基于DNA條形碼的江門近岸海域春季魚卵的種類鑒定及其形態(tài)

陳 靜 ，黃德練，王雪輝，徐 磊，張 健，李亞芳，寧加佳，王亮根，劉雙雙，林昭進，杜飛雁

1. 上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306

2. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300

魚卵是魚類的早期發(fā)育階段，掌握其豐度和分布對了解魚類早期資源變動具有重要意義[1]。魚卵的形態(tài)分類和鑒定是早期漁業(yè)資源種類調(diào)查和評估的重要依據(jù)[2-4]。南海作為我國三大陸緣海之一，具有獨特的半封閉海域條件，是世界上海洋生物種質(zhì)資源最豐富的區(qū)域之一，已記錄魚類3 400多種，然而有形態(tài)信息和分類研究的魚卵種類卻極其缺乏[5-6]。魚卵的發(fā)育時間短、形態(tài)變化大、相近種類特征相似，在魚類的產(chǎn)卵期與產(chǎn)卵場相互交疊的情況下難以準確對其進行分類研究[5]，限制了對近海魚類早期資源的準確評估和深入研究。隨著GenBank (www.ncbi.nlm.gov) 和BOLD systems(v4.boldsystems.org) 等數(shù)據(jù)庫的不斷完善，DNA條形碼技術在魚卵的分類鑒定中應用廣泛，為解決魚卵形態(tài)學鑒定的研究瓶頸提供了新思路和手段。DNA條形碼技術在進行魚卵仔魚鑒定時，不受限于種類形態(tài)、狀態(tài)及發(fā)育時期，僅依靠少量的組織就能獲取該種類的基因序列，經(jīng)擴增、測序及序列比對即可獲得較為準確的種類鑒定結果，使魚卵形態(tài)特征和分類研究更加準確、快捷[2,7-8]。

珠江口地處亞熱帶咸淡水交匯海域，常年受珠江沖淡水、沿岸流及上升流的綜合影響，是我國最富生產(chǎn)力的河口之一[9-11]，孕育了豐富的漁業(yè)資源，也是近海魚類重要的產(chǎn)卵場[10,12]。江門位于珠江口的西南部，是南海海域的典型河口區(qū)域之一，其沿岸的黃茅海河口、廣海灣及其鄰近海域 (中華白海豚保護區(qū))，受珠江口和南海海域的綜合作用，孕育了豐富的漁業(yè)資源[13-14]，成為鲾科、科、舌鰨科和鯡科等多種小型魚類的產(chǎn)卵場和育幼場。本文以珠江口江門海域現(xiàn)場采獲的魚卵種類為樣本，在DNA條形碼準確鑒定種類的基礎上，描述魚卵的主要形態(tài)特征并探討其形態(tài)分類，以期為今后珠江口漁業(yè)資源的保護和管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

魚卵樣品于2021年4月在廣東珠江口江門海域的7個采樣點采集獲得。每個站位以大型浮游生物網(wǎng) (網(wǎng)口內(nèi)徑0.8 m、網(wǎng)長2.8 m，網(wǎng)口面積0.5 m2)在水體表層進行水平拖網(wǎng)采樣，每個站位拖網(wǎng)1次，每次10 min，采樣完成后收集網(wǎng)底管內(nèi)樣品充氧保存以保持活體狀態(tài)。所有站位樣品在采集后充分混合，取1/7作為抽樣樣本。體視顯微鏡(Nikon SMZ800N) 下隨機挑出3 245 顆魚卵，參考魚卵形態(tài)分類指南[1]，進行初步的形態(tài)分類。按比例共計選取了136 顆魚卵[15]，體視顯微鏡下對其進行拍照和形態(tài)記錄。魚卵樣品記錄形態(tài)后逐一放入1.5 mL無菌離心管中，以體積分數(shù)為95%的乙醇固定，?20 ℃保存以進行后續(xù)分子生物學實驗。

