鳙魚(yú)頭湯中微/納膠粒的體外消化特性及加工條件的影響

林 柳，李曉朋，曹振海，陶寧萍,2,*，王錫昌,2，鄧尚貴

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000）

鳙魚(yú)頭含有豐富的必需氨基酸和脂溶性營(yíng)養(yǎng)素，且單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）可達(dá)到魚(yú)頭總脂肪酸的80%以上，遠(yuǎn)高于海水魚(yú)類(lèi)；同時(shí)，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）的含量可達(dá)其多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）總量的50%以上，是n-3 PUFA的優(yōu)質(zhì)來(lái)源[1]。受傳統(tǒng)飲食習(xí)慣的影響，鳙魚(yú)頭多以魚(yú)頭湯的形式食用。目前，關(guān)于湯品的研究主要集中于不同熬煮工藝對(duì)其營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味物質(zhì)溶出的影響[2-4]。隨著食品膠體認(rèn)知的深入，湯中微/納膠粒（micro/nano-sized colloidal particles，MNCPs）的形成過(guò)程、生物活性和藥用價(jià)值逐漸被關(guān)注。有研究表明[5-12]，熬煮過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)加熱、沸騰和浸提后，溶入到湯中的單分子物質(zhì)之間相互作用并自組裝形成MNCPs。湯中聚集物的藥用價(jià)值及生物活性也被報(bào)道：葛根芩連湯中的聚集物膠粒被證實(shí)具有抗糖尿病活性[9]；金槍魚(yú)頭湯中不同粒徑的MNCPs具有抗氧化能力[10]。然而，對(duì)湯中MNCPs的消化行為及生物利用度鮮有報(bào)道。

有研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，魚(yú)湯熬煮過(guò)程中，甘油三酯（triglyceride，TG）自組裝形成MNCPs，而糖、蛋白及磷脂等物質(zhì)包被在MNCPs外圍，構(gòu)成了MNCPs膜，在保護(hù)MNCPs的完整性上扮演著重要角色。在湯品加工成商品的過(guò)程中，鹽的加入一方面可增加蛋白水合作用，促進(jìn)乳化；另一方面可通過(guò)降低MNCPs膜間的靜電斥力，破壞MNCPs穩(wěn)定性[13-14]。此外，均質(zhì)給予的高速剪切力、對(duì)流撞擊等機(jī)械作用，可形成體積更小、膜比表面積更大的MNCPs，在靜電斥力和空間位阻作用下，進(jìn)一步形成更加穩(wěn)定的體系[4]。鹽和均質(zhì)對(duì)MNCPs和MNCPs膜原有結(jié)構(gòu)的改變，可能進(jìn)而影響其在胃腸道中的消化行為及生物可及性。因此，有必要探究MNCPs及MNCPs膜在消化過(guò)程中的修飾，以及其組成和結(jié)構(gòu)對(duì)脂質(zhì)生物可及性的影響。體外模擬胃腸道消化模型操作便捷、周期短、成本低和不受倫理限制，可以方便監(jiān)測(cè)消化過(guò)程中脂質(zhì)的物理化學(xué)變化。

本研究通過(guò)馬爾文粒度分析儀、光學(xué)顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡對(duì)各階段體外模擬胃腸消化后鳙魚(yú)頭湯（bighead carp head soup，BCHS）消化產(chǎn)物中MNCPs的形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行多角度表征，并分析MNCPs中脂質(zhì)的釋放探究不同加工條件下BCHS中MNCPs的物理變化及生物可及性，解析加鹽和均質(zhì)對(duì)MNCPs消化特性的影響，為MNCPs在人體吸收利用與烹調(diào)條件之間的相關(guān)性提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

30個(gè)真空包裝的杭州千島湖鳙魚(yú)頭（體質(zhì)量（0.96±0.03）kg、長(zhǎng)（19±1）cm、寬（13±1）cm）購(gòu)于淘寶店千島湖天然島，在24 h內(nèi)通過(guò)冷鏈運(yùn)抵上海海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，于-40 ℃下貯藏備用。大豆油 益海嘉里金龍魚(yú)糧油食品股份有限公司；食鹽（300 g/包）中國(guó)鹽業(yè)集團(tuán)有限公司。

