傳統(tǒng)發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群和理化性質(zhì)變化

田星 趙邯 王浩東 任銳 李宗軍

摘 要：研究添加戊糖片球菌、木糖葡萄球菌（1∶1）復合發(fā)酵劑的發(fā)酵肉與自然發(fā)酵肉成熟過程中的微生物菌群、理化性質(zhì)及質(zhì)構品質(zhì)變化。結果表明：在成熟過程中，添加發(fā)酵劑的發(fā)酵肉（實驗組）與自然發(fā)酵肉（對照組）相比，酵母菌和腸肝菌數(shù)量無顯著差異，而細菌菌落總數(shù)、乳酸菌、葡萄球菌數(shù)量均有顯著差異（P<0.05）;且實驗組發(fā)酵肉的最終pH值、水分含量、亞硝酸鹽含量等理化指標均低于對照組，質(zhì)構指標均優(yōu)于對照組;添加發(fā)酵劑的發(fā)酵肉在微生物菌群多樣性和風味品質(zhì)等方面均明顯優(yōu)于自然發(fā)酵肉。

關鍵詞：發(fā)酵肉;微生物菌群;成熟過程;理化性質(zhì)

Abstract： In this paper， we analyzed the changes in the microbial flora and physicochemical properties of naturally fermented meat （control） and meat fermented with a mixture of Pediococcus pentosaceus and Staphylococcus xylose （1：1） during the fermentation process. According to the results， there was a significant difference in yeast and enterobacteriaceae counts （P < 0.05） but not in total bacterial， lactic acid bacterial or Staphylococcus counts between the natural and inoculated fermentations. The pH value， moisture and nitrite content of inoculated meat at the end of fermentation were lower than those of the control， while the former was superior to the latter in texture parameters as well as microbial community diversity and flavor quality.

Keywords： fermented meat; microbial flora; ripening process; physicochemical properties

發(fā)酵肉制品是指在自然和人工控制條件下利用微生物發(fā)酵作用，產(chǎn)生具有特殊風味、色澤和質(zhì)地且具有較長保存期的肉制品[1]。作為一種古老的肉制品加工貯藏方法，發(fā)酵使肉制品具有獨特的風味和良好的咀嚼性，發(fā)酵肉制品深受廣大消費者喜愛[2]。發(fā)酵肉制品在生產(chǎn)過程中接種的微生物（如乳酸菌、微球菌等）能夠發(fā)酵糖類物質(zhì)形成乳酸[3-5]，從而賦予肉制品特殊的風味，同時，通過產(chǎn)生乳酸降低pH值提高肉制品的安全性、穩(wěn)定性及貨架期[6-8]。此外，發(fā)酵劑的使用對降低肉制品中亞硝酸鹽含量也有一定作用[9]。Nie Xiaohua等[10]研究表明，復合發(fā)酵劑能夠加快蛋白質(zhì)降解，增加風味氨基酸的含量。趙麗華等[11]研究戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）與混合發(fā)酵劑（植物乳桿菌和產(chǎn)香葡萄球菌（Staphylococcus carnosus））對羊肉干發(fā)酵香腸品質(zhì)的影響，結果表明，戊糖片球菌能使香腸pH值和水分活度下降。另外，發(fā)酵肉制品通過微生物發(fā)酵而創(chuàng)造的低pH值環(huán)境有利于提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，保存產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和品質(zhì)特性[12]?？傊?，國內(nèi)外研究表明，添加發(fā)酵劑可以有效改善香腸的品質(zhì)及貯藏性，提高其食用安全性，且無毒無害，口味適中，迎合了消費者需求，體現(xiàn)了以人為本的生產(chǎn)理念，具有實用價值[13]。隨著對于發(fā)酵肉制品研究的不斷深入，發(fā)酵肉制品成熟過程微生物菌群變化與其品質(zhì)的關系有待進一步明晰。

發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群和理化性質(zhì)的變化不盡相同。本研究以同一批次的新鮮優(yōu)質(zhì)豬里脊肉為原料，研究添加戊糖片球菌、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）的發(fā)酵肉與自然發(fā)酵肉成熟過程中的微生物菌群、理化性質(zhì)及質(zhì)構品質(zhì)變化，為提高發(fā)酵肉制品安全提供理論指導和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮優(yōu)質(zhì)豬里脊肉 偉鴻食品股份有限公司;52°高度白酒、食鹽、味精、白糖 長沙嘉而惠超市。

戊糖片球菌 中國科學科院微生物保藏中心;木糖葡萄球菌 傳統(tǒng)湘西臘肉中分離獲取。

MRS培養(yǎng)基、平板計數(shù)培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、馬丁孟加拉紅-鏈霉菌瓊脂培養(yǎng)基、結晶紫中性膽堿鹽培養(yǎng)基? ?廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、乙酸鋅、氨水、醋酸鉛、硫酸鈉、氯化鈉、酚酞、鉻酸鉀、硝酸銀（均為分析純）? ?天津市化學試劑一廠。

