2種彩葉植物穿孔病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

肖宇

（唐山園林科學(xué)研究所，河北 唐山，063000）

紫葉李和紅葉碧桃作為重要的彩葉樹種，是觀花、觀果和觀葉集一起的優(yōu)良觀賞樹種，既可以提供良好生態(tài)效益，又可以產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)效益。這2種植物在唐山地區(qū)園林綠化工程中得到了大量的應(yīng)用。其樹葉色彩艷麗，樹形多樣，觀景時(shí)間長，容易形成大面積觀賞群。但是隨著紫葉李和紅葉碧桃栽培應(yīng)用的逐漸增加，其病蟲害的發(fā)生也隨之增加，其中以褐斑穿孔病較為嚴(yán)重。褐斑穿孔病發(fā)生初期，葉片上出現(xiàn)紫褐色小點(diǎn)，后期逐漸擴(kuò)展為圓形或近圓形，略帶輪紋，直至病斑脫落形成穿孔。濕度大時(shí)，病斑處出現(xiàn)灰色霉?fàn)钗?，同時(shí)也危害枝稍。發(fā)生嚴(yán)重時(shí)引起落葉，甚至植株死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失。此病侵染的植物種類繁多，如桃樹、櫻桃樹、李樹等[1-4]。

目前對(duì)紫葉李和紅葉碧桃的研究大多數(shù)都聚焦在環(huán)境因子以及栽培管理方面[5-13]，如鹽脅迫、光照、溫濕度、施肥等因素。紫葉李和紅葉碧桃上發(fā)生病蟲害及其防治的研究也多有報(bào)道[14-24]，但針對(duì)褐斑穿孔病的相關(guān)研究比較少，僅李莉[16]和霍學(xué)紅[17]對(duì)紫葉李褐斑穿孔病進(jìn)行過報(bào)道，在紅葉碧桃上的研究鮮有報(bào)道。不同農(nóng)藥對(duì)這2種植物上褐斑穿孔病菌的抑制效果沒有系統(tǒng)的比較分析。

褐斑穿孔病是真菌引起的病害，真菌的鑒定可以從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)2方面進(jìn)行。目前在園林綠化養(yǎng)護(hù)過程中，對(duì)植物病害的防治僅是根據(jù)病害癥狀進(jìn)行防治，具有盲目性，為病害的根本防治帶來困難。對(duì)病害病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，明確引起植物病害的病原菌具體的分類地位，進(jìn)而為病害的根本防治提供依據(jù)。當(dāng)前對(duì)紫葉李和紅葉碧桃上褐斑穿孔病及其病原菌的防治藥劑及防治效果還缺乏針對(duì)性研究。因此本研究對(duì)這2種彩葉植物褐斑穿孔病病原菌進(jìn)行分離、純化和形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定其在真菌中的分類地位，選取6種藥劑，測(cè)定了對(duì)褐斑穿孔病菌的抑制作用，旨在為該病在田間有效防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株材料 紫葉李穿孔病菌株Z1、Z2，分離自唐山市大釗公園內(nèi)發(fā)病的紫葉李植株上；紅葉碧桃穿孔病菌株B1、B2，分離自唐山市西外環(huán)綠化帶內(nèi)發(fā)病的碧桃植株上。以上菌株均經(jīng)過分離純化并由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試驗(yàn)藥劑A：20%二氯異氰尿酸鈉SP（威海韓孚生化藥業(yè)有限公司），B：80%代森錳鋅WP（河南省萊恩坪安園林植保有限公司），C：80%多菌靈WP（北京為民生物科技有限公司），D：20%二氯異氰尿酸鈉SP（河南省萊恩坪安園林植保有限公司），E：16%苯甲·中生WP（深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司），F(xiàn)：1.2%辛菌胺醋酸鹽AS（山東勝邦綠野化學(xué)有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA），按方中達(dá)[25]方法配置。

1.2 試驗(yàn)處理

18個(gè)處理：A稀釋300、500倍；B稀釋1500、2000倍；C稀釋500、1000倍；D稀釋500、800倍；E稀釋500、600、750、800、1000倍；F稀釋50、100、150、200、300倍。均用無菌水稀釋。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌的分離 根據(jù)方中達(dá)[25]方法，進(jìn)行真菌的常規(guī)分離純化，并保存于PDA斜面試管中。

