃磷脂中PC含量會有波動(dòng)，高PC含量的蛋黃卵磷脂大于90%，甚至大于95%，而低PC含量的蛋黃卵磷脂為68%～80%[28]。

圖1 空白組（a）和實(shí)驗(yàn)組2（b）蛋黃磷脂成分的31P NMR譜圖Fig. 1 31P NMR spectra of egg yolk phospholipids in blank group (a) and experimental group II (b)

對比圖1a和b可以發(fā)現(xiàn)，氧化后，蛋黃磷脂的成分發(fā)生了變化。由表2可知，酶促氧化后測得的蛋黃磷脂組分中，PC和PE含量均發(fā)生下降，這是因?yàn)檠趸瘯r(shí)，磷脂上的大量不飽和脂肪?；碾p鍵容易被自由基攻擊。另外，酶促氧化后，蛋黃磷脂產(chǎn)生了LPE的峰（圖1），LPC含量增加（表2），說明酶解反應(yīng)增加了溶血性磷脂的含量。LPC來源于磷脂酶A2作用下PC的裂解：磷脂酶A2能夠特異性水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵，從而產(chǎn)生溶血性磷脂[29-30]。磷脂酶存在于動(dòng)物和植物體內(nèi)，推測其可能有兩個(gè)來源：來自于實(shí)原材料雞蛋本身或來源于LOX。

2.2 蛋黃磷脂氧化前后主要酰基變化分析

圖2 空白組和實(shí)驗(yàn)組2蛋黃磷脂的1H NMR譜圖（δ 0.5～5.5）Fig. 2 1H NMR spectra of egg yolk phospholipids in blank group and experimental group II (δ 0.5-5.5)

由圖2可以看出，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組2脂肪酸?；姆鍍H有略微變動(dòng)，無明顯的改變。由表3可知，對比空白組，在水浴加熱氧化或酶促氧化后，蛋黃磷脂的不飽和脂肪酸相對物質(zhì)的量均下降，而飽和脂肪酸的相對物質(zhì)的量均上升。這是因?yàn)椴伙柡碗p鍵極不穩(wěn)定，加熱會使碳碳雙鍵發(fā)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成氫過氧化物，而LOX催化氧氣插入含有一個(gè)(1Z,4Z)-戊二烯部分的脂肪酸使其過氧化，最終斷裂生成小分子的醇、醛、酮或環(huán)氧化物。

表3 6 組蛋黃磷脂樣品中各種脂肪酸的相對物質(zhì)的量Table 3 Molar percentages of fatty acids in six egg yolk phospholipid samples

由表3可知，與空白組相比，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的亞油酸相對物質(zhì)的量都有明顯下降，說明在氧化條件下，蛋黃磷脂中的亞油酸均發(fā)生了劇烈的氧化降解反應(yīng)，并生成氫過氧化物。pH 6酶促氧化蛋黃磷脂（實(shí)驗(yàn)組2）含有的亞油酸相對物質(zhì)的量為（14.21±0.81）%，小于僅水浴加熱蛋黃磷脂（實(shí)驗(yàn)組1）的亞油酸相對物質(zhì)的量，這是由于LOX特異性催化亞油酸的雙鍵，并且亞油酸是在磷脂中占比最高的多不飽和脂肪酸。pH 6和pH 9酶促氧化后水浴加熱蛋黃磷脂（實(shí)驗(yàn)組4和5）含有的油酸相對物質(zhì)的量均小于僅酶促氧化的樣品（實(shí)驗(yàn)組2和3），說明氧化后單不飽和脂肪酸相對物質(zhì)的量呈先上升后下降的趨勢。這與單不飽和脂肪酸的峰的計(jì)算方式有關(guān)。在氧化初期，大量多不飽和脂肪酸的每個(gè)雙鍵存在氧化順序，含有單個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸衍生物大量生成，由于多不飽和脂肪酸相比單不飽和脂肪酸更易被氧化，油酸的降解速率小于多不飽和脂肪酸降解后生成含有單個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸衍生物的速率。

2.3 蛋黃磷脂氧化生成的一級氧化產(chǎn)物分析

先前的研究[31]表明LOX的氧化特異性隨反應(yīng)體系pH值的變化而變化：pH值在7.5以下時(shí)，LOX顯示9-LOX活性，而在較高pH值下，13-LOX活性占優(yōu)勢；但是在極酸和極堿條件下，幾乎檢測不到LOX的活性。因此pH 6.0～9.0是LOX的最適pH值范圍，pH 6時(shí)，酶催化產(chǎn)生9-氫過氧化物，而pH 9條件下會形成13-氫過氧化物。

