甲酸聯(lián)合堿性H2O2處理南荻纖維素理化結(jié)構(gòu)及酶解特性

王巖，武小芬，蘇小軍，陳亮，李清明，王鋒

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

南荻（Miscanthus lutarioriparia）是我國(guó)特有的纖維型草本植物，具有生物量大，適應(yīng)性強(qiáng)和易繁殖栽培等優(yōu)點(diǎn)[1]。作為洞庭湖標(biāo)志性植物群落，其具有增強(qiáng)蓄洪能力、凈化水體、抑制藻類、防止水土流失等多重生態(tài)功能，對(duì)保護(hù)洞庭湖濕地生態(tài)系統(tǒng)具有重要的意義[2-3]。南荻幼時(shí)被稱為南荻筍，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，被譽(yù)為“洞庭蟲草”[4-5]。成熟期的南荻秸稈中纖維素含量可達(dá)40%～45%，可作為酶解制備葡萄糖的非糧原料。在食品領(lǐng)域，葡萄糖可用于提高產(chǎn)品風(fēng)味、口感和色澤[6]，也可作為碳源用于發(fā)酵食品的制作[7]；在工業(yè)生產(chǎn)中，葡萄糖可以進(jìn)行發(fā)酵制備生物乙醇[8]。

南荻中的纖維素不是單獨(dú)存在，其與半纖維素、木質(zhì)素緊密纏繞，形成致密結(jié)構(gòu)，很難直接酶解制備葡萄糖。因此，需要進(jìn)行合適的預(yù)處理來破壞南荻木質(zhì)纖維素的緊密結(jié)構(gòu)，提高纖維素酶解轉(zhuǎn)化效率。有機(jī)溶劑預(yù)處理是一種處理?xiàng)l件溫和，溶劑易回收、可循環(huán)使用的綠色處理方法，甲酸因其良好的木質(zhì)素溶解性，廣泛用于木質(zhì)纖維素的分離[9-10]。與其他有機(jī)溶劑相比，甲酸法可以有效分離玉米秸稈[11]、小麥秸稈[12]、竹子[13]中的木質(zhì)纖維素，并且分離得到的纖維素純度高，還可同時(shí)獲得木質(zhì)素和木糖等產(chǎn)品，有利于生物質(zhì)全組分的利用。

前期研究[14]確定了南荻甲酸分離的最優(yōu)工藝：甲酸濃度88%、溫度100℃、處理時(shí)間3 h，在該分離條件下纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的回收率分別可以達(dá)到91.7%、80.2%和85.3%，使得木質(zhì)纖維素組分得到很好的分離。然而，經(jīng)甲酸分離的纖維素出現(xiàn)甲酰化修飾，疏水性增加，影響其后續(xù)酶解轉(zhuǎn)化效率[15]。鐘秀紅等[16]采用6%NaOH、在100℃、60 min的條件下處理甲酸分離的闊葉漂白木漿，有效去除了纖維素的甲?；?。Lim等[17]以薇甘菊為原料，經(jīng)10%NaOH、處理3 h后纖維素含量增加，半纖維素和木質(zhì)素含量降低，并顯著提高纖維素的吸濕率。這些研究結(jié)果表明，堿性條件處理可以破壞纖維素甲?；Y(jié)構(gòu)，增加原料吸濕率和可及性，從而提高酶解轉(zhuǎn)化效率。因此，本試驗(yàn)以南荻秸稈為原料，采用甲酸聯(lián)合堿性H2O2處理得到南荻纖維素，并對(duì)處理前后的樣品進(jìn)行理化結(jié)構(gòu)以及酶解特性研究，探討堿性H2O2處理提高南荻纖維素酶解效率的機(jī)制，為利用南荻秸稈制備葡萄糖提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