十九烷酸、十九烷酸甲酯、37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；胃蛋白酶（比活力750 U/mg）、胰酶（比活力50 U/mg） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；尼羅紅、豬膽鹽、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液（mcilvaine buffer，MB） 上海麥克林生化科技有限公司；固綠FCF 美國(guó)Avanti Polar Lipids公司；載玻片 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；蓋玻片 江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2200紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司；Trace GC Ultra氣相色譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA集團(tuán)；SP-2560氣相色譜柱德國(guó)默克公司；MS600F倒置生物顯微鏡 上海名茲精密儀器有限公司；MS3000激光粒度分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；Spotlight 400傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)珀金埃爾默儀器有限公司；FD-1C-50+真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LSM710 NL0激光共聚焦顯微鏡 德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)公司；GYB60-6S高壓均質(zhì)機(jī) 上海東華高壓勻漿泵廠。

1.3 方法

1.3.1 BCHS的制備

參考Qian Xueli等[15]和樊馨怡[16]的方法熬煮BCHS：將鳙魚(yú)頭切成3 cm×3 cm×2 cm小塊，清洗干凈后晾干。將（20±1） g大豆油于120 ℃預(yù)熱30 s，加入（400±2）g魚(yú)塊油煎40 s，加入3.2 kg飲用水（魚(yú)∶水＝1∶8，m/m）在97 ℃熬煮30 min后，再在90 ℃下熬煮120 min，制得BCHS。加入0.5%（m/m）的食鹽到BCHS，制得加鹽BCHS（salted BCHS，SBCHS）。將1 L SBCHS冷卻至室溫后于高壓均質(zhì)機(jī)（10～20 MPa）下均質(zhì)，重復(fù)兩次，制得均質(zhì)SBCHS（homogenous SBCHS，HSBCHS）。將制備完成的BCHS、SBCHS和HSBCHS分裝于150 mL的小瓶中待用。

1.3.2 體外消化模擬

1.3.2.1 消化液模擬液的配制

胃液模擬液（simulated gastric fluid，SGF）和腸液模擬液（simulated intestinal fluid，SIF）濃縮液的配制參考Minekus等[17]方法，見(jiàn)表1。

表1 SGF和SIF濃縮液的配制Table 1 Preparation of SGF and SIF

配制500 mL SGF：稱(chēng)取3.0 g胃蛋白酶溶解于375 mL SGF濃縮液中，再加入0.25 mL 0.3 mol/L的CaCl2(H2O)2溶液和124.75 mL去離子水，用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 2.0。配制500 mL SIF：稱(chēng)取2.0 g胰酶和4.25 g膽鹽溶解于375 mL的SIF濃縮液中，加入1.0 mL 0.3 mol/L CaCl2(H2O)2和124 mL去離子水，用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0。

1.3.2.2 胃消化階段

用6 mol/L HCl溶液分別調(diào)節(jié)100 mL BCHS、SBCHS和HSBCHS樣品的pH值至（2.0±0.1），于37 ℃恒溫水浴鍋預(yù)熱10 min，隨后加入100 mL已預(yù)熱的模擬胃液消化液（37 ℃），放入37 ℃、120 r/min恒溫振蕩水浴鍋中振蕩2 h，定期取出胃消化后的樣品以備分析。

1.3.2.3 小腸消化階段

取100 mL胃消化后的樣品，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH（7.0±0.1），加入100 mL已預(yù)熱的模擬腸液消化液（37 ℃），放入37 ℃、150 r/min恒溫振蕩水浴鍋中振蕩2 h，用1 mol/L NaOH溶液滴定使混合體系的pH值維持在7.0±0.1，定期取出腸消化后的樣品以備分析。