1.2 儀器與設備

K9860全自動凱式定氮儀、SH220F石墨消解儀

山東海能科學儀器有限公司;CP114分析天平 奧豪斯儀器有限公司;Testo 250 pH計、LabTech分光光度計

北京萊伯泰科儀器有限公司;D2S2-LJ080高壓滅菌鍋 山東新醫(yī)療器械股份有限公司;GZ-250-HSII恒溫恒濕箱

廣智科技設備有限公司;101-3HB干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;TG16-WS離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;SKY-2102C搖床 上海浦東生物光學儀器廠;SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;GZ-250-HSII電熱恒溫水浴鍋 廣東省韶關市廣智科技設備有限公司;GJB1-25均質(zhì)機 江蘇省金壇市榮華儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

實驗分為2 組，其中1 組添加戊糖片球菌、木糖葡萄球菌（按照體積比1∶1將已活化好菌株濃度為108 CFU/g的發(fā)酵劑菌液添加到原料肉中，并與其他輔料充分混合）的發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵肉，另1 組自然發(fā)酵，作為對照組。分別于生肉，腌制1、2 d以及成熟過程中每隔5 d取樣，分別檢測樣品菌落總數(shù)、腸桿菌、乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌數(shù)量的變化，并對其pH值、水分含量、亞硝酸鹽殘留量、食鹽含量等理化指標和質(zhì)構指標進行測定。各取樣點樣本的微生物指標直接測定，其余樣本真空包裝。

1.3.2 發(fā)酵劑的制備

取適量已活化的戊糖片球菌和木糖葡萄球菌菌種，分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基和MSA液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，將已活化好的菌株濃度為108 CFU/g的發(fā)酵劑菌液按照肉質(zhì)量的1%添加到原料肉中并與其他輔料充分混合，進行腌制。

1.3.3 發(fā)酵肉的制作

發(fā)酵肉制作過程中腌制輔料包括食鹽3%、白糖0.7%、味精0.3%、高度白酒2%、亞硝酸鈉0.008%。發(fā)酵肉制作工藝流程如圖1所示。

1.3.4 微生物指標測定

取不同階段的發(fā)酵肉，在無菌超凈臺中用刀切碎，取25 g置于含有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，封口后于搖床中振蕩40 min，取1 mL上清液于含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，進行加倍遞增稀釋，分別稀釋至10-3、10-4、10-5，每個稀釋度做3 個平行，用培養(yǎng)基培養(yǎng)。

菌落總數(shù)測定：采用PCA平板，37 ℃培養(yǎng)48 h;葡萄球菌菌數(shù)測定：采用MSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h;乳酸菌菌數(shù)測定：采用MRS（加入100 mg/L放線菌酮）培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h;腸桿菌菌數(shù)測定：采用結晶紫中性膽堿鹽培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h;酵母菌菌數(shù)測定：采用馬丁孟加拉紅-鏈霉菌瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h。

1.3.5 理化指標測定

1.3.5.1 pH值參考GB/T 10468—1989《食品安全國家標準 食品中pH的測定》中的玻璃電極法。1.3.5.2 水分含量參考GB 5009.3—2010《食品安全國家標準 食品中水分的測定》，采用直接干燥法進行測定。將稱量瓶置于105 ℃的烘箱中烘至恒質(zhì)量（前后2 次質(zhì)量差不超過2 mg即為恒質(zhì)量）;稱取4 g攪碎的試樣，干燥3 h后取出，放入干燥器中冷卻0.5 h后稱質(zhì)量;重復以上操作至樣品恒質(zhì)量，每個樣品做3 次平行。

1.3.5.3 亞硝酸鹽殘留量 參考GB 5009.33—2010《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法。

1.3.5.4 食鹽含量 參考GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》中的間接滴定法。

1.3.6 質(zhì)構測定 切取厚度約為1 cm左右的肉片，放在質(zhì)構分析儀探頭下測定。測定參數(shù)：感應元量程450 N;測試高度15 mm;形變量50%;測試速率60 mm/min;起始力5 N;觸發(fā)類型：自動;探頭類型P50。

1.4 數(shù)據(jù)處理 每個樣本測定進行3 次重復實驗，并使用SPSS 24.0軟件進行t檢驗，P<0.05表示差異顯著，然后使用Excel軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵肉成熟過程中的微生物指標變化