南荻秸稈采自湖南洞庭湖流域，自然風(fēng)干，粉碎過40目篩備用；纖維素酶（Cellic Ctec 3，濾紙酶活120 FPU/mL）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；甲酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)88%）：衡陽(yáng)市凱信化工試劑股份有限公司；硫酸、氫氧化鈉、過氧化氫、冰乙酸、無水乙酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-葡萄糖、D-木糖、D-纖維二糖（標(biāo)準(zhǔn)品）：美國(guó)Sigma-aldrich公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（Sartarins）：薩特里厄斯科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀（UltiMate 3000）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（1510-02624）、傅里葉紅外光譜（Nicolet Is 5）、離心機(jī)（MICRO 21 R）：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；壓片機(jī)（HY-12）：天津天光光學(xué)儀器有限公司；全自動(dòng)液氮冷凍研磨機(jī)（JXFSTPRP-Ⅱ-01）：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；X射線衍射儀（D 8 Advance）：德國(guó)布魯克公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（YSQ-LS-50 S 11）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫水浴鍋（HH-420）：常州億能儀器廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2102 C）：上海智城分析儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGH-9246 A）：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；調(diào)速玻璃反應(yīng)釜（GRL-20）：鄭州長(zhǎng)城工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

1）甲酸處理：稱取南荻秸稈粉1 200 g于20 L玻璃反應(yīng)釜中，加入12 L質(zhì)量分?jǐn)?shù)88%的甲酸溶液，在溫度100℃、150 r/min條件下反應(yīng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻抽濾，濾渣用去離子水洗至中性，60℃烘干保存，不同批次制備的樣品混勻備用，即為南荻甲酸（formic acid，F(xiàn)A）纖維素[14]。

2）堿性H2O2處理：取上述制備的南荻FA纖維素1 200 g于20L玻璃反應(yīng)釜中，加入12L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaOH和0.5%的H2O2混合溶液，于70℃、150 r/min條件下反應(yīng)1.5 h后進(jìn)行抽濾，濾渣用去離子水洗至中性，60℃烘干保存，不同批次制備的樣品混勻備用，即為南荻堿性過氧化氫（alkaline hydrogen peroxide，AHP）纖維素。

1.3.2 組成成分分析

樣品纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定參照美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（National Renewable Energy Laboratory，NREL）所述方法[18]。取 0.300 0 g 樣品置于100 mL三角瓶中，加入3 mL 72%的H2SO4，30℃水浴處理1 h后加入84 mL蒸餾水，于高壓蒸汽滅菌鍋中反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，收集濾渣和濾液。濾渣105℃烘至恒重，即為酸不溶性木質(zhì)素；測(cè)定濾液在320 nm處吸光度，根據(jù)公式計(jì)算酸溶性木質(zhì)素含量；通過高效液相色譜測(cè)定濾液中葡萄糖和木糖含量，計(jì)算纖維素和半纖維素含量，計(jì)算公式如下。

式中：ε為特定波長(zhǎng)下摩爾吸光系數(shù)，波長(zhǎng)320 nm時(shí)為30 L/（g·cm）。

1.3.3 結(jié)構(gòu)特征分析

1.3.3.1 傅里葉紅外光譜測(cè)定

傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）用于分析處理前后南荻纖維素官能團(tuán)變化。將干燥后的樣品與KBr于瑪瑙研缽中充分研磨后進(jìn)行壓片，壓力范圍為20 MPa～25 MPa，時(shí)間為30 s，掃描 32 次，掃描范圍 400 cm-1～4 000 cm-1。

1.3.3.2 X射線衍射分析

60℃干燥后的樣品采用X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)量條件：靶材為Cu靶，管壓為40 kV，電流40 mA，掃描范圍為5°～50°，掃描速度6°/min。纖維素結(jié)晶度指數(shù)（crystallinity index，CrI）計(jì)算公式如下。

式中：I002指衍射角為22.6°附近衍射峰強(qiáng)度；Iam指衍射角為18.0°附近衍射峰強(qiáng)度。

1.3.3.3 掃描電鏡分析

采用掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察樣品表觀形態(tài)的變化。將60℃干燥的樣品放置在載物臺(tái)上，用導(dǎo)電膠將樣品固定、噴金，放置于掃描電鏡中，在15 kV～20 kV能量下觀察樣品的表觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，并記錄圖像。

1.3.4 酶解特性及酶吸附試驗(yàn)

1.3.4.1 酶解特性測(cè)定

酶解體系為10 mL，根據(jù)固液比準(zhǔn)確稱取樣品，酶添加量為20 FPU/g，在50℃、150 r/min的條件下酶解反應(yīng)120 h。分別在酶解不同時(shí)期取樣，采用高效液相色譜測(cè)定酶解液中葡萄糖含量，根據(jù)公式（6）計(jì)算酶解纖維素轉(zhuǎn)化率。