1.2 DNA提取和PCR擴增

魚卵樣品DNA提取使用海洋動物組織基因組提取試劑盒 (天根)。使用引物FishBCL (5'-TCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3') 和FishBCH(5′-ACTTCYGGGTGRCCRAARAATCA-3')[16]對線粒體細胞色素C第I亞基 (COI) 目的片段進行PCR擴增。30 μL PCR反應體系組成為TaqDNA聚合酶(TaKaRa) 0.3 μL，dNTP 3 μL，10× Taqbuffer 3 μL，正反向引物各0.9 μL，DNA模板3 μL，ddH2O補足。反應條件為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送廣州天一輝遠基因科技公司進行純化和序列雙向測定。

1.3 序列分析和種類確認

利用DNAstar 7.1軟件包 (DNASTAR, Inc.) 對測序獲得的原始序列進行檢查、拼接及校對，確定序列準確性，并將獲得的序列與GenBank及BOLD systems數(shù)據(jù)庫進行對比。依據(jù)遺傳相似度>99%認定為種水平、92%～99%為屬水平，以此為基準對魚卵進行種類判定[17]。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載與樣品序列同源性達到種水平的COI基因序列。使用MEGA 7.1軟件對所有的COI基因序列進行多重序列比對，以斑節(jié)對蝦 (Penaeus monodon)作為外系群。采用基于K2P (Kimura two parameter model) 遺傳距離的鄰接法 (Neighbor-Joining, NJ) 構建系統(tǒng)進化樹[18]以最終確認魚卵所屬的種類或類群，Bootstrap置信值設置為重復抽樣1 000次。校驗后的序列上傳至GenBank。

2 結果

2.1 種類組成

本研究共獲得86個樣品的測序結果，序列長度為628～684 bp。通過與基因數(shù)據(jù)庫比對分析，發(fā)現(xiàn)其COI序列與兩個數(shù)據(jù)庫中參考序列比對均能達到99%～100%的種水平，且在種鑒定水平范圍內(nèi)出現(xiàn)相同的1～3個種類。初步判定13個魚卵種類分屬于3目10科10屬；其中4種魚卵能鑒定至種，分別為緣邊銀鱸 (Gerres limbatus)、多鱗(Sillago sihama)、眶棘雙邊魚 (Ambassis gymnocephalus) 及斑頭舌鰨 (Cynoglossus puncticepsc)；8種鑒定至屬，分別為沙丁魚屬、小公魚屬、棘鯛屬、副葉鲹屬、叫姑魚屬、屬、舌鰨屬-1和舌鰨屬-2；1種鑒定至科，為鲾科 (表1)。構建的NJ系統(tǒng)進化樹，所有物種均能成功進行種屬的聚類 (圖1)。

表1 研究海域魚卵DNA序列對比及物種鑒定結果Table 1 Results of DNA sequence comparison and species identification of fish eggs in survey area

分子鑒定的種類組成結果中，以鱸形目最多，其次為鰈形目，鯡形目再次之。個體數(shù)量以小公魚屬最多，占總個體數(shù)的38.4%；鲾科次之 (15.1%)；眶棘雙邊魚再次之 (8.1%)。結合圖像信息，發(fā)現(xiàn)相同種類魚卵所處的發(fā)育階段一致。其中沙丁魚屬魚卵處于剛完成受精不久的受精卵時期，胚體尚未形成；舌鰨屬和叫姑魚屬魚卵處于卵裂期和囊胚期；其余魚卵種類均處于胚體和器官形成時期。

2.2 形態(tài)特征

沙丁魚屬卵為圓球狀 (圖2-a)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑介于1.563～1.615 mm，均值為 (1.588±0.024) mm；卵周隙介于0.337～0.458 mm，均值為(0.385±0.051) mm，約為卵徑的47%～53%。卵黃近圓形，直徑介于0.836～0.870 mm，均值為(0.850±0.012) mm，分兩層，外層半透明，顏色較淺，內(nèi)層呈乳白色兼有不規(guī)則的龜裂。單油球，呈淺黃色，位于卵黃囊中央，直徑介于0.131～0.141 mm，均值為 (0.135±0.004)mm；油球表面光滑，未見明顯色素胞分布。