1.3.2 病原菌致病性測(cè)定 采集紫葉李和紅葉碧桃新長成的健康嫩葉，用清水沖洗干凈，用70%的酒精進(jìn)行表面消毒，用滅菌后的蒸餾水沖洗3次，葉柄部用濕棉球包裹住保濕，平鋪在有3層濾紙的培養(yǎng)皿中備用；用接種針挑取平板上孢子，接種于帶有人工處理傷口（用砂紙輕輕擦傷）的葉片上，培養(yǎng)皿內(nèi)保持一定的濕度，放置在26℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，對(duì)照為無菌水處理的葉片，逐日觀察，記錄接種結(jié)果。

1.3.3 菌株形態(tài)學(xué)特征的觀察 將分離純化得到的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，期間觀察并記錄下菌株在培養(yǎng)基上的生長狀況，并用插片法[26]檢查菌株的形態(tài)特征，根據(jù)記錄的菌株生長狀況、菌落特征和菌絲、分生孢子梗、分生孢子的形態(tài)特征，按照真菌鑒定手冊(cè)、中國真菌志[27-29]進(jìn)行分類檢索，確定各個(gè)菌株在分類學(xué)中的分屬。

1.3.4 藥劑抑制作用 在無菌的條件下，將配置好的PDA培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，加入配置好的母液，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿中待用。取1 mm×1 mm大小的生長菌絲塊接到含有藥劑的PDA培養(yǎng)基中央，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置3次重復(fù)，不含藥培養(yǎng)基作為對(duì)照。每24 h觀察記錄菌落的直徑，4 d后計(jì)算各農(nóng)藥制劑的抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照培養(yǎng)基菌落直徑-加藥培養(yǎng)基菌落直徑）/對(duì)照培養(yǎng)基菌落直徑×100%

菌斑相對(duì)直徑=加藥培養(yǎng)基菌落直徑/對(duì)照培養(yǎng)基菌落直徑×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

菌株Z1：菌落不透明，圓形，菌絲絨毛狀、豐富，初期白色或青色，后期灰褐色或灰黑色，菌落背面綠色至青褐色。菌絲有隔膜；分生孢子梗淺褐色，有分隔，直立或屈膝狀彎曲。分生孢子單生，或成短鏈生，卵形或橢圓形，中褐色至深褐色，具橫縱隔膜。根據(jù)其形態(tài)學(xué)的鑒定，初步確定菌株Z1為鏈格孢屬真菌（圖1）。

圖1 菌株Z1的形態(tài)特征

菌株Z2：菌落圓形，表面平展，呈密實(shí)的絨狀，灰白色至青綠色，背面淡褐色至黑色，有同心輪紋。菌絲有隔膜；分生孢子梗直或彎曲，淡褐色，有分隔。分生孢子倒棍棒狀、卵形或橢圓形，黃褐色，有橫縱隔膜。根據(jù)其形態(tài)學(xué)的鑒定，初步確定菌株Z2為鏈格孢屬真菌（圖2）。

圖2 菌株Z2的形態(tài)特征

菌株B1：菌落圓形，表面附有密實(shí)的絨毛狀菌絲，灰白色至灰褐色，邊緣整齊；背面淡褐色至黑色。菌絲有隔膜，分生孢子梗淡褐色至褐色，有分隔，有分支，直或者彎曲。分生孢子倒棍棒狀，卵形、倒梨形或近橢圓形，淡褐色至褐色，有橫縱隔膜，分隔處不縊縮或略縊縮。短喙柱狀或錐狀，部分轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)孢細(xì)胞（假喙）。根據(jù)其形態(tài)學(xué)的鑒定，初步確定菌株B1為鏈格孢屬真菌（圖3）。

圖3 菌株B1的形態(tài)特征

菌株B2：菌落圓形，表面呈密實(shí)的絨狀，邊緣整齊，灰白色至青綠色，背面淡褐色至黑色。菌絲有隔膜；分生孢子梗直或彎曲，淡褐色，有分隔，偶有分枝。分生孢子倒棍棒狀，卵形或長橢圓形，黃褐色，有橫縱隔膜。根據(jù)其形態(tài)學(xué)的鑒定，初步確定菌株B2為鏈格孢屬真菌（圖4）。

