外源性硫化氫通過上調(diào)SIRT1延緩心肌早衰抑制尿毒癥大鼠心肌纖維化

劉達(dá)，肖婷，梁彪，宋熊，王森，趙俊雄，楊軍△

心血管并發(fā)癥已成為目前尿毒癥患者的首要死因，而尿毒癥心肌?。║CM）是各類原因所致的腎功能衰竭后重要的心肌損害表現(xiàn)，心肌纖維化是其常見的病理改變，不僅可影響心臟順應(yīng)性及左心室舒張功能，嚴(yán)重時(shí)還可引發(fā)惡性心律失常，導(dǎo)致心源性猝死［1］。尿毒癥誘發(fā)心肌纖維化的機(jī)制目前尚不清楚，同時(shí)缺乏具有針對(duì)性的防治措施。近年有研究顯示，尿毒癥環(huán)境下的心肌過早衰老參與了心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制，且可能與尿毒癥毒素誘發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)［2-3］。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)因子-1（SIRT1）在心血管系統(tǒng)中的潛在保護(hù)效應(yīng)可能與其延緩心肌細(xì)胞衰老有關(guān)［4］。Chen等［5］證實(shí)上調(diào)SIRT1可抑制炎性因子分泌，改善D-半乳糖誘導(dǎo)的心臟早衰。但SIRT1能否介導(dǎo)尿毒癥心肌纖維化的發(fā)生目前尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)，氣體信號(hào)分子硫化氫（H2S）可抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性體活化，調(diào)控炎癥反應(yīng)［6］，并可抑制細(xì)胞應(yīng)激性早衰，改善糖尿病所致的心肌纖維化［7］，但其能否在尿毒癥導(dǎo)致的心肌纖維化過程中起到保護(hù)作用尚有待探討。本研究通過建立UCM大鼠模型，觀察H2S能否抑制尿毒癥大鼠心肌纖維化，并探討其機(jī)制是否與上調(diào)SIRT1信號(hào)通路進(jìn)而抑制心肌早衰有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48只SPF級(jí)，體質(zhì)量為300~350 g的SD雄性成年大鼠（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK湘2015-0002）于溫度適宜、濕度恒定、通氣良好、晝夜12 h交替的南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng)，自由飲食飲水，干預(yù)過程遵守南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑及儀器硫氫化鈉（NaHS）、石蠟、中性樹膠購于美國Sigma公司，β-半乳糖苷酶染色試劑盒購于中國上海碧云天公司；NLRP3、白細(xì)胞介素（IL）-1β兔一抗購于美國Cell Signaing Technology公司；SIRT1、P21、P19、P53、GAPDH兔一抗及羊抗兔二抗購于武漢Proteintech公司；恒溫風(fēng)干箱購于北京六一公司，切片機(jī)購于浙江金華實(shí)驗(yàn)儀器廠，化學(xué)發(fā)光成像儀購于上海伯樂公司。血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）檢測(cè)盒購于上海信裕生物科技公司；BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物公司；酶標(biāo)儀購于美國賽默飛科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)建模及分組干預(yù)大鼠熟悉環(huán)境5 d后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（UCM組）、H2S治療組（UCM+H2S組）和H2S對(duì)照組（H2S組），每組12只。UCM組及UCM+H2S組大鼠麻醉后備皮消毒，結(jié)扎切除左腎上下1/3，僅保留左腎中間1/3的血流與功能，止血并縫合手術(shù)切口，7 d后二次手術(shù)將右腎切除，建立5/6腎切除的尿毒癥大鼠模型［8］；而Sham組及H2S組大鼠僅行雙腎游離。術(shù)后28 d存活大鼠采血測(cè)BUN和Scr，當(dāng)血BUN和Scr較Sham組升高2~3倍時(shí)認(rèn)為尿毒癥大鼠造模成功［8］。UCM+H2S組和H2S組每日以NaHS溶液50 μmol/kg腹腔注射［9］，共給藥8周，Sham組和UCM組注射同劑量生理鹽水。

1.4 心臟超聲檢測(cè)及樣本收集干預(yù)結(jié)束后麻醉并行心臟超聲檢測(cè)大鼠左心室短軸縮短率（LVFS），隨后處死并收取心臟標(biāo)本。用4%多聚甲醛封存少許心肌組織用做Masson染色。剩余心臟組織立即置于-80℃條件下凍存，用于β-半乳糖苷酶染色及后期的蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.5 Masson染色法評(píng)估心肌纖維化情況取封存的心肌標(biāo)本經(jīng)過脫水、石蠟包埋法切制薄片，脫蠟后進(jìn)行核染液染色。再經(jīng)過沖洗、復(fù)染、脫水晾干、封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，最后使用Image J進(jìn)行圖像分析，測(cè)得藍(lán)染面積/視野中總組織面積為膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）。