小公魚屬卵為橢圓狀 (圖2-b)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造，具有彈性；卵周隙較?。宦腰S囊也呈橢圓形，有不規(guī)則龜裂；長徑介于1.177～1.189 mm，均值為 (1.182±0.005) mm，短徑介于0.684～0.692 mm，均值為 (0.689±0.003) mm；此時胚體形成，孵化出膜圍繞卵黃囊3/5，胚體后端1/3形成尾部，已孵化出膜；橙色油球一個，靠近胚體尾部1/3處，直徑介于0.095～0.101 mm，均值為 (0.098±0.002) mm，油球表面光滑，未見明顯色素胞分布。

棘鯛屬卵為圓球狀 (圖2-c)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑介于0.772～0.780 mm，均值為 (0.776±0.003) mm，動、植物極卵周隙變寬；此時胚體形成，孵化出膜圍繞卵黃囊3/5，視囊內(nèi)晶體形成，聽囊出現(xiàn)；胚體自頭到尾沿身體兩側布滿褐色色素胞，胚體末端形成尾芽，緊附卵黃囊，向內(nèi)彎曲伸長；單油球，靠近胚體尾部1/3處，直徑介于0.158～0.168 mm，均值為 (0.163±0.004) mm，油球表面零星出現(xiàn)點狀黑色素胞。

圖2 珠江口江門海域 13種魚卵不同發(fā)育階段的圖像注：a. 小沙丁魚屬；b. 小公魚屬；c. 棘鯛屬；d. 副葉鲹屬；e. 眶棘雙邊魚；f. 緣邊銀鱸；g. 叫姑魚屬；h. 鲾科；i. 屬； j. 多鱗；k. 舌鰨屬-1；l. 斑頭舌鰨；m. 舌鰨屬-2；比例尺均為 0.1 mm。Fig. 2 Photographs of different embryonic development stages of fish eggs of 13 species from Jiangmen coastal area of Pearl River EstuaryNote: a. Sardinella sp.; b. Stolephorus sp.; c. Acanthopagru sp.; d. Alepes sp.; e. A. gymnocephalus; f. G. limbatus; g. Johnius sp.; h. Leiognathidae;i. Sillago sp.; j. S. sihama; k. Cynoglossus sp.-1; l. C. puncticeps; m. Cynoglossus sp.-2. Scale bar is 0.1 mm.

副葉鲹屬卵為圓球狀 (圖2-d)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑為0.644～0.659 mm，均值為 (0.650±0.005) mm；未見明顯卵周隙；此時觀察到胚體已具雛形，一端逐漸膨大拱起，形成胚體前端，另一端沿著卵膜延伸逐漸形成胚體尾端，胚體兩端靠近卵膜一側零星分布有黑色素胞；單油球，直徑介于0.136～0.148 mm，均值為 (0.142±0.004) mm，油球表面零星分布有黑色素胞。

眶棘雙邊魚卵為圓球狀 (圖2-e)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑介于0.716～0.724 mm，均值為 (0.720±0.003) mm；未見明顯的卵周隙；卵黃顆粒細且均勻，略顯現(xiàn)乳白色；此時胚體出現(xiàn)雛形緊密圍繞著油球，胚體外側規(guī)則排列有2～3列點狀黑色素胞，胚體一端正在形成頭部，視囊隱約可見；單油球，直徑介于0.157～0.169 mm，均值為 (0.161±0.005) mm，油球表面可觀察到5～6個點狀黑色素。

緣邊銀鱸是短棘銀鱸(G. lucidus)的同物異名(圖2-f)。卵為圓球狀，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑介于0.716～0.732 mm，均值為 (0.725±0.006) mm；此時胚體已形成，環(huán)繞卵黃囊2/3，魚卵原口已關閉；胚體前端形成頭部，頭部膨大形成具有分化的腦部；腦部視囊形成；未見明顯晶體形成；視囊后方出現(xiàn)聽囊；耳石未形成；胚體尾部尾芽雛形初現(xiàn)；胚體頭部、軀干部及尾部均零星分布褐色色素胞，在胚體背部分布較密集且呈線形規(guī)則分布；單油球，直徑介于0.155～0.164 mm，均值為 (0.160±0.003) mm，表面零星分布有色素胞。