1.3.3 MNCPs表征

1.3.3.1 MNCPs粒徑及粒徑分布測(cè)定

參考Zhang Ruojie等[18]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整：分別將BCHS、SBCHS、HSBCHS及其各階段消化產(chǎn)物樣品稀釋10 倍，在室溫下進(jìn)行測(cè)定。小腸消化產(chǎn)物的遮光度范圍為5%～15%，其他樣品的遮光度范圍為5%～10%。使用pH 7.0 0.2 mol/L PBS稀釋未經(jīng)消化及經(jīng)小腸消化后的樣品，使用pH 2.5 0.2 mol/L MB稀釋胃消化樣品。設(shè)置MNCPs折射率為1.460，分散相折射率為1.330。平均粒徑由表面積平均粒徑（D3,2）表示。

1.3.3.2 MNCPs形貌特征觀察

消化過(guò)程中每30 min收集一次樣品，用于顯微鏡觀察。取15 μL消化物于載玻片上，用倒置生物顯微鏡（50 倍目鏡）觀察胃腸道消化過(guò)程中MNCPs的形態(tài)變化。

1.3.3.3 MNCPs微觀結(jié)構(gòu)觀察

使用激光共聚焦顯微鏡分別觀察BCHS、SBCHS、HSBCHS及其各消化階段的樣品[19-20]。樣品染色（TG與蛋白質(zhì)混染）：將100 μL 42 μg/mL TG染色液尼羅紅（用丙酮配制）和10 μL 1 mg/mL蛋白質(zhì)染色液固綠FCF染色液（用水配制）添加到1 mL樣品中，渦旋振蕩1 min混合均勻后備用。取10 μL染色后的樣品于載玻片上，用蓋玻片固定后避光靜置10 min，使用63 倍油浸物鏡（數(shù)值孔徑1.4）成像。氬激光器的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，He-Ne激光器的激發(fā)波長(zhǎng)為543 nm。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

分別取20 mL BCHS、SBCHS、HSBCHS及其各消化階段的樣品于-80 ℃冰箱預(yù)凍24 h，放入凍干機(jī)36 h凍干，于干燥器中貯藏以備分析使用。

使用單點(diǎn)ATR模式采集紅外光譜，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描信號(hào)累加次數(shù)32次，以空氣為背景。利用Spectrum軟件對(duì)原始譜圖進(jìn)行基線校正，13 點(diǎn)平滑處理并按最大峰值進(jìn)行歸一化后，得到樣品的紅外光譜圖。

1.3.5 脂肪酸組成分析

1.3.5.1 樣品前處理

參考Folch等[21]的方法提取樣品中總脂肪：將20 mL樣品與400 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液混勻，于4 ℃冰箱中靜置24 h。加入10 mL 0.9% NaCl溶液（m/m），搖勻后在4 ℃下靜置分層，除去上層相，重復(fù)2～3次。收集并合并下層相，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃脫溶后，得到總脂肪。

稱(chēng)取0.08～0.1 g總脂于50 mL圓底燒瓶中，參考Zhang Jing等[22]的方法對(duì)脂肪酸進(jìn)行甲酯化，并利用氣相色譜儀對(duì)脂肪酸組成和含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.2 氣相色譜分析

色譜柱：Agilent SP-2560毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；檢測(cè)器：火焰離子化檢測(cè)器；升溫程序：起始溫度70 ℃，以50 ℃/min升至140 ℃，保持1 min，4 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，3 ℃/min升至225 ℃，保持30 min；汽化室溫度250 ℃；載氣氮?dú)?；柱流? mL/min；分流比45∶1；進(jìn)樣量1 μL。

分別按下式計(jì)算胃腸消化后BCHS、SBCHS和HSBCHS樣品中總脂肪酸（total fatty acid，TFA）、飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）、不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）、MUFA和多PUFA的脂肪酸釋放率：

式中：m0為消化前樣品中脂肪酸含量/g；m1為經(jīng)胃腸消化后樣品中脂肪酸含量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 處理方式對(duì)各消化階段BCHS中MNCPs粒徑及其分布變化的影響

圖1 各消化階段的BCHS（A）、SBCHS（B）和HSBCHS（C）圖Fig. 1 Photos of BCHS (A), SBCHS (B) and HSBCHS (C) at each digestion stage