1.6 免疫組化法檢測(cè)心?、笮湍z原表達(dá)取石蠟包埋備用的組織切片，經(jīng)脫蠟水化、修復(fù)抗原、暴露抗原決定簇后，封閉非特異性蛋白。再加Ⅲ型膠原一抗4℃孵育過夜。次日漂洗后孵育二抗，充分漂洗、顯色、脫水以及封片后，光鏡下閱片，陽性反應(yīng)時(shí)組織呈棕色，陽性表達(dá)率為視野內(nèi)棕染面積占總視野面積的比值，Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.7 β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)衰老心肌細(xì)胞取冰凍的包埋心肌組織，切成約6 μm薄片，室溫入蒸餾水5 min×2次；滴加50 μL β-半乳糖苷酶染色固定液于切片，置于濕盒中，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次；吸去PBS，加適宜量的染色試劑。放于濕盒中，置無二氧化碳環(huán)境中37℃孵育過夜；PBS沖洗5 min×3次；最終緩沖甘油封片后于顯微鏡下觀察，陽性反應(yīng)時(shí)組織細(xì)胞呈藍(lán)色，陽性表達(dá)率為視野內(nèi)藍(lán)染面積占總視野面積的比值，Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 蛋白免疫印跡法測(cè)心肌中SIRT1、NLRP3、IL-1β、P21、P19、P53蛋白表達(dá)稱取凍存的心肌標(biāo)本0.2 g，加入裂解液及蛋白酶抑制劑混合后低溫研磨并離心，取上清液，而后采用BCA法定量并配平，最后95℃煮10 min完成蛋白提取。制上層5%濃縮膠、下層10%分離膠電泳分離蛋白后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；然后5%脫脂奶粉封閉2 h，SIRT1、NLRP3、IL-1β、P21、P19、P53一抗稀釋液（1∶500）4℃冰箱孵育過夜；TBST洗膜后用二抗稀釋液（1∶8 000）室溫孵育1 h，再次漂洗后顯影。以Image J軟件處理圖像，計(jì)算條帶與GAPDH的灰度值比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況及造模結(jié)果術(shù)后28 d，40只大鼠存活。UCM組BUN和Scr較Sham組升高2倍以上，提示尿毒癥大鼠造模成功。UCM組與UCM+H2S組，Sham組與H2S組BUN和Scr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。藥物干預(yù)8周后，Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組分別存活12、7、8、11只大鼠，隨機(jī)數(shù)字表法每組抽取7只大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab.1 Comparison of serum BUN and Scr between the four groups表1各組大鼠血清BUN、Scr比較 （±s）

Tab.1 Comparison of serum BUN and Scr between the four groups表1各組大鼠血清BUN、Scr比較 （±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，P＜0.05。

組別Sham組UCM組UCM+H2S組H2S組F n 12 8 9 11 BUN（mmol/L）11.11±2.43 25.09±7.04a 23.13±6.23a 10.67±1.94 27.000＊Scr（μmol/L）31.75±6.02 109.50±12.45a 106.20±11.69a 32.14±5.61 158.100＊

2.2 各組大鼠心臟超聲LVFS比較Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組LVFS分 別 為0.48±0.04、0.41±0.02、0.47±0.04和0.49±0.02，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=7，F(xiàn)=6.272，P＜0.05）。與Sham組比較，UCM組LVFS明顯下降（P＜0.05）；與UCM組比較，UCM+H2S組LVFS升高（P＜0.05），見圖1。

2.3 各組大鼠心肌Masson染色情況Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組大鼠心肌CVF（%）分別為20.05±1.77、41.86±3.29、30.50±2.59和21.27±2.40，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=7，F(xiàn)=46.390，P＜0.05）。與Sham組比較，UCM組大鼠心肌CVF升高（P＜0.05），藍(lán)染組織增多；而UCM+H2S組較UCM組大鼠心肌CVF降低（P＜0.05），藍(lán)染組織減少；Sham組與H2S組大鼠心肌組織則均較少被藍(lán)染，見圖2。

Fig.1 Ultrasound image of rat heart function in each group圖1各組大鼠心功能超聲圖像

2.4 各組大鼠心?、笮湍z原蛋白表達(dá)Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組大鼠心?、笮湍z原陽性表達(dá)率（%）分別為12.35±1.87，26.47±4.05，18.01±2.11，13.13±2.51，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=7，F(xiàn)=16.490，P＜0.05）。與Sham組比較，UCM組Ⅲ型膠原陽性表達(dá)率升高（P＜0.05），棕染部分增多；而UCM+H2S組較UCM組Ⅲ型膠原陽性表達(dá)率降低（P＜0.05），棕染部分則變少；Sham組與H2S組大鼠心肌組織均未被明顯棕染，見圖3。