式中：C1為葡萄糖含量，g/L；0.9為轉(zhuǎn)化系數(shù)；M為樣品質(zhì)量，g；C2為纖維素含量，%；W為水分含量，%。

1.3.4.2 酶吸附量測(cè)定

經(jīng)BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)定纖維素酶中蛋白質(zhì)含量為0.429 g/L。設(shè)置酶吸附體系為10 mL，酶添加量為20 FPU/g纖維素樣品（纖維素酶蛋白含量為740.05 mg），分別稱取1 g南荻FA纖維素、南荻AHP纖維素分散于吸附體系中，在20℃、150 r/min的條件下吸附0、2、4、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min后終止反應(yīng)，收集濾液和濾渣，測(cè)定濾液中蛋白質(zhì)含量[19]。體系中加入的初始纖維素酶蛋白含量與不同時(shí)間吸附后濾液中蛋白含量之差即為樣品酶吸附量。每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。計(jì)算公式如下。

式中：C為樣品酶吸附量，g/L；C0為初始酶液質(zhì)量濃度，g/L；Ct為反應(yīng)t min后上清液中的酶液質(zhì)量濃度，g/L。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)平行，采用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 組分分析

不同處理的南荻樣品組成成分分析如表1所示。

由表1分析可知，南荻秸稈經(jīng)甲酸分離后，獲得的南荻FA纖維素中纖維素含量從41.35%明顯提高至76.52%，半纖維素和木質(zhì)素含量則呈下降趨勢(shì)；再經(jīng)堿性H2O2處理后的南荻AHP纖維素中木質(zhì)素含量下降至3.49%，纖維素含量提高至89.85%。南荻木質(zhì)纖維素在甲酸分離處理過程中，木質(zhì)素溶解于甲酸溶液、半纖維素酸解成可溶性木糖和低聚木糖，使得不溶性殘?jiān)陷禙A纖維素的含量提高；后續(xù)再經(jīng)堿性H2O2處理，制備的南荻AHP纖維素含量進(jìn)一步提高，是因?yàn)樵趬A處理過程中大量的木質(zhì)素被脫除，更加有利于后續(xù)酶解反應(yīng)的進(jìn)行。

表1 原料及不同處理階段南荻樣品組分變化Table 1 Components changes in raw materials and samples of Miscanthus lutarioriparius in different processing stages

2.2 理化結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 FTIR分析

南荻秸稈、南荻FA纖維素和南荻AHP纖維素的紅外光譜圖如圖1所示。

圖1 不同處理階段南荻纖維素FTIR光譜Fig.1 FTIR spectra of Miscanthus lutarioripariu cellulose in different processing stages

由圖1分析可知，南荻FA纖維素在1 714 cm-1處出現(xiàn)非共扼羰基特征峰，說明甲酸處理的南荻纖維素發(fā)生甲?；揎棧陷禔HP中該特征峰消失，說明經(jīng)堿性H2O2處理后去除了南荻FA纖維素中的甲?；鵞17]。與南荻FA纖維素相比，南荻AHP纖維素在1 515 cm-1和1 251 cm-1的紅外吸收峰消失，說明堿性H2O2可以進(jìn)一步脫除南荻樣品的木質(zhì)素。3 353 cm-1和2 899 cm-1分別為—OH和C—H伸縮振動(dòng)特征峰，1 317、1 165、1 062 cm-1的吸收峰為纖維素的特征峰，899 cm-1是纖維素β-糖苷鍵的特征峰，經(jīng)不同處理后樣品這些特征峰變化較小，表明南荻樣品經(jīng)甲酸聯(lián)合堿性過氧化氫處理后，其纖維素的基本結(jié)構(gòu)保留完整[20-21]。

2.2.2 XRD分析

結(jié)晶度指數(shù)一般用于表征纖維素的有序性，對(duì)于秸稈材料來說，結(jié)晶度指數(shù)越高，強(qiáng)度、硬度越大，溶脹性小，就越不利于酶解[22-23]。南荻秸稈及不同處理階段獲得的南荻纖維素樣品X-衍射光譜圖如圖2所示。