叫姑魚屬卵為圓球狀 (圖2-g)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑介于0.755～0.770 mm，均值為 (0.761±0.007) mm；卵周隙較窄；此時為剛受精不久的魚卵，原生質(zhì)向動物極集中，形成狹窄的卵周隙，形成白色帽狀胚盤；單油球，呈乳白色；位于卵黃囊中央，直徑為0.189～0.198 mm，均值為 (0.192±0.003) mm，油球表面光滑，未見明顯色素胞分布。

鲾科卵為圓球狀 (圖2-h)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑介于0.650～0.673 mm，均值為 (0.663±0.010) mm；卵周隙較窄；卵黃囊透明，表面無明顯龜裂；胚胎環(huán)繞卵黃囊3/5時期，視囊內(nèi)晶體形成，聽囊出現(xiàn)；胚體出現(xiàn)星狀黃色素胞沿中央兩側成行列式規(guī)則分布至尾端；胚體末端形成尾芽，已離開卵黃并向內(nèi)彎曲伸長；單油球，靠近胚體尾部1/3處，直徑介于0.156～0.160 mm，均值為 (0.155±0.002) mm，表面分布星狀黃色色素胞且夾雜有黑色點狀色素胞。

舌鰨屬-1為受精不久的魚卵 (圖2-k)。卵為圓球狀，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑介于0.843～0.865 mm，均值為 (0.849±0.010) mm；未見明顯的卵周隙；油球10個左右，大小各異，直徑介于0.042～0.096 mm，聚集緊密，油球表面光滑，未見明顯色素胞分布；與油球相對的動物極出現(xiàn)多層分裂球疊加排列形成細胞團，兩側微隆起呈小丘狀，整個細胞團界限模糊。

斑頭舌鰨為受精不久的魚卵 (圖2-l)，受精孔清晰可見。卵為圓球狀，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑介于0.784～0.806 mm，均值為 (0.793±0.008) mm；未見明顯的卵周隙；卵黃顆粒細勻；團狀原生質(zhì)集中于油球相對側動物極，形成帽狀胚，胚盤處的分裂球持續(xù)分裂聚集成囊胚狀，油球16個左右，大小各異，直徑范圍為0.045～0.073 mm，聚集緊密，表面光滑，未見明顯色素胞分布。

舌鰨屬-2卵為圓球狀 (圖2-m)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無特殊構造；卵徑介于0.733～0.739 mm，均值為 (0.734±0.003) mm；卵黃顆粒細勻，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)；此時胚體已完全形成，魚卵原口已關閉，胚體纖長環(huán)繞卵黃囊1/2時期；神經(jīng)管發(fā)育完善，沿胚體中軸向前延伸至吻端；胚體前端膨大形成分化的頭部，緊緊依附在卵黃囊上，吻端鈍圓；出現(xiàn)黑色素沉淀；視囊后方形成長橢圓形聽囊，左右各1個；耳石未形成；視囊形成；油球16個左右，大小各異，直徑介于0.045～0.075 mm，彼此分離分布在胚體中后部，表面光滑，未見明顯色素胞分布。

