超聲輔助吐溫80提取發(fā)芽小米GABA和多酚的工藝優(yōu)化

高曉麗，鮑玉琪

（呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033001）

小米，也稱之為粟或稷，是禾本科草本植物粟米經(jīng)加工脫殼后的成品。小米中除富含維生素B1、B12、不飽和脂肪酸外，還含有纖維素、植物甾醇、多酚活性物質(zhì)、γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）等多種功能性成分[1]。多酚是具有多個酚基團(tuán)的一類化學(xué)元素的總稱[2]，小米中所含有的酚類物質(zhì)包括單寧、植酸、酚酸及其衍生物等，所有這些酚類物質(zhì)都具有降血糖、抗致突變、抗炎、抗衰老、防輻射等獨(dú)特的生理功效[3]。GABA是一種游離氨基酸，主要存在于胚芽中，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮保護(hù)功能[4]，還可促進(jìn)酚類物質(zhì)合成從而增強(qiáng)植物抗逆性[5-7]。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有抗壓健腦、增強(qiáng)長期記憶[8]、降血壓、抗焦慮[9]、解毒等多種功效[10]。植物中一般GABA含量較低[11]，但在受到刺激時含量會大量提升，如楊樹葉在受鹽脅迫后GABA含量增加了2倍[12]，機(jī)械損傷可使鮮切梨GABA累積[13]，而粟米發(fā)芽過程中因相關(guān)內(nèi)源酶激活而使發(fā)芽小米中酚類、黃酮類化合物及GABA的含量提升[14-15]。

基于發(fā)芽谷物較高的營養(yǎng)價值，目前國內(nèi)有較多的相關(guān)研究。徐麗[16]的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)芽處理的小米GABA含量提高了2.9倍，其得率為251.46 mg/100 g；李彩云[17]的研究表明粟谷樣品中黃酮、總氨基酸含量和必需氨基酸含量會隨發(fā)芽時間的延長而增加；沙坤等[18]的研究發(fā)現(xiàn)粟米在發(fā)芽過程中總酚含量逐漸增加，在72 h后趨于平緩，總酚含量達(dá)到約1.7 mg/g。以上研究都表明發(fā)芽可以有效提升小米中GABA和多酚的含量。

超聲波輔助表面活性劑提取法與傳統(tǒng)提取法相比，因具有提取時間短、效率高的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛研究與應(yīng)用。陳瓊等[19]的研究表明此法能優(yōu)化青錢柳中總黃酮的提??；肖道安[20]在吐溫80協(xié)同酶法提取桑葉總黃酮的研究中發(fā)現(xiàn)吐溫80有顯著的增溶作用。本文旨在通過超聲輔助-表面活性劑法富集發(fā)芽小米中GABA和多酚物質(zhì)的含量，提高發(fā)芽小米GABA和多酚的得率，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，以期降低成產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷米：山西天公種業(yè)有限公司；谷芽：安國市廣盛商貿(mào)有限公司；吐溫80（化學(xué)純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純98%）：上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純98%）、福林酚試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；次氯酸鈉、重蒸酚、硼酸（化學(xué)純）：天津市化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB-3200DTDN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；高速萬能粉碎機(jī)（FW-400A）：北京科偉永興儀器有限公司；可見分光光度計(jì)（VIS-723N）：北京瑞利分析儀器有限公司；臺式高速離心機(jī)（Neofuge13）：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)芽小米制備與前處理

谷米經(jīng)除雜和清洗后與3.5 mmoL/L的CaCl2溶液以 1∶10（mg/mL）的比例混合，35℃下浸泡 12 h后平鋪放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，再覆蓋上六層紗布，控制發(fā)芽濕度95%，在30℃下發(fā)芽72 h，之后45℃下烘干制得成品發(fā)芽小米。

參考寧亞維等[21]的方法脫除發(fā)芽小米中的黃色素：準(zhǔn)確稱取干燥后的發(fā)芽小米粉1.0 g置于錐形瓶中，首先加入5 mL無水乙醇提取發(fā)芽小米中的黃色素，于60℃水浴保溫2 h，然后于8 000 r/min、離心20 min以后，上清液即為黃色素提取液，將其棄去留取沉淀物。1.3.2 GABA的提取和優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.2.1 GABA的提取與測定

取上述沉淀物，按一定料液比加入吐溫80溶液，設(shè)置提取溫度、超聲功率，經(jīng)超聲提取后，測定GABA得率。空白對照：脫去黃色素的沉淀物加10倍蒸餾水于40℃下浸提1 h，每隔10 min搖動一次，得粗提液。粗提液于10 000 r/min條件下離心15 min后得到待測提取液，測定GABA得率。參照趙大偉等[22]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定GABA含量。