2.1.1 發(fā)酵肉成熟過程中菌落總數(shù)的變化

小寫字母不同，表示同一發(fā)酵階段組間差異顯著（P<0.05）;大寫字母不同，表示同組不同發(fā)酵階段差異顯著（P<0.05）。圖3～8同。

由圖2可知，2 組發(fā)酵肉菌落總數(shù)勻呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，且在發(fā)酵前期，實驗組發(fā)酵肉菌落總數(shù)明顯較對照組下降快，在腌制第2天就已經(jīng)達到最低值5.69 （lg（CFU/g）），而對照組發(fā)酵肉在發(fā)酵第5天才達到最低值5.48 （lg（CFU/g））。這是由于在腌制過程中加入發(fā)酵劑能夠有效抑制雜菌的生長，并加速發(fā)酵進程[14]。

2.1.2 發(fā)酵肉成熟過程中葡萄球菌數(shù)量的變化

由圖3可知，2 組發(fā)酵肉的葡萄球菌數(shù)量呈現(xiàn)波動趨勢，即先下降再上升后又有所下降，且2 組存在顯著差異（P<0.05）。這是由于在腌制1 d時加入發(fā)酵劑使葡萄球菌數(shù)量突升，隨著發(fā)酵的進行，葡萄球菌數(shù)量因乳酸菌產(chǎn)酸的影響有所下降，之后由于水分含量的降低與鹽含量的增加，乳酸菌數(shù)量減少，葡萄球菌耐受性增加，導致葡萄球菌數(shù)量有所回升[15]。就對照組而言，隨著發(fā)酵的進行，葡萄球菌數(shù)量一直處于上升期，由此可以得出，在發(fā)酵肉的制作過程中葡萄球菌是優(yōu)勢菌種。

2.1.3 發(fā)酵肉成熟過程中乳酸菌數(shù)量的變化

由圖4可知，乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵時波動比較大，且在發(fā)酵0 d達到最低值。這是由于原料肉在屠宰、加工、運輸過程中與空氣及器皿的接觸使原料肉未腌制前的乳酸菌數(shù)量最高，而在腌制過程中隨著食鹽、發(fā)酵劑的加入，在一定程度上抑制了乳酸菌的生長，之后隨著耐受性的增強，乳酸菌數(shù)量逐漸上升，但發(fā)酵后期實驗組發(fā)酵肉鹽含量上升，乳酸菌數(shù)量又有下降趨勢[16-18]。在整個發(fā)酵過程中，乳酸菌一直是優(yōu)勢菌，通過競爭作用能有效抑制有害微生物的生長，同時一些乳酸菌能產(chǎn)生細菌素，抑制病原微生物，顯著提高產(chǎn)品的安全性[19-20]。

2.1.4 發(fā)酵肉成熟過程中腸桿菌數(shù)量的變化

由圖5可知，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵肉中腸桿菌數(shù)量逐漸下降，且實驗組低于對照組，說明發(fā)酵劑對腸桿菌的抑制效果明顯。但發(fā)酵結束后腸桿菌數(shù)量有上升趨勢，這是由于隨著發(fā)酵進程的結束，有害菌的耐受性增強，且在發(fā)酵進程中有益菌的分解產(chǎn)物被腸桿菌利用，因此腸桿菌數(shù)量在發(fā)酵后期有所增加。

2.1.5 發(fā)酵肉成熟過程中酵母菌數(shù)量的變化

酵母菌是兼性厭氧型菌，有氧氣存在時會大量繁殖，并且能夠生成蛋白酶和脂肪酶，這些對于發(fā)酵肉品質(zhì)有極大影響。由于原料肉以肉塊狀態(tài)進行腌制，在腌制過程中，隨著肉內(nèi)氧氣的消耗，酵母菌的生長受到限制，進行無氧呼吸，產(chǎn)生乳酸，限制雜菌的生長。

由圖6可知，在發(fā)酵中后期，由于發(fā)酵肉中葡萄球菌數(shù)量上升，葡萄球菌中蛋白酶的水解作用使肉制品結構松散，氧氣進入，酵母菌進行大量繁殖，分解產(chǎn)生大量小分子物質(zhì)，增加了發(fā)酵肉的風味品質(zhì)。

跟蹤檢測生肉，腌制1、2 d，發(fā)酵0、5、10、15 d樣本的微生物菌落變化，通過定量分析可知，發(fā)酵肉成熟過程中，實驗組與對照組的酵母菌和腸肝菌數(shù)量均無顯著差異，而菌落總數(shù)、乳酸菌和葡萄球菌數(shù)量有顯著差異（P<0.05）。

2.2 發(fā)酵肉成熟過程中的理化指標變化

2.2.1 發(fā)酵肉成熟過程中pH值的變化

在發(fā)酵肉成熟過程中，由于食鹽的加入會殺死部分乳酸菌，使pH值有所上升，但隨著發(fā)酵的進行，乳酸菌數(shù)量增加，產(chǎn)酸量增加，使pH值降低。