如圖1所示，經(jīng)加鹽和均質(zhì)后，未消化的3種BCHS的外觀并無(wú)顯著變化，均為均一穩(wěn)定的乳白色液體。由圖2可知，未消化的3種BCHS中均存在著從納米到微米級(jí)的MNCPs。在未消化階段，BCHS與SBCHS均呈現(xiàn)多峰分布狀態(tài)，但SBCHS右側(cè)峰的高度相較于BCHS更低并整體向左靠攏。結(jié)合圖3可知，未消化SBCHS中MNCPs的D3,2減小了0.42 μm，其原因是NaCl提高了蛋白質(zhì)的水合作用，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)和脂肪之間的結(jié)合，促進(jìn)了湯中脂滴的乳化[13]。進(jìn)一步均質(zhì)后，未消化HSBCHS的D3,2降低為0.507 μm，且粒度分布更集中，但同樣沒(méi)有呈現(xiàn)單峰分布；這可能是由于高壓均質(zhì)破壞了湯中MNCPs原本穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并重新排布，而湯中的蛋白不足以將剪切形成的細(xì)微的MNCPs包裹完全，導(dǎo)致相鄰的MNCPs間吸引力大于排斥力，進(jìn)而聚集。

圖2 未消化（A）、胃消化（B）、腸消化（C）不同處理BCHS樣品的粒徑分布圖Fig. 2 Particle size distribution of BCHS samples with different treatments before digestion (A), after gastric digestion (B), and after gastrointestinal digestion (C)

圖3 各消化階段BCHS、SBCHS和HSBCHS的D3,2Fig. 3 D3,2 of BCHS, SBCHS and HSBCHS at each digestion stage

經(jīng)胃消化后，3種BCHS均出現(xiàn)了明顯的相分離，主要為最上面的油層，中間細(xì)軟的絮凝層以及下面伴有少量絮凝物的水相（圖1）；MNCPs粒徑分布由原來(lái)的多峰分布逐漸趨向于單峰正態(tài)分布（圖2），且D3,2極顯著增大（P＜0.01）（圖3），表示MNCPs發(fā)生了明顯的聚集性行為。這是由于胃蛋白酶的作用降解了MNCPs膜上的部分蛋白，使MNCPs原本穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，MNCPs間的斥力降低，膠粒之間發(fā)生聚集。另外，胃中的酸性條件，改變了湯中原有體系的pH值，使未消化完全的蛋白質(zhì)發(fā)生絮凝。由圖2、3可知，胃消化BCHS與SBCHS粒徑分布的峰形更相似，而HSBCHS的粒徑分布則更集中，且D3,2極顯著大于BCHS與SBCHS（P＜0.01）。

經(jīng)小腸消化后，3種BCHS中絮狀物消失并形成肉眼可見(jiàn)的不溶性復(fù)合物（圖1），MNCPs的粒徑明顯增大，峰向右偏移。原有粒徑范圍內(nèi)的膠粒明顯減少，表示湯中大部分MNCPs已被消化。生成的大粒徑（100～1 000 μm）膠粒，可能是小腸消化形成的不溶性膽鹽復(fù)合物，其次是消化液中的Ca2+與小腸消化過(guò)程中釋放出來(lái)的脂肪酸結(jié)合，形成的不溶性皂鈣。由圖3可知，整個(gè)消化過(guò)程中3種BCHS中MNCPs的D3,2變化趨勢(shì)相似，均表現(xiàn)為先增大后減小且大于消化前。