1.3.2.2 單因素試驗(yàn)

取脫除黃色素的發(fā)芽小米沉淀物5份，設(shè)置不同吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、2%、4%、6%、8%）、超聲溫度（20、25、30、35、40 ℃）、超聲時間（5、15、25、35、45 min）、料液比[1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22（g/mL）]、超聲功率（90、108、126、144、162 W），研究各單因素對 GABA 得率的影響。以吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度25℃、超聲時間15 min、超聲功率126 W為基準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2.3 正交試驗(yàn)

以GABA得率為指標(biāo)，以吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時間、料液比和超聲功率5個因素作為影響發(fā)芽小米多酚得率的主要因素，并設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 GABA提取正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor level of GABA extraction orthogonal test

1.3.3 多酚的提取和優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.3.1 多酚提取與測定

取脫去黃色素的發(fā)芽小米沉淀物，加入5倍質(zhì)量、體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇和一定量的吐溫80溶液，設(shè)定超聲功率162 W，在不同溫度下提取多酚，測其得率。

空白對照：取脫去黃色素后的沉淀物，加入5倍70%的乙醇，真空抽濾后在5 000 r/min的條件下離心10 min，定容得到待測提取液。多酚含量測定參照朱仙慕等[23]和王若蘭等[24]的Folin-Ciocaltue法測定。

1.3.3.2 單因素試驗(yàn)

取經(jīng)脫去黃色素的發(fā)芽小米沉淀物5份，設(shè)置不同吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5%、10%、15%、20%、25%）、超聲溫度（25、35、45、55、65 ℃）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]作為4個單因素，考察各因素對多酚得率的影響。以吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%、料液比 1∶10（g/mL），超聲溫度 45℃、超聲時間10 min為基準(zhǔn)試驗(yàn)條件。

1.3.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

以吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時間、料液比4個因素為自變量，選取得率較高的3個水平，以多酚得率為響應(yīng)值，分析各因素對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Response surface experimental design

1.4 數(shù)據(jù)處理

用origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制；采用正交設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)及方差分析確定發(fā)芽小米GABA最佳提取工藝；采用Design-Expert 10.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，并進(jìn)行方差分析優(yōu)化多酚提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA的提取

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對GABA得率的影響

吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對GABA得率的影響見圖1。

圖1 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對GABA得率的影響Fig.1 Effect of Tween 80 mass fraction on GABA yield

經(jīng)試驗(yàn)得到空白對照組GABA的得率為1.213mg/g。由圖1可知，與空白組相比，加入吐溫80后GABA的得率大幅度增加，原因可能是由于GABA自身極易溶于水，且吐溫80作為增溶劑可以降低溶液表面張力，更利于被超聲波破碎的細(xì)胞中易溶性物質(zhì)的浸出；吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時，隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，GABA的得率不斷減小，其原因可能是吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了臨界膠束濃度，且其對其它雜質(zhì)的增溶作用也會影響吸光度的大小[25]。由此可以確定最佳吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

2.1.1.2 超聲溫度對GABA得率的影響

超聲溫度對GABA得率的影響見圖2。

圖2 超聲溫度對GABA得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on GABA yield

由圖2可知，GABA得率隨超聲溫度的升高先增大后減少，當(dāng)超聲溫度為30℃時得率最高。此變化的原因可能是溫度較低，分子的熱運(yùn)動緩慢，在較短的時間不能完全浸出；當(dāng)溫度上升至超過30℃時，其得率下降，原因可能是由于，溫度過高，破壞了GABA結(jié)構(gòu)，使得GABA從提取液中析出，其得率反而下降[26]，可初步確定因素最佳水平為30℃。

2.1.1.3 超聲時間對GABA得率的影響

超聲時間對GABA得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對GABA得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on GABA yield

由圖3可知，在控制其它條件不變的情況下，隨超聲時間的延長，GABA得率在5 min～25 min內(nèi)不斷增加，當(dāng)超聲時間達(dá)到25 min時，發(fā)芽小米GABA的得率達(dá)到最大值（2.219 mg/g）；而繼續(xù)延長超聲波提取時間，GABA得率的增加效果并不明顯，且逐漸趨于平穩(wěn)?？赡苁且?yàn)樵诖藯l件下，提取液中溶質(zhì)濃度已經(jīng)達(dá)到固液平衡，延長超聲時間提取效果優(yōu)化并不明顯。確定GABA適宜的超聲提取時間為25 min。