2.3 形態(tài)分類

本文采用形態(tài)學方法和DNA條形碼技術相結合的研究方法，對江門海域采獲的13種魚卵進行了種屬水平的種類鑒定。采獲的13種魚卵均為浮性卵，卵膜單層、光滑透明，無特殊構造。形態(tài)特征的差異主要體現(xiàn)在卵膜形狀，卵徑大小，油球數(shù)量、分布及其色素分布，卵周隙寬窄，胚體上色素胞的顏色、數(shù)量及分布等?？煞謩e依據(jù)以上特征大致將魚卵種類進行形態(tài)分類。首先是卵徑形狀：小公魚屬魚卵呈橢圓形，長徑明顯大于短徑，其他種類為圓球形。其次是卵徑大?。荷扯◆~屬魚卵卵徑最大，為1.563～1.615 mm，明顯大于其他魚卵卵徑 (0.644～0.873 mm)；副葉鲹屬卵徑最小，為0.644～0.659 mm。種屬間相近種類的卵徑變化相對較小，難以進一步區(qū)分，但魚卵油球數(shù)量、分布及其色素分布具有一定差異。舌鰨屬魚卵油球數(shù)量較多且大小不一，表面無明顯色素分布，呈聚集或分散分布。其中舌鰨屬-1油球10個左右，聚集緊密，直徑介于0.042～0.096 mm；斑頭舌鰨油球16個左右，聚集緊密，直徑介于0.045～0.073 mm，聚集緊密；舌鰨屬-2油球16個左右，直徑介于0.045～0.075 mm，散布在胚體尾部；除舌鰨屬外其他種類魚卵均為單油球。此外，油球表面色素分布也可以進一步輔助形態(tài)區(qū)分，如沙丁魚屬、小公魚屬及叫姑魚屬油球均無明顯色素分布，屬油球表面黃色色素胞較為密集，其他種類油球均有不同程度的黑色或黃色色素胞分布。再者是卵周隙寬窄：沙丁魚屬、眶棘雙邊魚魚卵的卵周隙均較寬，其他種類魚卵卵周隙均較窄。對于已有胚體形成的魚卵，胚體上色素胞顏色、數(shù)量及分布也是種類鑒定的重要依據(jù)。棘鯛屬胚體體干兩側及背部明顯分布有黃色素胞；副葉鲹屬胚體兩端規(guī)則分布有行列式黑色素胞。

3 討論

3.1 形態(tài)分類結合DNA條形碼在魚卵分類中的應用

形態(tài)學鑒定作為早期魚類種類鑒定常規(guī)且普遍的研究方法，其鑒定過程復雜煩瑣，受限于分類專家的主觀判斷和儀器設備的制約[19]。Ko等[17]借助DNA條形碼技術對5個實驗室仔魚形態(tài)鑒定結果的準確性進行檢查，摒棄未知種類，形態(tài)學方法鑒定至屬水平的準確率為75.4%，而種水平僅為43.7%，認為形態(tài)學方法僅能將魚類早期階段鑒定到科屬水平。DNA條形碼技術可較準確地將早期魚類鑒定到種水平，形態(tài)分類與DNA條形碼結合顯著提高了種類鑒定的準確性，已普遍應用于早期魚類研究中。陳永久等[20]和周美玉等[21]研究發(fā)現(xiàn)DNA條形碼技術與形態(tài)學鑒定相結合對于準確鑒定魚卵、仔稚魚非常有效，特別是對魚卵的鑒定。Hou等[22]和Becker等[23]利用分子生物學方法對相關海域的魚卵進行種類鑒定，發(fā)現(xiàn)DNA條形碼能將形態(tài)學分類結果鑒定至更低階元，證實了DNA條形碼技術在魚卵物種識別中的可行性。然而單一的DNA條形碼分析方法具有局限性，在種類鑒定和物種歸屬等問題上仍有爭議。Labrador等[24]和Sukumaran等[25]使用兩個mtDNA標記高變控制區(qū)和COI基因序列對沙丁魚屬魚類進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)沙丁魚屬魚類為單倍體群體，遺傳分化水平較高，COI基因序列無法識別該屬中的隱種和種群結構，需要借助高度特化的核DNA標記進一步分析。本文僅借助COI基因序列可能無法對沙丁魚屬進行種水平的準確劃分，為謹慎起見，僅保留鑒定至屬的分類結果。近年來，陸續(xù)發(fā)表的一些基因片段如12S rRNA、16S rRNA和Cytb等均可用于魚類種類鑒定研究[26-27]。因此，在形態(tài)分類結合DNA條形碼的基礎上，要實現(xiàn)對魚卵準確的物種鑒定，還需要結合更多的序列片段分析，以提高種類鑒定及早期魚類形態(tài)判別的準確性。此外，準確性高、完整性強及基因片段豐富的成魚數(shù)據(jù)庫是序列分析鑒定種類的前提。南海DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的建立[28]，使珠江口及近岸海域魚卵種類鑒定的準確性得到了提高。Hou等[29]使用DNA條形碼和形態(tài)學共鑒定出珠江口春季和秋季的魚卵仔稚魚75個分類群，初步構建了珠江口魚卵仔稚魚的形態(tài)數(shù)據(jù)庫。本文同樣依托公開數(shù)據(jù)庫，探討江門海域春季魚卵的形態(tài)特征及分類。