2.2 處理方式對(duì)各消化階段BCHS中MNCPs形貌特征變化的影響

如圖4所示，3種未消化的BCHS中均可觀察到大小不一且邊緣完整的球形膠粒并均勻分散于湯中；其中，HSBCHS中MNCPs的數(shù)量明顯增加且尺寸明顯減小，這與粒徑結(jié)果一致。胃消化過(guò)程中，MNCPs主要表現(xiàn)為聚集性行為，且加鹽和均質(zhì)未改變MNCPs在整個(gè)胃消化過(guò)程中的形態(tài)變化規(guī)律，但在不同消化節(jié)點(diǎn)仍存在差異，特別是HSBCHS：胃消化前10 min膠粒的變化最為顯著，MNCPs間不斷靠攏，脂滴發(fā)生融合，膠粒變大；胃消化10 min時(shí)，BCHS中部分MNCPs聚集體的中心已觀察不到完整的球形膠粒，但邊緣依然凹凸不平，顯示為半球形，而SBCHS的聚集物中還可觀察到完整的球形膠粒。與BCHS和SBCHS具有明顯差別的是，HSBCHS中的MNCPs同樣發(fā)生聚集，但并未出現(xiàn)大的脂滴聚集體，而是以小膠粒的成團(tuán)形式存在。在后續(xù)的消化過(guò)程中，膠粒不斷融合；胃消化20 min時(shí)，BCHS中已經(jīng)能夠觀察到邊緣完整的大粒徑球形膠粒，而SBCHS無(wú)明顯變化；胃消化30 min時(shí)，SBCHS的聚集體中心已觀察不到與未消化樣品相同粒徑的MNCPs存在，但邊緣依然凹凸不平，未完全融合。胃消化60 min后，BCHS和SBCHS中脂滴形態(tài)無(wú)顯著變化，并且在胃消化結(jié)束時(shí)，聚集體邊緣變得光滑，形狀變得完整；相較于BCHS與SBCHS，HSBCHS雖然同樣形成了大的脂滴，但是依然存在廣泛的細(xì)小膠粒物在聚集物的周?chē)騿为?dú)存在，這是由于均質(zhì)處理使脂滴破散，原本膜上的蛋白質(zhì)不足以包被新形成的MNCPs，因此湯中原本分散的蛋白質(zhì)以及表面活性物質(zhì)重新吸附到界面，構(gòu)成新的膜結(jié)構(gòu)，增加了膠粒穩(wěn)定性。

小腸消化過(guò)程中，MNCPs聚集物在胰酶的作用下，膜結(jié)構(gòu)被完全破壞，MNCPs聚集體裂解。如圖5所示，小腸消化到30 min時(shí)，BCHS與SBCHS中的膠粒已變得不規(guī)整，邊緣開(kāi)始破裂（如箭頭所示）；HSBCHS中膠粒的裂解速度更快，已可觀察到明顯的破散（如方框所示）。小腸消化到60 min時(shí)，在膽鹽的作用下脂滴的表面張力進(jìn)一步降低，發(fā)生明顯乳化并形成細(xì)微的乳滴，但這些微滴并未完全散開(kāi)，依然成團(tuán)存在。小腸消化結(jié)束時(shí)，大部分脂滴消失，但仍可觀察到較大的聚集物以及零星存在的小膠粒物；相較于BCHS，SBCHS中觀察到細(xì)微的膠粒物更為分散且數(shù)量更多，HSBCHS中的聚集體則更小。這些依然存在的聚集體可能是未消化完全的脂滴，也可能是膽鹽與磷脂，單甘脂或脂肪酸等形成的含脂聚集體。

圖4 BCHS（A）、SBCHS（B）和HSBCHS（C）中MNCPs在胃消化階段的光學(xué)顯微鏡圖Fig. 4 Optical micrographs of MNCPs in BCHS (A), SBCHS (B) and HSBCHS (C) during gastric digestion

圖5 BCHS（A）、SBCHS（B）和HSBCHS（C）中MNCPs在腸消化階段的光學(xué)顯微鏡圖Fig. 5 Optical micrographs of MNCPs in BCHS (A), SBCHS (B) and HSBCHS (C) during intestinal digestion