2.1.1.4 料液比對GABA得率的影響

料液比對GABA得率的影響見圖4。

圖4 料液比對GABA得率的影響Fig.4 Effect of material liquid ratio on GABA yield

由圖 4 可知，料液比為 1∶14（g/mL）～1∶20（g/mL）時，隨著提取溶劑用量的增加，發(fā)芽小米粉與料液的接觸面積增大，使得GABA的得率增加；在1∶20（g/mL）之后，繼續(xù)增加濃度差不僅使得單位提取液中GABA的濃度降低，而且增大提取溶劑用量的同時會增加生產(chǎn)成本，因此從生產(chǎn)成本和GABA提取效果兩個角度考慮，確定最佳的提取料液比為1∶20（g/mL）。

2.1.1.5 超聲功率對GABA得率的影響

超聲功率對GABA得率的影響見圖5。

圖5 超聲功率對GABA得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on GABA yield

由圖5可知，GABA得率隨著超聲功率的增加先增大，當(dāng)超聲功率為126 W時得率達(dá)到最大值，這可能是由于在90 W～108 W內(nèi)，隨超聲功率增加其振動頻率也增大，分子熱運(yùn)動加劇，使得GABA更容易溶出[27]，故其得率不斷增加；超聲功率在108 W～126 W時，GABA的增長幅度較小，可能是因?yàn)槌暡▽Πl(fā)芽小米細(xì)胞的破壞作用使得GABA的溶出較完全，繼續(xù)增大功率其得率不會顯著增大；當(dāng)超聲功率大于126 W時，GABA得率降低，但降低趨勢較為平緩。其原因可能是盡管GABA分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但超聲波功率過高也會對GABA分子結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，影響其得率。因此從節(jié)約能源和提取效果兩方面考慮，確定最適超聲功率為126 W。

2.1.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

由表3可知，正交試驗(yàn)最佳提取工藝條件為A3B4C2D2E2，即吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，超聲溫度為35℃，超聲時間 25 min，料液比 1∶18（g/mL），超聲功率為126 W。比較4個因素的極差大小可知對評價指標(biāo)影響的大小關(guān)系依次為A、E、D、B、C，其中吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對得率的影響最大，其次是超聲功率、料液比、超聲溫度，超聲時間的影響最小。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4和表5。

表4 方差分析（a=0.05）Table 4 Analysis of variance

表5 方差分析（a=0.01）Table 5 Analysis of variance

方差分析結(jié)果表明在a=0.05時，5個因素對GABA得率無顯著性影響；在a=0.01時，A對GABA得率有顯著性影響。綜上所述，最佳提取工藝條件為A3B4C2D2E2，即吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，超聲溫度為35℃，超聲時間25 min，料液比 1∶18（g/mL），超聲功率為 126 W。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，最佳條件下得到發(fā)芽小米GABA的最終得率為4.70 mg/g，優(yōu)于其它試驗(yàn)組。

2.2 多酚提取

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響

吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響見圖6。

經(jīng)試驗(yàn)得到空白對照組多酚得率為0.651 mg/g。由圖6可知，在吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～10%時，多酚得率隨其濃度的增加而增大，這可能是由于吐溫80的增溶作用加速了多酚物質(zhì)的浸出；但當(dāng)吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%時，得率開始不斷降低，原因可能是其濃度過高大于臨界膠束濃度，溶入膠束中的多酚活性物質(zhì)的再溶出受到阻礙[28]，引起多酚得率下降。

圖6 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響Fig.6 Effect of Tween 80 mass fraction on polyphenol yield

2.2.1.2 超聲溫度對多酚得率的影響

超聲溫度對多酚得率的影響見圖7。

圖7 超聲溫度對多酚得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield

由圖7可知，多酚得率在25℃～45℃時，隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到45℃時，多酚得率達(dá)到峰值，呈現(xiàn)此變化趨勢的原因可能是淀粉加速破裂加快了多酚物質(zhì)溶出以及吐溫80分子的熱運(yùn)動加劇有利于對多酚的浸提；繼續(xù)升高溫度多酚的得率反而下降，其原因可能是由于高溫破壞了多酚的結(jié)構(gòu)且會使溶劑蒸發(fā)，導(dǎo)致料液比發(fā)生變化，多酚得率減少。因此選擇超聲溫度45℃較為適宜。

2.2.1.3 超聲時間對多酚得率的影響

超聲時間對多酚得率的影響見圖8。

圖8 超聲時間對多酚得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on polyphenol yield

由圖8可知，在超聲時間為0～20 min時，多酚得率大幅度增加，呈現(xiàn)此趨勢可能是由于延長超聲時間，超聲波的機(jī)械作用加速多酚物質(zhì)的溶出，使多酚得率增加；超聲時間在20 min時，多酚得率達(dá)到最高點(diǎn)；之后再延長超聲時間，多酚得率急劇下降，可能是因?yàn)槎喾臃肿咏Y(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在超聲波的空化作用產(chǎn)生的羥基自由基的作用下使得多酚氧化速率加快[29]，造成多酚物質(zhì)的得率降低，與此同時長時間暴露于空氣中的多酚易于被氧化和分解。故選取20 min為最佳超聲提取時間。