圖2 不同處理階段南荻纖維素的XRD光譜Fig.2 XRD spectra of Miscanthus lutarioripariu cellulose in different processing stages

由圖2分析可知，南荻原料結(jié)晶度指數(shù)為51.21%，經(jīng)甲酸分離獲得的南荻FA纖維素結(jié)晶度指數(shù)升高至67.39%，是由于甲酸處理去除了南荻原料中大量的木聚糖和木質(zhì)素，使得材料中纖維素含量增加，因此，結(jié)晶區(qū)纖維素的含量相應(yīng)增加。與FA纖維素相比，南荻AHP纖維素結(jié)晶度指數(shù)又降至61.20%，是因?yàn)榻?jīng)堿性H2O2的氧化處理，使纖維素形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、溶脹效應(yīng)增加，氫鍵發(fā)生破壞，從而導(dǎo)致結(jié)晶度指數(shù)下降。然而，南荻秸稈經(jīng)過預(yù)處理后，保留了其中90%的纖維素，使得纖維素中無定型區(qū)氫鍵增加，結(jié)晶區(qū)有序性也增大，因此南荻AHP纖維素的結(jié)晶度指數(shù)高于南荻秸稈原料。

2.2.3 SEM分析

南荻秸稈、南荻FA纖維素和南荻AHP纖維素掃描電鏡圖如圖3所示。

由圖3a可知，未經(jīng)處理的南荻秸稈結(jié)構(gòu)完整，表面較光滑。圖3b顯示甲酸法分離獲得的南荻FA纖維素表面變得粗糙并伴有不規(guī)則顆粒，在樣品表面觀察到規(guī)則的纖維紋路，經(jīng)堿性H2O2處理后的南荻AHP纖維素表面纖維結(jié)構(gòu)更加明顯，且紋路更清晰（圖3c），說明甲酸分離和堿性H2O2處理脫除了南荻大部分的木質(zhì)素和木聚糖，使更多纖維素暴露出來，大大增加其與纖維素酶的接觸幾率[24]。

圖3 不同處理階段南荻纖維素的SEM圖Fig.3 SEM images of Miscanthus lutarioripariu cellulose in different processing stages

2.3 酶解特性研究

2.3.1 酶解轉(zhuǎn)化率研究

不同底物濃度的南荻秸稈酶解轉(zhuǎn)化率和酶解液中葡萄糖濃度如圖4所示。

圖4 不同底物濃度下南荻秸稈酶解后的葡萄糖濃度和纖維素酶解轉(zhuǎn)化率Fig.4 Glucose concentration and cellulose conversion rate after enzymatic hydrolysis of Miscanthus lutarioripariu straw with different substrate concentration

由圖4a、4b分析可知，南荻秸稈酶解120 h，酶解液中葡萄糖含量隨著纖維素底物濃度的升高相應(yīng)增加；但不同底物濃度的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率無明顯變化，且均低于12%，說明未經(jīng)處理的南荻秸稈木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)致密，纖維素很難被酶和微生物作用，從而導(dǎo)致纖維素酶解轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低；而酶解液中葡萄糖濃度的增加主要來源于底物濃度的升高。

不同底物濃度的南荻FA纖維素酶解葡萄糖含量以及纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的變化如圖5所示。

圖5 不同底物濃度下南荻FA纖維素酶解后的葡萄糖濃度和纖維素酶解轉(zhuǎn)化率Fig.5 Glucose concentration and cellulose conversion rate after enzymatic hydrolysis of Miscanthus lutarioripariu FA cellulose with different substrate concentration

由圖5a可知，酶解120 h、底物濃度為5%時(shí)，南荻FA纖維素的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到61.87%，隨著底物濃度的增加，纖維素酶解轉(zhuǎn)化率逐漸降低，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0%時(shí)，降低至45.32%；且底物濃度為15%和20%南荻FA纖維素的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率不存在明顯差異；南荻FA纖維素酶解液中葡萄糖濃度隨著底物濃度的升高呈逐漸增加趨勢(shì)，20%底物濃度酶解120 h，葡萄糖濃度達(dá)到最高值75.51 g/L（圖5b）。