2.3 處理方式對(duì)各消化階段BCHS中MNCPs微觀結(jié)構(gòu)變化的影響

進(jìn)一步觀察MNCPs在胃腸消化過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的變化，驗(yàn)證光學(xué)顯微鏡的結(jié)果。如圖6所示，未消化的各處理BCHS樣品中，TG（紅色探針）自組裝形成MNCPs，蛋白質(zhì)與MNCPs外圍的脂質(zhì)分子結(jié)合共同構(gòu)成MNCPs雙層膜，同時(shí)使MNPs之間的靜電斥力增大，從而抑制MNCPs之間的聚集作用，使MNCPs以單獨(dú)的球形膠粒均勻分布于湯中，這與已報(bào)道的研究一致[23-24]。從SBCHS中觀察到部分MNCPs粒徑變大的現(xiàn)象且MNCPs中間可以明顯觀察到蛋白質(zhì)的存在；可能是由于局部鹽濃度過(guò)高，NaCl通過(guò)降低膠粒表面的靜電排斥作用，使膠粒之間相互吸附形成了粒徑較大的膠粒，并將湯中存在的水溶性蛋白膠?；騇NCPs膜上的蛋白包裹其中。經(jīng)物理破碎后，從HSBCHS中觀察到MNCPs的尺寸更小且分布更廣，其原因可能是經(jīng)物理剪切后，湯中蛋白質(zhì)和膽固醇等類(lèi)脂成分作為表面活性劑參與構(gòu)成新的MNCPs膜，穩(wěn)定了MNCPs結(jié)構(gòu)，這與粒徑和光學(xué)顯微鏡的結(jié)果一致。與未消化相比，3種BCHS經(jīng)模擬胃腸消化后脂滴的大小以及分散程度存在明顯差異。

圖6 BCHS（A）、SBCHS（B）和HSBCHS（C）中MNCPs在各消化階段的激光共聚焦圖像Fig. 6 Laser confocal images of MNCPs in BCHS (A), SBCHS (B) and HSBCHS (C) during the entire digestion process

由圖6可知，經(jīng)胃消化后，蛋白質(zhì)凝塊裂解，圓環(huán)消失，中心包裹的TG被釋放并聚集，形成TG聚集物。MNCPs的聚集主要是由于膜蛋白被胃蛋白酶分解，其次是模擬胃液中的酸性環(huán)境以及高離子濃度，使原本穩(wěn)定的MNCPs膜受損，TG暴露，膠粒發(fā)生聚集[25-26]。同時(shí)，還可觀察到HSBCHS的聚集物最小，這也與光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果一致。值得注意的是，胃消化完成后，還可觀察到結(jié)構(gòu)完整的球形膠粒，HSBCHS中最為明顯。有研究表明牛乳以及羊乳脂肪球在胃消化完成后，也觀察到部分乳脂肪球結(jié)構(gòu)依然完整，探究發(fā)現(xiàn)主要是由于其外圍所包被的磷脂未被消化，依然以圓環(huán)的形式包裹著脂滴，使得脂肪球的結(jié)構(gòu)依然穩(wěn)定未發(fā)生明顯變化，在保護(hù)乳脂肪球的完整性上扮演著重要角色[27-28]。已有研究表明[23-24]，湯中MNCPs的膜上同樣存在磷脂等物質(zhì)。因此在胃消化階段，MNCPs膜上磷脂以及糖等物質(zhì)在保護(hù)MNCPs的完整性上起重要作用。而HSBCHS中保持原有狀態(tài)的膠粒較多，可能是均質(zhì)后MNCPs表面積增加，原有的膜不能將新形成的MNCPs全部包裹，湯中的蛋白和磷脂等表面活性物質(zhì)吸附到新形成的界面上，新形成的MNCPs膜上所含的磷脂比其在熬煮過(guò)程中形成的MNCPs膜上的多，因此胃消化后HSBCHS中MNCPs所含膜結(jié)構(gòu)的完整性?xún)?yōu)于BCHS與SBCHS。