2.2.1.4 料液比對多酚得率的影響

料液比對多酚得率的影響見圖9。

圖9 料液比多酚對得率的影響Fig.9 Effect of material liquid ratio on polyphenol yield

由圖 9 可知，料液比在 1∶5（g/mL）～1∶15（g/mL）時，發(fā)芽小米粉中多酚的得率因提取溶劑用量的增多而增加，料液比為 1∶15（g/mL）時，多酚得率最高；當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加時，多酚得率反而降低，這可能是在此條件下提取溶劑的濃度梯度達(dá)到極限值。提取原料和提取溶劑的濃度梯度是提取物溶出的動力，較大的濃度梯度有利于提取物的溶出，但當(dāng)此濃度梯度達(dá)到一定極限時，繼續(xù)增加濃度梯度對提取物的溶出反而起抑制作用[30]，因此料液比選擇 1∶15（g/mL）最合適。

2.2.2 多酚提取優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6所示。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Response surface test results

用Design Expert10.0軟件對此模型進(jìn)行分析，經(jīng)擬合后得到該模型的回歸多項(xiàng)式方程：Y=1.97-0.089A-0.13B-0.056C+0.066D+0.057AB-0.11AC-0.18AD+0.26BC-0.082BD+0.027CD-0.34A2-0.36B2-0.38C2-0.27D2。

方差分析結(jié)果見表7。

由表7可知，此提取模型的P值小于0.000 1，說明該模型為極顯著，適用于發(fā)芽小米多酚提取過程；失擬誤差項(xiàng)P值為0.190 4>0.05，說明其為不顯著，即模型與試驗(yàn)值的誤差較??；其決定系數(shù)R2=0.964 5，說明發(fā)芽小米多酚提取得率的試驗(yàn)值與預(yù)測值之間有較高的擬合度；Radj2=0.929 1，Rpred2=0.815 9，兩者的差異較小，表明此模型可較好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系；信噪比為17.436大于4，即表示該模型可以用于預(yù)測。此二次回歸模型中因素C、D、AC對多酚得率的影響顯著；A、AD對多酚得率的影響為高度顯著；B、BC、A2、B2、C2、D2對多酚得率的影響為極顯著；因素AB、BD、CD對多酚得率的影響為不顯著。各因素的均方值可以反映出試驗(yàn)因素對響應(yīng)值多酚得率的重要性，均方值越大，表明對響應(yīng)值的影響程度越大。從表7可得對響應(yīng)值影響大小的因素依次為B>A>D>C。

表7 回歸方程的方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 7 Variance analysis and significance test of regression equation

用響應(yīng)面軟件得到各因素之間交互作用強(qiáng)弱的曲面圖和等高線圖，見圖10。

圖10 各因素兩兩之間交互作用的曲面圖和等高線圖Fig.10 Surface diagram and contour map of the interaction between two single factors

由圖10依據(jù)等高線圖的形狀可以較為清晰觀察出響應(yīng)值交互作用的顯著性，AC、AD、BC為橢圓形表示交互作用顯著，AB、BD、CD近似為圓形表示交互作用不顯著。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果，最佳工藝條件：吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%、超聲溫度42℃、超聲時間19 min、料液比1∶12.5（g/mL），在此條件下得到發(fā)芽小米多酚得率為1.99 mg/g，與預(yù)測值接近。

3 結(jié)論

本文以發(fā)芽小米為研究對象，采用超聲輔助表面活性劑法提取發(fā)芽小米中的GABA和多酚物質(zhì)。以吐溫80水溶液作為提取劑，在料液比1∶18（g/mL），吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，超聲功率為126 W，超聲時間25 min，超聲溫度35℃的條件下，發(fā)芽小米GABA得率最高，為4.70 mg/g。以吐溫80水溶液和60%的乙醇溶液作為浸提溶劑，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)芽小米多酚提取工藝，結(jié)果表明最佳提取工藝條件為吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%、超聲溫度為42℃、超聲時間為19 min、料液比為1∶12.5（g/mL）時，多酚得率為 1.99 mg/g。本研究對發(fā)芽作物活性物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在本研究中首次將吐溫80應(yīng)用于發(fā)芽小米GABA和多酚的提取，并采用超聲予以輔助，有效提升了GABA和多酚的得率，可為發(fā)芽產(chǎn)品以及活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。