由圖7可知，在發(fā)酵第5天時，實驗組發(fā)酵肉pH值（5.66）達到最低，而對照組發(fā)酵肉pH值在開始發(fā)酵時就達到最低值。發(fā)酵后期，對照組發(fā)酵肉pH值上升較快，發(fā)酵結束時略高于實驗組。2 組發(fā)酵肉pH值回升的起始時間較早，且產(chǎn)品的最終pH值較高（6.09左右），這可能與添加的發(fā)酵劑和發(fā)酵溫度（低溫發(fā)酵）有關[21]。

2.2.2 發(fā)酵肉成熟過程中水分含量和食鹽含量的變化

由表1可知，發(fā)酵初期，2 組發(fā)酵肉水分含量持續(xù)下降，發(fā)酵結束時，實驗組水分含量為31.61%，對照組水分含量為40.15%，與原料肉相比水分流失高達30%以上。而實驗組的水分流失量明顯多于對照組，而發(fā)酵肉成品水分含量越低，對微生物的抑制能力越強，品質(zhì)越好。

發(fā)酵肉的食鹽含量隨著水分含量的下降呈現(xiàn)出上升趨勢。腌制過程中，隨著腌制時間的增加，發(fā)酵肉水分含量發(fā)生變化，食鹽含量也逐漸增加。而加入發(fā)酵劑后，食鹽含量相比于腌制結束時升高，這可能是由于菌種活化時，液體培養(yǎng)基內(nèi)殘留有氯化鈉。

發(fā)酵過程中，2 組發(fā)酵肉水分含量均明顯降低，而食鹽含量則明顯上升。并且，實驗組產(chǎn)品最終食鹽含量顯著高于對照組（P<0.05）。這也充分表明在初始時添加相同量食鹽的情況下，加入發(fā)酵劑的發(fā)酵肉成品中食鹽含量高于自然發(fā)酵肉，能夠更好地抑制有害菌生長，同時產(chǎn)品擁有更好的風味品質(zhì)，顯著提高了產(chǎn)品的安全性[22-24]。

2.2.3 發(fā)酵肉成熟過程中亞硝酸鹽含量的變化

在腌制第1天時亞硝酸鹽同發(fā)酵劑一同加入，加入量為80 mg/kg。由圖8可知，發(fā)酵前期對于亞硝酸鹽的消耗量較大，其作用為參與色澤的產(chǎn)生及抑制雜菌生長。而實驗組加入發(fā)酵劑對于亞硝酸鹽的消耗起促進作用，加速其消耗，從而使亞硝酸鹽含量減少。發(fā)酵后期，發(fā)酵肉亞硝酸鹽含量有所上升，且實驗組發(fā)酵肉的最終亞硝酸鹽含量顯著低于對照組（P<0.05）?？傮w來說，發(fā)酵肉亞硝酸鹽含量的變化與Essid等[17]的結果相一致，并且加入發(fā)酵劑能夠明顯抑制發(fā)酵后期亞硝酸鹽的形成，減少有毒有害物質(zhì)的生成，顯著提高產(chǎn)品的安全性[25-27]。

2.4 發(fā)酵肉成熟過程中的質(zhì)構變化

由表2可知，無論是硬度、彈性、咀嚼性還是內(nèi)聚性，實驗組發(fā)酵肉均明顯優(yōu)于對照組（P<0.05），說明在質(zhì)構品質(zhì)方面，相比自然發(fā)酵肉，加入發(fā)酵劑的發(fā)酵肉硬度、彈性、咀嚼性和口感更好。

3 結 論

通過研究發(fā)酵成熟過程中添加戊糖片球菌和木糖葡萄球菌復合發(fā)酵劑的發(fā)酵肉與自然發(fā)酵肉的微生物菌群、理化指標及質(zhì)構品質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)無論是在微生物、理化指標還是風味品質(zhì)方面，加入發(fā)酵劑的發(fā)酵肉均優(yōu)于自然發(fā)酵肉。并且與對照組相比，加入發(fā)酵劑能夠減少最終產(chǎn)品的亞硝酸鹽含量，同時提高食鹽含量，促進風味物質(zhì)的形成。因此，推測加入發(fā)酵劑可以減少發(fā)酵肉中食鹽的用量，同時減少亞硝酸鹽的生成，從而保證產(chǎn)品安全和風味品質(zhì)。發(fā)酵肉通過微生物發(fā)酵，其安全性得以提高、風味品質(zhì)得以改善，而如何生產(chǎn)出高品質(zhì)、營養(yǎng)、健康的功能性發(fā)酵肉制品必將成為肉制品加工行業(yè)的又一新熱點[28-30]。

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