此外，在3種BCHS的胃消化產(chǎn)物中，還可觀察到未消化的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)位置的改變，部分蛋白質(zhì)由原來(lái)以圓環(huán)的形式分布在MNCPs外圍轉(zhuǎn)移到了脂滴的中心，如箭頭所示。蛋白質(zhì)未被完全降解的原因主要有3個(gè)：1）部分蛋白質(zhì)由于高度糖基化不能被胃蛋白酶分解，或胃蛋白酶對(duì)部分蛋白質(zhì)不起作用，需要進(jìn)一步在小腸中通過(guò)胰蛋白酶才能被降解[29-31]。2）經(jīng)過(guò)胃消化過(guò)程后，脂滴重新排布并發(fā)生聚集，蛋白質(zhì)在聚集過(guò)程中，被包裹在脂滴內(nèi)部，阻斷了蛋白質(zhì)與胃蛋白酶之間的接觸。3）消化過(guò)程中pH值的波動(dòng)降低了胃蛋白酶的活性，使其酶解能力變?nèi)?。?dāng)胃消化產(chǎn)物進(jìn)入小腸后，膽鹽附著在脂滴周?chē)?，置換了MNCPs膜上的磷脂與蛋白質(zhì)等物質(zhì)，使脂肪球變成微乳，增大脂滴與胰脂肪酶以及輔脂酶的接觸面積，促進(jìn)脂質(zhì)消化。同樣，可觀察到胃中未消化的蛋白質(zhì)會(huì)在胰蛋白酶的作用下進(jìn)一步水解。由圖6可知，經(jīng)小腸消化后，消化產(chǎn)物中依然存在著紅色熒光區(qū)域并伴隨有黑色孔洞，但其邊緣模糊。這可能來(lái)自于未消化完全的MNCPs，或者區(qū)別于原本的MNCPs，是由膽鹽、磷脂、脂解產(chǎn)物以及未降解的TG形成的含脂絮凝物。

2.4 不同處理方式各消化階段BCHS中MNCPs的紅外圖譜分析

如圖7所示，未消化的BCHS、SBCHS和HSBCHS在3 288、2 924、2 854、1 745、1 645、1 546、1 453、1 399、1 382、1 237 cm-1等波數(shù)附近出現(xiàn)明顯特征峰，進(jìn)一步說(shuō)明，3種BCHS中的組成物質(zhì)相似，加鹽與均質(zhì)處理并未改變湯中的物質(zhì)組成。其中，2 924、2 854、1 745 cm-1波數(shù)附近出現(xiàn)的明顯吸收峰主要是由脂肪中—CH3、—CH2—的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)以及C＝O對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)所引起。圖7中3 288 cm-1處的N—H鍵的伸縮振動(dòng)、1 645 cm-1處的C＝O伸縮振動(dòng)、1 546 cm-1處的N—H帶結(jié)合C—N伸縮振動(dòng)、1 453 cm-1處的—CH2—彎曲振動(dòng)、1 399 cm-1處的—COO—對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)、1 237 cm-1處的N—H和C—H彎曲振動(dòng)、甘氨酸殘基的—CH2—特征振動(dòng)，主要貢獻(xiàn)物質(zhì)為蛋白質(zhì)。

經(jīng)胃消化后，3種BCHS中MNCPs的峰型基本保持不變，表明湯中的整體物質(zhì)并未發(fā)生明顯改變。小腸消化后，紅外圖譜變化明顯，在1 300～1 200 cm-1（主要為酰胺III帶）以及1744 cm-1（主要為脂肪羰基以及TG）波數(shù)附近均未出現(xiàn)明顯吸收峰，表明經(jīng)小腸消化后，部分蛋白質(zhì)和脂質(zhì)已完全降解。羧酸鹽的特征基團(tuán)（—COO—）中，C—O的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)在1 420～1 300 cm-1，因此推測(cè)小腸消化后，BCHS、SBCHS和HSBCHS在該波數(shù)段出現(xiàn)的明顯吸收峰（紅色圓圈所示），可能來(lái)自于消化過(guò)程中產(chǎn)生的游離脂肪酸與溶液中Na+、Ca2+等生成的羧酸鹽。

圖7 未消化（A）、胃消化（B）、腸消化（C）不同處理BCHS樣品的紅外光譜圖Fig. 7 Infrared spectra of BCHS samples with different treatments before digestion (A), after gastric digestion (B), and after gastrointestinal digestion (C)