南荻AHP纖維素酶解葡萄糖含量以及纖維素酶解轉(zhuǎn)化率隨底物濃度的變化如圖6所示。

圖6 不同底物濃度下南荻AHP纖維素酶解后的葡萄糖濃度和纖維素酶解轉(zhuǎn)化率Fig.6 Glucose concentration and cellulose conversion rate after enzymatic hydrolysis of Miscanthus lutarioripariu AHP cellulose with different substrate concentration

由圖6可知，南荻AHP纖維素的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖濃度均在24 h內(nèi)迅速增加，然后隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)呈平緩上升趨勢(shì)；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，南荻AHP纖維素的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率可達(dá)95.54%（圖6a），說明在低底物濃度時(shí)，纖維素基本被全部酶解；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0%時(shí)，南荻AHP纖維素酶解120 h葡萄糖濃度可達(dá)133.17 g/L，此時(shí)纖維素酶解轉(zhuǎn)化率為68.87%，明顯高于南荻FA纖維素。說明堿性H2O2對(duì)南荻FA纖維素的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的提高具有很好的效果，是因?yàn)閴A性H2O2處理脫除了南荻FA纖維素的甲?；?，增加了其溶解性，從而促進(jìn)纖維素和纖維素酶的有效吸附，使得酶解效果更好。

2.3.2 纖維素酶吸附特性研究

南荻FA纖維素和南荻AHP纖維素對(duì)纖維素酶的吸附曲線如圖7所示。

圖7 不同處理階段的南荻纖維素對(duì)纖維素酶的吸附Fig.7 Adsorption of cellulase on Miscanthus lutarioripariu cellulose in different processing stages

由圖7a可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，南荻FA纖維素和南荻AHP纖維素對(duì)纖維素酶的吸附量逐漸增加，當(dāng)吸附時(shí)間為45 min時(shí)，它們對(duì)纖維素酶的吸附量分別為19.75 mg/g和14.00 mg/g，隨著吸附反應(yīng)的進(jìn)行，纖維素樣品對(duì)纖維素酶的吸附量無明顯增加，說明此時(shí)樣品對(duì)纖維素酶的吸附達(dá)到飽和。由前期南荻FA纖維素和南荻AHP纖維素的酶解試驗(yàn)可知，南荻AHP纖維素的轉(zhuǎn)化率要明顯高于南荻FA纖維素，這是因?yàn)槟陷禙A纖維素中木質(zhì)素含量較高，木質(zhì)素與纖維素之間競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合占據(jù)纖維素酶的結(jié)合位點(diǎn)，而木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附為無效吸附，是導(dǎo)致南荻FA纖維素酶解轉(zhuǎn)化率低的原因，這與黃麗菁等[25]提出的木質(zhì)素占據(jù)纖維素酶的結(jié)合位點(diǎn)，影響纖維素酶水解的結(jié)論一致。由圖7b分析可知，南荻FA纖維素和南荻AHP纖維素酶吸附后，在1 641 cm-1處出現(xiàn)新的肽鍵C—N伸縮振動(dòng)峰，此特征峰與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)[26-27]，說明南荻纖維素樣品與纖維素酶之間發(fā)生了吸附現(xiàn)象。

3 結(jié)論

南荻秸稈經(jīng)過甲酸聯(lián)合堿性H2O2處理制備的南荻AHP纖維素，脫除了南荻秸稈中大量的木質(zhì)素和半纖維素，其纖維素含量（89.85%）顯著高于南荻FA纖維素（76.52%）。經(jīng)堿性H2O2處理消除了甲酸分離過程中形成的甲?；Y(jié)構(gòu)，更加有利于南荻纖維素與纖維素酶的有效吸附，促進(jìn)酶解轉(zhuǎn)化率的提高和酶解體系中葡萄糖濃度增加。在高底物濃度（20%）條件下酶解120 h，南荻AHP纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率可達(dá)到68.82%，酶解液中葡萄糖濃度為133.08 g/L，明顯優(yōu)于南荻FA纖維素和南荻秸稈的酶解效果。然而，本試驗(yàn)所制備的糖液還有待進(jìn)行脫毒、脫色以及安全性評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步探索其在食品發(fā)酵以及食品添加劑等領(lǐng)域的研究應(yīng)用。