圖3 蛋黃磷脂氧化生成一級氧化產(chǎn)物氫過氧化物的含量Fig. 3 Contents of hydroperoxide, the first oxidation product of egg yolk phospholipids

從圖3可以看出，蛋黃磷脂樣品氧化生成的氫過氧化物含量從多到少依次是實(shí)驗(yàn)組2＞實(shí)驗(yàn)組1＞實(shí)驗(yàn)組4＞實(shí)驗(yàn)組5＞實(shí)驗(yàn)組3＞空白組。LOX可以特異性催化氧化含有(1Z,4Z)-戊二烯系統(tǒng)的多不飽和脂肪酸。盡管氫過氧化物是不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，在沒有加熱等繼續(xù)劇烈氧化的條件下，反應(yīng)體系中也會盡可能地富集氫過氧化物，這也是pH 6酶促氧化磷脂（實(shí)驗(yàn)組2）生成氫過氧化物最多的原因之一。

實(shí)驗(yàn)組1盡管氧化也足夠強(qiáng)烈，但是由于沒有特異性催化的條件，生成的氫過氧化物極不穩(wěn)定，容易進(jìn)一步氧化降解。而實(shí)驗(yàn)組4是蛋黃磷脂樣品在pH 6的環(huán)境中并在酶促氧化的基礎(chǔ)上繼續(xù)加熱氧化，由于磷脂已經(jīng)被氧化且生成了較多氫過氧化物，氫過氧化物降解的速度大于產(chǎn)生的速度，因此氫過氧化物被進(jìn)一步消耗。實(shí)驗(yàn)組3產(chǎn)生的氫過氧化物極少，說明LOX在pH 9的條件下氫過氧化物的累積量不足以被1H NMR大量監(jiān)測到。這是因?yàn)閜H 9 是LOX的最適pH值[32]，在此條件下使得蛋黃磷脂較快地產(chǎn)生氫過氧化物后又被快速降解了。Therond等[33]通過LOX處理獲得相應(yīng)的氫過氧化物，而在磷脂濃度較低的情況下，發(fā)生了氫過氧化物的降解，可能與LOX反應(yīng)時(shí)間過長有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在監(jiān)測pH 6和pH 9條件下的兩種磷脂氧化反應(yīng)條件中使用了相同的時(shí)間（3 h），希望在pH 6條件下磷脂氧化得更加充分，從而產(chǎn)生更多的C9位氫過氧化物。實(shí)驗(yàn)組5在已經(jīng)被酶促氧化后，得到的氫過氧化物含量少于實(shí)驗(yàn)組1，可能是因?yàn)檩^長的酶促反應(yīng)時(shí)間導(dǎo)致pH 9條件下的氫過氧化物生成后再降解。實(shí)驗(yàn)組5比實(shí)驗(yàn)組3生成氫過氧化物多的原因是受到水浴加熱的影響而發(fā)生了熱氧化（自動(dòng)氧化）而并非來自于酶促氧化。由此可見，LOX可以在pH 6的條件下，特異性地催化蛋黃磷脂在C9位生成氫過氧化物。

圖4 蛋黃磷脂氧化前后的1H NMR譜圖Fig. 4 1H NMR spectra of egg yolk phospholipids before and after oxidation

由圖4所示，空白組的蛋黃磷脂在δ7.7～8.9之間幾乎沒有信號，而實(shí)驗(yàn)組4的磷脂在此區(qū)間內(nèi)有一個(gè)寬信號峰（信號L）。圖4d中還發(fā)現(xiàn)δ7.7～8.5處有許多小的單峰，有報(bào)道稱這可能是連接氫過氧化物的—OOH或—OH[34]，它的形成可能與加熱過程中接觸氧氣量不足有關(guān)[35]。而在δ5.5～6.5區(qū)間內(nèi)的信號峰表明，在磷脂未氧化時(shí)就產(chǎn)生了一些與—OOH或—OH相連的共軛二烯體系的信號。

2.4 蛋黃磷脂氧化生成的二級氧化產(chǎn)物分析

蛋黃磷脂被氧化后生成的一級產(chǎn)物不穩(wěn)定，很容易進(jìn)一步被氧化為多種類型的小分子化合物。有一些二級氧化產(chǎn)物具有不與其他物質(zhì)重疊的1H NMR光譜信號，可以用于定性和定量分析。由于磷脂中亞油酸C9位的特定氧化路徑可以用最終產(chǎn)物小分子醛類佐證，因此本研究主要對醛類物質(zhì)進(jìn)行分析。