2.5 消化后不同處理方式BCHS中MNCPs脂肪酸的釋放分析

從圖8A可以看出，SBCHS的TFA釋放率相較于BCHS極顯著降低（P＜0.01），原因可能是脂解消化作為界面反應(yīng)，一方面加鹽后湯中Na+濃度增加，促進(jìn)其與膜上脂肪酸形成不溶性皂[32]；而小腸中膽鹽、脂肪酸等作為負(fù)電性成分，與Cl-發(fā)生靜電排斥，兩種離子均影響脂肪酶在MNCPs膜上聚集，致使脂肪酸的釋放率降低。進(jìn)一步均質(zhì)處理后，HSBCHS的TFA釋放率相較于SBCHS提高約3%；HSBCHS的SFA的釋放率高于BCHS，但二者之間無(wú)極顯著差異（P≥0.01）。均質(zhì)機(jī)械力作用下，生成的小粒徑MNCPs，直接影響油水界面處脂肪酶的有效作用位點(diǎn)數(shù)量，在一定程度上彌補(bǔ)了加鹽后湯中部分脂肪酸釋放率的降低。

由圖8B～D可知，3種BCHS釋放的脂肪酸種類(lèi)一致，均為8種SFA、6種MUFA以及9種PUFA，但每種類(lèi)型脂肪酸的釋放率各有不同。值得注意的是，C20:5（EPA）與C22:6（DHA）是兩種重要的n-3 PUFA，對(duì)人體健康具有重要的生理功效。由圖8D可知，SBCHS的EPA和DHA的釋放率相較于BCHS均明顯降低，然而進(jìn)一步均質(zhì)處理后，EPA和DHA的釋放率分別提高約29.1%和34.8%，推測(cè)一方面為均質(zhì)后增加了酶解反應(yīng)的位點(diǎn)，另一方為SFA和MUFA作為較弱的負(fù)電組分結(jié)合于MNCPs膜表面，從而促進(jìn)了具有更多雙鍵結(jié)構(gòu)的EPA和DHA的釋放。

圖8 胃腸消化后BCHS、SBCHS和HSBCHS中MNCPs的脂肪酸釋放率Fig. 8 Percentage of fatty acids released from MNCPs in BCHS,SBCHS and HSBCHS after gastrointestinal digestion

3 結(jié) 論

通過(guò)體外模擬胃腸道消化模型從不同消化階段消化產(chǎn)物的表征以及脂質(zhì)的消化情況等角度探究BCHS中MNCPs的消化特性以及加鹽和均質(zhì)對(duì)其消化特性的影響。結(jié)果表明，3種BCHS在消化過(guò)程中的整體變化趨勢(shì)相似。在胃消化過(guò)程中，MNCPs均表現(xiàn)為膜上蛋白質(zhì)降解后，MNCPs之間融合，粒徑增大，即MNCPs的聚集性行為；在小腸消化過(guò)程中，經(jīng)膽鹽和胰酶作用，脂滴破散，表現(xiàn)為MNCPs聚集體的裂解。加鹽和均質(zhì)未改變MNCPs在胃腸消化過(guò)程中的整體變化趨勢(shì)，但相同階段依然存在差異。通過(guò)對(duì)消化產(chǎn)物的表征發(fā)現(xiàn)，加鹽后，SBCHS中MNCPs的D3,2均減小，但仍存在部分破乳現(xiàn)象，使膠粒之間相互吸附發(fā)生聚集，部分蛋白質(zhì)被包裹其中，同時(shí)，加鹽增加了MNCPs的穩(wěn)定性，降低脂肪酸釋放率。進(jìn)一步均質(zhì)后，HSBCHS中MNCPs的D3,2進(jìn)一步減小，改變了原有的膜結(jié)構(gòu)，MNCPs重新排布，增加了MNCPs中脂質(zhì)和胰酶之間的接觸位點(diǎn)，促進(jìn)脂肪酸的釋放。綜上所述，在胃消化階段胃蛋白酶對(duì)MNCPs界面穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)的破壞是MNCPs消化的前提，并且均質(zhì)處理在一定程度上彌補(bǔ)了加鹽后湯中部分脂肪酸釋放率的降低。