2.5 各組大鼠心肌β-半乳糖苷酶染色情況Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組心肌的β-半乳糖苷酶染色陽性率（%）分別為0.67±0.38，27.09±3.44、6.66±2.76和0.44±0.13，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=7，F(xiàn)=96.710，P＜0.05）。與Sham組相比，UCM組大鼠β-半乳糖苷酶染色陽性率升高（P＜0.05），藍(lán)染部分增加；而UCM+H2S組較UCM組β-半乳糖苷酶染色陽性率降低（P＜0.05），藍(lán)染部分則變少；Sham組與H2S組大鼠心肌組織均未被明顯藍(lán)染，見圖4。

2.6 各組心肌組織中SIRT1、NLRP3、IL-1β、P21、P19、P53蛋白表達(dá)情況與Sham組相比，UCM組大鼠NLRP3、IL-1β、P19、P21及P53表達(dá)增多，SIRT1蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）；而UCM+H2S組大鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、P19、P21及P53蛋白表達(dá)量較UCM組減少，SIRT1蛋白表達(dá)增多（P＜0.05）。與Sham組比較，H2S組大鼠心肌組織中SIRT1、NLRP3、IL-1β、P19、P21、P53表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5、表3。

3 討論

尿毒癥是各種因素導(dǎo)致腎臟失去正常功能后，機(jī)體代謝及生化紊亂的臨床綜合征，其可累及機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)，以心血管系統(tǒng)損害最為突出［10］。近年來，腎臟替代治療的普及雖使尿毒癥患者的存活時(shí)間延長［11］，但尿毒癥所致的心肌損害問題也日漸突出。與高血壓、甲狀腺功能亢進(jìn)等其他因素導(dǎo)致的心肌病變類似，心肌纖維化是UCM發(fā)生發(fā)展中的重要病理過程，其通?？蓳p害心臟舒張功能并導(dǎo)致心肌重構(gòu)、誘發(fā)心力衰竭，最終嚴(yán)重影響尿毒癥患者的生活質(zhì)量及生存時(shí)間。

Fig.2 Masson staining of collagen fibers in myocardial tissue of rats in each group(×400)圖2各組大鼠心肌組織膠原纖維Masson染色（×400）

Fig.3 Expression of typeⅢcollagen in myocardial tissue of rats in each group(immunohistochemical staining,×400)圖3各組大鼠心肌組織Ⅲ型膠原表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

Fig.4 The aging level of myocardial tissue of rats in each group(β-galactosidase staining,×400)圖4各組大鼠左室心肌組織衰老情況（β-半乳糖苷酶染色，×400）

Fig.5 The protein expression levels of SIRT1,P21,P19，P53,NLRP3 and IL-1β in myocardial tissue of rats in each group圖5各組大鼠心肌組織中SIRT1、P21、P19、P53及NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)

Tab.3 Comparison of SIRT1,P21,P19,P53,NLRP3 and IL-1β protein expression levels in myocardial tissue of rats between the four groups表3各組大鼠心肌SIRT1、P21、P19、P53及NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 （n=7，±s）

Tab.3 Comparison of SIRT1,P21,P19,P53,NLRP3 and IL-1β protein expression levels in myocardial tissue of rats between the four groups表3各組大鼠心肌SIRT1、P21、P19、P53及NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 （n=7，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與UCM組比較，P＜0.05。

組別Sham組UCM組UCM+H2S組H2S組F SIRT1 0.87±0.07 0.69±0.05a 0.83±0.04b 0.83±0.01 6.381＊P21 0.69±0.02 0.93±0.04a 0.68±0.02b 0.69±0.02 51.420＊P19 1.18±0.08 1.46±0.03a 1.25±0.03b 1.29±0.04 14.150＊組別Sham組UCM組UCM+H2S組H2S組F P53 0.57±0.01 0.79±0.02a 0.60±0.01b 0.59±0.01 96.370＊NLRP3 0.68±0.03 0.89±0.04a 0.84±0.02b 0.69±0.04 23.890＊IL-1β 0.79±0.07 1.16±0.10a 0.92±0.08b 0.81±0.06 11.980＊