4株菌株在菌落表面均呈絨毛狀，但顏色存在差異；分生孢子梗均有分隔；分生孢子的顏色為淡褐色至深褐色之間，均有隔膜，差異在于分生孢子形狀以及大小、有無縊縮、有無假喙。

2.2 病原菌的致病性測(cè)定結(jié)果

接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，26℃恒溫培養(yǎng)2 d后，4株菌株均能在接種點(diǎn)處出現(xiàn)菌絲（圖5），4 d開始形成病斑，與自然發(fā)病的葉片葉斑一致。后期病斑擴(kuò)大至整個(gè)葉片，有的葉片出現(xiàn)穿孔。結(jié)果符合柯赫氏法則，表明4株菌株為褐斑穿孔病的病原菌。

圖5 紫葉李葉片離體接種試驗(yàn)

2.3 不同農(nóng)藥及倍數(shù)對(duì)褐斑穿孔病菌的抑制效果

由表1可以看出，只有50倍1.2%辛菌胺醋酸鹽AS對(duì)菌株Z1的抑菌率在90%以上，效果較好，其他抑菌效果次之；600、750倍16%苯甲·中生WP以及50、100、200倍1.2%辛菌胺醋酸鹽AS對(duì)菌株Z2的抑菌率在90%以上，效果較好，其他的試驗(yàn)處理抑菌效果次之，20%二氯異氰尿酸鈉SP（D）和80%代森錳鋅WP抑菌效果最差；500倍多菌靈、500倍苯甲·中生和50倍辛菌胺醋酸鹽對(duì)菌株B1的抑菌率達(dá)到90%以上，效果較好，其他的試驗(yàn)處理抑菌效果次之，800倍20%二氯異氰尿酸鈉SP（D）和80%代森錳鋅WP抑菌效果最差；500倍80%多菌靈WP，500、600、750、1000倍16%苯甲·中生WP，50倍1.2%辛菌胺醋酸鹽AS對(duì)菌株B2的抑菌率在90%以上，其他的抑菌效果次之，500倍20%二氯異氰尿酸鈉SP（A）、80%代森錳鋅WP和800倍20%二氯異氰尿酸鈉SP（D）抑菌效果最差。

表1 不同農(nóng)藥及濃度對(duì)褐斑穿孔病菌的抑制效果

3 結(jié)論與討論

本研究從菌落顏色、分生孢子的形態(tài)特征和菌絲有無隔膜等方面，初步確定了分離純化的菌株Z1、Z2、B1和B2為鏈格孢屬真菌。園林植物上常用的殺菌劑有多菌靈、甲基硫菌靈、三唑酮、百菌清和代森錳鋅等。本試驗(yàn)選取了市場(chǎng)上出現(xiàn)比較頻繁的6種農(nóng)藥制劑，測(cè)定其對(duì)褐斑穿孔病菌的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.2%辛菌胺醋酸鹽AS、80%多菌靈WP和16%苯甲·中生WP對(duì)菌株的抑制效果較佳，該結(jié)果對(duì)田間防治褐斑穿孔病具有一定指導(dǎo)作用。

本試驗(yàn)只是在形態(tài)學(xué)方面對(duì)褐斑穿孔病病原菌進(jìn)行了鑒定，雖然4株病原菌的分生孢子存在差異，但是形態(tài)學(xué)鑒定不能鑒別病原菌的種或者?；?。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)同一農(nóng)藥的同等濃度對(duì)不同的褐斑穿孔病菌菌株表現(xiàn)出的抑制作用存在較大差異，這與鏈格孢屬真菌的小種或?qū)；椭g對(duì)農(nóng)藥的敏感度存在差異[30]?？傆行С煞趾肯嗤乃巹捎诓煌纳a(chǎn)廠家，對(duì)相同菌株的以及作用也存在差異。長時(shí)間使用同一藥劑防治褐斑穿孔病，有可能使病原菌產(chǎn)生抗藥性，為防止病原菌抗藥性產(chǎn)生，可交替使用其他作用機(jī)制的藥劑。綜合本試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)田間褐斑穿孔病防治提供了一些基礎(chǔ)。