3.2 江門海域春季魚卵種類的形態(tài)及其初步分類探討

魚卵發(fā)育早期的種類鑒定主要以觀察其內(nèi)部形態(tài)為主，本文采獲的魚卵樣品最明顯的分類特征在于魚卵形狀、卵徑、油球、卵周隙等。我國海域廣泛分布有鯡科和鳀科魚類，種類數(shù)量均超過20種，其中記錄在冊的鯡科、小公魚屬魚類多達9種[30]。小公魚屬和鳀屬同屬于江門海域常見種類[18,31]，魚卵形狀均為橢圓形，其早期魚卵形態(tài)及胚胎發(fā)育變化極為相似，有無油球是兩者最明顯的鑒定特征[32]。對魚卵樣品進行形態(tài)學觀測，卵徑范圍為0.658～1.615 mm，油球徑范圍為0.042～0.193 mm，13種魚卵的發(fā)育時期存在差異，致使測量值有一定程度的重疊，不能作為魚卵分類的準確依據(jù)。沙丁魚屬魚卵最明顯的分類特點是卵徑較大、卵黃囊較小、卵周隙寬，本文獲取的沙丁魚屬魚卵卵徑、卵黃囊及卵周隙大小均與趙孝威等[33]研究的青鱗沙丁魚 (Sardinella zunas) 早期發(fā)育階段的形態(tài)相契合，但油球尺寸與其差異較大，現(xiàn)有的形態(tài)學資料無法鑒定到種。舌鰨屬魚卵的結構特征具有一定的相似性[34]，舌鰨屬魚卵的顯著特征為多油球，根據(jù)萬瑞景等[35]得出的魚卵形態(tài)特征，可初步判定3種魚卵皆為舌鰨屬魚卵。叫姑魚屬隸屬石首魚科，在《中國近海魚卵與仔魚》[36]中詳細記錄了叫姑魚屬受精卵和胚體環(huán)繞卵黃1/2時期魚卵內(nèi)部的形態(tài)變化特征，本文研究的叫姑魚屬卵徑和油球徑均在其記錄的合理范圍內(nèi)。科早期生活史的形態(tài)學基礎資料相較于其他魚類魚卵是最為完整的，萬瑞景和張仁齋[5]通過人工授精和孵化詳細記錄了多鱗魚卵11個發(fā)育時期的形態(tài)變化特征。相近種類魚卵的結構特征具有一定的相似性[34]，單純依靠形態(tài)學分類難以將相近種類鑒定到種。鲾科魚類個體較小、數(shù)量較大，在珠江口海域一直處于優(yōu)勢地位[37]，然而其早期生長階段的形態(tài)變化卻未被完全掌握，沖山宗雄[38]以圖簡單示出頸斑項鲾 (Nuchequula nuchalis)魚卵的形態(tài)，本文所獲取鲾科魚卵的形態(tài)特征可對現(xiàn)有資料進行有效補充。早期形態(tài)特征研究多關注具有重要經(jīng)濟價值的種類，如日本鰻鱺 (Anguilla japonica)[39]和馬口魚 (Opsariichthys bidens)[40]等，許多個體小、經(jīng)濟價值低但數(shù)量較大且具有重要生態(tài)作用的種類未被重視[15]，因而珠江口江門海域常見小型魚類早期發(fā)育階段的形態(tài)鑒定資料較少。本文通過對種類鑒定結果與鮮活樣品的形態(tài)記錄進行分析，對江門海域13種魚卵的形態(tài)特征進行了描述，可為今后江門海域魚卵形態(tài)的研究提供基礎資料。

