Ang-2、MMP-9和miR-142-3p在膿毒癥合并AKI中的表達(dá)及相關(guān)性研究

張琳 許序云 李永琦 夏加偉

膿毒癥屬于感染性疾病，是通過細(xì)菌等病原微生物的入侵導(dǎo)致感染的危重癥。其主要表現(xiàn)為全身出現(xiàn)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體心、肺等各器官功能出現(xiàn)嚴(yán)重障礙[1,2]。膿毒癥致病率高，病情兇險，救治難度大，使其死亡率逐步升高，高達(dá)30%～70%，對于人們的生命健康安全造成巨大威脅[3]。急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是膿毒癥常見的合并癥，而隨著膿毒癥病情嚴(yán)重程度的進(jìn)一步發(fā)展，容易造成機(jī)體多處器官的衰竭[4,5]。依據(jù)臨床所提供的數(shù)據(jù)顯示，膿毒癥患者一旦產(chǎn)生AKI，其預(yù)后效果不理想，致死率高[6]。因此，國內(nèi)外眾多醫(yī)學(xué)專家和學(xué)者致力于膿毒癥合并AKI的發(fā)病機(jī)制研究以及探尋全新的治療方法。據(jù)相關(guān)研究顯示，Ang-2、MMP-9、miR-142-3p在支氣管膿毒癥合并AKI中的表達(dá)出現(xiàn)異常[5]。本研究旨在探究Ang-2、MMP-9、miR-142-3p在膿毒癥合并AKI中的表達(dá)以及相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年7月至2021年7月60例于我院進(jìn)行收治的膿毒癥合并AKI患者為研究對象，其中AKI組30例，非AKI組30例，按照病情嚴(yán)重程度可分為輕度7例、中度10例、重度13例。選取同期30例于我院進(jìn)行體檢的健康志愿者為對照組。本研究在研究過程中患者本人其家屬均知曉，并獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。3組性別比、年齡、BMI、原發(fā)感染疾病、感染病原菌等一般資料，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 3組一般資料比較 n=30

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中國醫(yī)師協(xié)會急診醫(yī)師分會制定的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],符合AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，患者病歷資料均齊全。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①腎小球疾病、合并慢性腎臟病等疾病者；②膿毒癥發(fā)生前即存在腎功能障礙者；③泌尿系統(tǒng)出現(xiàn)阻塞或感染者；④機(jī)體凝血功能出現(xiàn)異常者。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測Ang-2、MMP-9、SOD、MDA、T-AOC水平：對所有研究患者進(jìn)行空腹抽取靜脈血5 ml，標(biāo)記酶標(biāo)板、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)、空白、檢測孔，標(biāo)準(zhǔn)孔添加標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔添加終止液、顯色劑，檢測孔添加血清標(biāo)本及抗體，封膜并晃勻，37℃保溫箱靜置60 min后去膜清洗，將水分吸干后各孔添加顯色劑并進(jìn)行均勻搖晃，搖晃至顯色后加入終止液，空白孔為基準(zhǔn)，使用酶標(biāo)分析儀(上海酶聯(lián)生物科技科技有限公司，型號：ML-dr3518)450 nm處測吸光值，計算Ang-2、MMP-9、SOD、MDA、T-AOC水平。

1.3.2 RT-PCR法檢測miR-142-3p表達(dá)：吸取250 μl血漿樣本，加入750 μl Trizol試劑，混勻，提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件:42℃ 60 min，25℃ 5 min，70℃ 5 min，將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后產(chǎn)物cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。取預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物4 μl，按照TaqManPCR試劑盒說明進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-142-3p引物序列：前引物：5’-CGCCGTGTAGTGTTTCCTAC-3’，后引物：5’-CAGTG-CAGGGTCCGAGGT-3’。對每個樣本做3個復(fù)孔，采用RT-PCR檢測方法，記錄每個熒光反應(yīng)管中的熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值，將原始數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值，計算miR-142-3p表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 3組Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)比較 與對照組和非AKI組比較，AKI組Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)高于對照組和非AKI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)比較

2.2 不同病情膿毒癥合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)比較 膿毒癥合并AKI患者的Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)在患者年齡和性別比較上，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；膿毒癥合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)與病情嚴(yán)重程度、APACHEⅡ評分、Scr水平有關(guān)。隨病情嚴(yán)重程度、APACHEⅡ評分及Scr水平情況，Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)升高(P<0.05)。見表3。

表3 不同病情膿毒癥合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)比較

2.3 3組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與對照組和非AKI組比較，AKI組SOD、T-AOC水平低于對照組和非AKI組，MDA水平高于對照組和非AKI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.4 膿毒癥合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)與腎功能、氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性 膿毒癥合并AKI患者Ang-2表達(dá)與Cys-C、MDA水平呈正相關(guān)，與eGFR、SOD、T-AOC水平呈負(fù)相關(guān)；MMP-9表達(dá)與Cys-C、MDA水平呈正相關(guān)，與eGFR、SOD、T-AOC水平呈負(fù)相關(guān)；miR-142-3p表達(dá)與Cys-C、MDA水平呈正相關(guān)，與eGFR、SOD、T-AOC水平呈負(fù)相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 膿毒癥合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)與腎功能、氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性 n=30

2.5 膿毒癥合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)相關(guān)性 膿毒癥合并AKI患者Ang-2、MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.502，P=0.005)；膿毒癥合并AKI患者M(jìn)MP-9、miR-142-3p表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.543，P=0.001)；膿毒癥合并AKI患者Ang-2、miR-142-3p表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.489，P=0.006)。見圖1。