由表1可知，從蛋黃磷脂1H NMR光譜中的δ9.2～10.6區(qū)域可以檢測出4種化合物。δ9.63處的雙重峰（信號M）為(Z,E)-2,4-二烯醛；δ9.75處（信號N）為正構(gòu)烷醛[36]；2個(gè)暫未定義的信號，一個(gè)在δ9.41處，另一個(gè)在δ10.53處（此峰猜測可能是羧酸類化合物）。Guillén等[37]在植物油的δ9～10區(qū)域內(nèi)也檢測出δ9.41這個(gè)信號，暫時(shí)把它認(rèn)定為單醛。

圖5 蛋黃磷脂氧化生成的二級氧化產(chǎn)物2,4-二烯醛和正構(gòu)烷醛的含量Fig. 5 Amounts of 2,4-diene aldehyde and n-alkanolaldehyde produced by the oxidation of egg yolk phospholipid samples

由圖5可知，在酶促氧化的樣品中，無論在pH 6還是pH 9條件下的磷脂（實(shí)驗(yàn)組2或3），均未檢測到醛類物質(zhì)。由于LOX特異性催化氧化含有(1Z,4Z)-戊二烯系統(tǒng)的多不飽和脂肪酸的區(qū)域[38]，在適當(dāng)酶活性、反應(yīng)時(shí)間不足的情況下，脂質(zhì)會盡可能地富集一級氧化產(chǎn)物。因此盡管氫過氧化物是中間產(chǎn)物且不穩(wěn)定，但極少會被繼續(xù)降解成小分子醛類。

通過酶促氧化后繼續(xù)熱氧化，可以將富集的氫過氧化物繼續(xù)分解成二級氧化產(chǎn)物。在實(shí)驗(yàn)組4中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了較多的(Z,E)-2,4-二烯醛信號（圖4c）。而在實(shí)驗(yàn)組5中并沒有發(fā)現(xiàn)(Z,E)-2,4-二烯醛，只發(fā)現(xiàn)了正構(gòu)烷醛，這是因?yàn)樵趐H 9時(shí)，蛋黃磷脂只產(chǎn)生13-氫過氧化物[39]。在課題組之前的研究中[5,40]氧化蛋黃磷脂時(shí)產(chǎn)生的2,4-二烯醛類主要是(Z,E)-2,4-癸二烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛，產(chǎn)生的正構(gòu)烷醛主要是己醛。2,4-癸二烯醛具有典型的油炸雞肉味，是油炸食品的特征風(fēng)味物質(zhì)，并且其氣味檢測閾值較低，因此添加到油炸類、肉類等食品中，對風(fēng)味有重大的貢獻(xiàn)。由此可以推測，在pH 6條件下，LOX催化蛋黃磷脂大量生成的(Z,E)-2,4-二烯醛類為(Z,E)-2,4-癸二烯醛；而在pH 9條件下生成的正構(gòu)烷醛為己醛。

3 結(jié) 論

將通過乙醇/正己烷/丙酮提取的蛋黃磷脂分別進(jìn)行95 ℃水浴加熱和LOX酶促氧化以及混合氧化。通過31P NMR對酶促氧化前后蛋黃磷脂的成分進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)氧化后磷脂的PC和PE含量均發(fā)生了下降，同時(shí)酶解反應(yīng)增加了溶血性磷脂的含量。通過1H NMR對6 組磷脂樣品進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)所有的氧化樣品中總不飽和脂肪酸相對物質(zhì)的量均下降，而飽和脂肪酸的相對物質(zhì)的量均上升，其中在pH 6酶促條件下，亞油酸的降解速率最快。LOX在pH 6條件下特異性氧化蛋黃磷脂能生成更多的氫過氧化物，在加熱后進(jìn)一步生成更多期望的風(fēng)味化合物(Z,E)-2,4-二烯醛，說明在LOX的作用下，蛋黃磷脂中亞油酸在C9位氧化更充分；而LOX在更有活性的pH 9條件下，由于酶促時(shí)間較長，蛋黃磷脂較快合成氫過氧化物后又發(fā)生降解，并且其主要在C13位發(fā)生氧化，因此在加熱后生成了更多的正構(gòu)烷醛。這些特性表明，LOX在適當(dāng)條件下可以控制蛋黃磷脂氧化的路徑進(jìn)而生成期望的風(fēng)味化合物，為食品風(fēng)味物質(zhì)前體的促進(jìn)生成提供了思路。