3.3 不足及展望

本文依據(jù)從采獲樣品中獲取的魚卵形態(tài)特征，結合歷史資料，嘗試依據(jù)魚卵形狀和大小、卵周隙寬窄、油球數(shù)量和色素分布等特征進行總結，可大致將研究海域春季魚卵種類進行初步分類，但研究仍存在許多不足。首先，魚卵不同發(fā)育階段的形態(tài)變化較大，本文僅可獲取魚卵單一發(fā)育階段的形態(tài)信息，未掌握其他發(fā)育階段的形態(tài)特征。種屬間相近種類魚卵內(nèi)部形態(tài)特征相似，難以根據(jù)單一階段形態(tài)進行區(qū)分，還需結合人工培養(yǎng)等獲取魚卵更多發(fā)育階段可靠的形態(tài)學信息。珠江口江門海域作為魚類重要的產(chǎn)卵場，本文通過單次采樣獲得的種類相對有限，構建完整的形態(tài)分類檢索還需依托更多的采樣調(diào)查。其次，本文采集的是鮮活魚卵樣品，種類豐富、個體數(shù)量多，短期內(nèi)獲得了多個種類的形態(tài)特征信息，但是魚卵樣品處理及形態(tài)記錄需要一定時間，所處水體環(huán)境的驟然改變，導致某些種類魚卵的保存狀態(tài)變差。部分樣品基因組降解導致種類鑒定失??；部分樣品受到水霉菌等的污染而死亡，導致魚卵內(nèi)部模糊不清，也在某種程度上改變了樣品的外在形態(tài)，影響了魚卵種類鑒定和形態(tài)特征獲取的效果。為盡可能獲取更多發(fā)育階段魚卵的形態(tài)特征，野外采獲后的魚卵需保持水體潔凈，并在減少人為干擾的情況下盡快觀察和記錄其形態(tài)。公共數(shù)據(jù)庫中序列的豐富性、準確性和完整性可極大地影響DNA條形碼的鑒定結果[17,29]，此外，沙丁魚屬等種類屬于單倍型群體，單一的COI片段不能滿足其鑒定至種的要求，因而加快建立并完善相關海域多種類、多片段的成魚基因數(shù)據(jù)庫是應用DNA條形碼準確鑒定魚卵的必要前提條件。同時在進行魚卵資源調(diào)查時，結合同期采集的成魚樣品進行種類分析或可提高魚卵鑒定及其形態(tài)特征獲取的準確性[8,41]。

4 結論

本文根據(jù)2021年春季珠江口江門海域的浮游生物調(diào)查，闡述了江門海域13種常見魚卵的形態(tài)學特征。研究發(fā)現(xiàn)大部分魚卵可通過卵膜形狀，卵徑大小，油球數(shù)量、分布及其色素分布，卵周隙寬窄，胚體上色素胞顏色、數(shù)量及分布等形態(tài)特征進行分類。然而相近種類難以通過單一發(fā)育階段的形態(tài)特征進行準確區(qū)分，文中借助DNA條形碼技術對形態(tài)學分類結果進行驗證，發(fā)現(xiàn)兩者的鑒定結果在科水平上較為一致，且DNA條形碼技術能成功對江門海域魚卵進行更低階元的劃分。受限于公共數(shù)據(jù)庫中魚類數(shù)據(jù)的完整性和準確性，借助DNA條形碼進行種類分析時，為謹慎起見，相關魚卵種類未能鑒定至種。本文首次針對珠江口江門海域春季魚卵種類進行形態(tài)特征研究，未涉及其他季節(jié)，魚卵種類相較于同期捕獲的成魚種類較少，今后為更全面地掌握珠江口江門海域魚卵的形態(tài)特征和檢索資料，還需要進行重復采樣和深入研究。