圖1 膿毒癥合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)相關(guān)性圖

3 討論

膿毒癥使機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)惡性炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)的產(chǎn)生主要是由于創(chuàng)傷、感染等反復(fù)多次的刺激，從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了大量的炎性因子[9]。病情不穩(wěn)定且多變，容易誘發(fā)合并AKI，隨著患者病情進(jìn)一步加重，或?qū)е聶C(jī)體內(nèi)多處器官出現(xiàn)衰竭，對患者生命健康安全造成嚴(yán)重威脅[10]。據(jù)相關(guān)研究指出，膿毒癥一旦產(chǎn)生合并AKI，其致死率較高[11]。因此，眾多國內(nèi)外相關(guān)專家及學(xué)者探究膿毒癥合并AKI發(fā)病機(jī)制，以期尋找新的膿毒癥合并AKI治療靶點(diǎn)。

Ang-2屬于促血管生素中的一種，自身隸屬于前炎性細(xì)胞因子，和細(xì)胞出現(xiàn)不同損傷的程度具有密切關(guān)系[12,13]。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，Ang-2在膿毒癥合并AKI中的表達(dá)量較高[14]。本結(jié)果顯示，AKI組患者的Ang-2表達(dá)水平高于對照組和非AKI組，說明Ang-2的表達(dá)在膿毒癥合并AKI發(fā)生發(fā)展的過程中出現(xiàn)明顯升高，起到促進(jìn)患者氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。不同臨床特征膿毒癥合并AKI患者Ang-2表達(dá)在重度、Scr水平≥110 μmol/L患者中表達(dá)較高，說明Ang-2在膿毒癥合并AKI中呈現(xiàn)出較為異常的表達(dá)，并且其表達(dá)變化與膿毒癥合并AKI患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

MMP-9又名明膠酶B，屬于MMPs家族中的重要組成成員，是一組能夠?qū)?xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行選擇性降解的內(nèi)肽酶，能夠?qū)γ髂z、膠原蛋白、彈性蛋白等外基質(zhì)成分進(jìn)行水解[15,16]。當(dāng)MMP-9表達(dá)水平出現(xiàn)不平衡時，則會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。據(jù)相關(guān)研究指出，MMP-9在膿毒癥合并AKI中表達(dá)水平忽增，說明MMP-9參與膿毒癥合并AKI發(fā)生發(fā)展的演進(jìn)過程[17]。本結(jié)果顯示，AKI組患者的MMP-9表達(dá)水平要高于對照組和非AKI組，通過進(jìn)一步研究，不同臨床特征膿毒癥合并AKI患者M(jìn)MP-9表達(dá)水平不同，在膿毒癥患者病情嚴(yán)重的情況下，其MMP-9表達(dá)水平生升高，并且MMP-9表達(dá)變化與膿毒癥合并AKI患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

微小RNA(miRNA)以非編碼單鏈形式在多數(shù)生物體之中大量存在，是一種長度21-25nt的非編碼RNA和靶基因3’-非編碼區(qū)(untranslated regions，UTR)結(jié)合后，會引起靶基因miRNA降解或抑制，影響生物免疫功能的發(fā)揮。與機(jī)體炎性反應(yīng)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等密切相關(guān)[18,19]。miR-142-3p作為miRNA家族中最具促炎活性的成員，在機(jī)體臟器組織中不僅能夠?qū)⒋傺鬃饔冒l(fā)揮到極致，還能夠參與多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展，成為評價機(jī)體炎性反應(yīng)的重要標(biāo)志物[20]。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p在膿毒癥合并AKI中出現(xiàn)表達(dá)異常，其表達(dá)量較高[21]。本文研究結(jié)果顯示，AKI組患者miR-142-3p表達(dá)量要高于對照組和非AKI組，預(yù)期研究結(jié)果一致。由此說明，miR-142-3p的表達(dá)在膿毒癥合并AKI發(fā)生發(fā)展的過程中出現(xiàn)明顯升高，進(jìn)一步對不同臨床特征膿毒癥合并AKI患者miR-142-3p表達(dá)對比得知，重度、Scr水平≥110 μmol/L等患者的miR-142-3p表達(dá)較高，說明miR-142-3p在膿毒癥合并AKI中呈現(xiàn)出較為異常的表達(dá)，并且其表達(dá)變化與膿毒癥合并AKI患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可能在后續(xù)膿毒癥合并AKI診斷、治療效果評估中成為新靶點(diǎn)。

本研究還對膿毒癥合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)與腎功能功能、氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)相關(guān)性及三者之間相關(guān)性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)變化與膿毒癥合并AKI患者腎功能、氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)均具有一定相關(guān)性，并且Ang-2、MMP-9、miR-142-3p在膿毒癥合并AKI中具有相關(guān)性，由此本研究推測Ang-2、MMP-9、miR-142-3p可能共同參與膿毒癥合并AKI的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Ang-2、MMP-9、miR-142-3p在膿毒癥合并AKI患者中表達(dá)較高，三者的表達(dá)變化程度與膿毒癥合并AKI患者的病理特征、腎功能、氧化應(yīng)激指標(biāo)具有一定相關(guān)性，且Ang-2、MMP-9、miR-142-3p之間也具有一定相關(guān)性，可能共同參與膿毒癥合并AKI的發(fā)生發(fā)展。本研究也存在不足之處，病例數(shù)選取較少，并且未對Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)變化與膿毒癥合并AKI患者的預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行相關(guān)研究，下一步研究需對樣本量進(jìn)行增加，探究Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表達(dá)變化與膿毒癥合并AKI患者預(yù)后的相關(guān)性。