尿毒癥誘發(fā)心肌纖維化的機(jī)制目前并不清楚，但持續(xù)的輕度炎癥和組織器官過早衰老是尿毒癥的特征之一。有研究顯示慢性腎功能衰竭時(shí)心肌細(xì)胞應(yīng)激性衰老可誘發(fā)心肌纖維化［3］，且其可能與尿毒癥毒素誘發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)［2］。此外，本課題組近年研究也發(fā)現(xiàn)了心肌細(xì)胞早衰參與糖尿病心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制［7］。衰老相關(guān)蛋白P21、P19及P53是目前被用于評(píng)估心肌衰老的重要指標(biāo)［4，12］。本研究發(fā)現(xiàn)，UCM組大鼠存在明顯心肌纖維化，同時(shí)炎癥相關(guān)蛋白NLRP3、IL-1β及衰老相關(guān)蛋白P21、P19及P53在UCM組心肌組織中表達(dá)較Sham組顯著增加，通過β-半乳糖苷酶染色法也發(fā)現(xiàn)UCM組的心肌衰老較Sham組大鼠更為顯著，以上結(jié)果提示炎癥反應(yīng)及其誘發(fā)的心肌細(xì)胞過早衰老可能參與了尿毒癥所致的心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制。

沉默信息調(diào)節(jié)因子（Sirtuins）家族蛋白為一組具有高度保守催化結(jié)構(gòu)域的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙?；?，在細(xì)胞衰老、生長發(fā)育以及各種疾病過程中均起著關(guān)鍵調(diào)控作用，同時(shí)也是公認(rèn)的長壽因子。目前發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物體內(nèi)Sirtuins的7個(gè)家族成員，其中在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)的有SIRT1與SIRT2，而主要表達(dá)于線粒體的有SIRT3、SIRT4和SIRT5，SIRT6和SIRT7則主要表達(dá)于細(xì)胞核［13］。其中SIRT1被認(rèn)為在衰老、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激抵抗和炎癥過程中發(fā)揮多種功能［14-15］。SIRT1可通過抑制P53的表達(dá)活化以及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β 1）/Smads信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)改善肝纖維化［16］。Sun等［17］發(fā)現(xiàn)SIRT1可通過抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)可防止心臟衰老［18］。本研究顯示，在UCM組心肌組織中SIRT1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，提示SIRT1可能參與了尿毒癥大鼠心肌細(xì)胞炎性早衰的調(diào)控機(jī)制。

H2S是一種新型氣體信號(hào)分子，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)保護(hù)作用［19］。在心血管系統(tǒng)中其主要有舒張血管平滑肌細(xì)胞、促進(jìn)血管新生以及抑制細(xì)胞凋亡等保護(hù)作用。同時(shí)也有研究顯示，在各種纖維化疾病的動(dòng)物模型中血清H2S水平下降，而適當(dāng)補(bǔ)充外源性H2S具有抑制腎、肺、肝、心等組織器官的纖維化的作用［20］。近年也有研究證實(shí)H2S能通過減少心肌間質(zhì)膠原纖維的沉積及Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)改善高同型半胱氨酸誘發(fā)的大鼠心肌纖維化［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于UCM組，UCM+H2S組大鼠心肌Masson染色顯示心肌間質(zhì)膠原纖維沉積減少，且免疫組化染色結(jié)果也顯示大鼠心肌中Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)下降，提示尿毒癥大鼠心肌纖維化得到改善。此外，UCM+H2S組較UCM組大鼠LVFS升高，心功能改善，同時(shí)心肌中SIRT1蛋白表達(dá)上調(diào)，NLRP3炎性小體及炎性因子IL-1β、衰老蛋白P19、P21及P53蛋白表達(dá)減少，β-半乳糖苷酶染色陽性率下降，心肌衰老得到緩解。以上提示氣體信號(hào)分子H2S可抑制尿毒癥環(huán)境下的心肌纖維化，其機(jī)制可能與其上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)并延緩心肌細(xì)胞過早衰老有關(guān)。而H2S組和Sham組各指標(biāo)比較無顯著差異，表明補(bǔ)充該劑量的外源性H2S并不會(huì)對(duì)正常大鼠造成顯著影響，治療劑量下的H2S是相對(duì)安全的。但大劑量的外源性H2S極有可能會(huì)對(duì)大鼠造成損害甚至死亡［22］，故嚴(yán)格把握干預(yù)試劑的劑量十分重要。

綜上所述，本研究證實(shí)氣體信號(hào)分子H2S對(duì)尿毒癥心肌病大鼠心肌纖維化的拮抗作用，這可能與SIRT1負(fù)性調(diào)控尿毒癥環(huán)境下心肌炎癥反應(yīng)、緩解心肌衰老有關(guān)。本研究有望為今后UCM的防治提供新的治療靶點(diǎn)及理論依據(jù)。