4種植物提取物的體外抗氧化活性比較

徐韶棠，楊軼浠，*，王藝瑾，郭育濤，劉雅寧，張佳敏，覃小穎，張玨

（1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106；3.四川良源食品有限公司，四川 巴中 636000）

脂質(zhì)氧化是影響食品品質(zhì)的主要原因之一，其主要產(chǎn)物為醛、環(huán)氧脂肪酸、亞硝基化合物等物質(zhì)。這些物質(zhì)不僅會(huì)影響食物的感官品質(zhì)，甚至可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)。目前使用抗氧化劑是食品抑制脂質(zhì)氧化的主要方法之一[1-3]。然而人工合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚、丁基羥基甲苯、沒(méi)食子酸丙酯和叔丁基對(duì)苯二酚等在抗氧化劑中占主導(dǎo)地位[4]。近年來(lái)，人們對(duì)食品中所添加的人工合成抗氧化劑的安全性問(wèn)題高度關(guān)注。一些研究表明合成抗氧化劑可能存在諸多副作用，會(huì)對(duì)人體的肝、脾、肺有不利影響，甚至可能會(huì)誘發(fā)惡性腫瘤等[5]。隨著植物資源的開(kāi)發(fā)和消費(fèi)者對(duì)食品品質(zhì)及安全的要求越來(lái)越高，取代有潛在安全風(fēng)險(xiǎn)的化學(xué)抗氧化劑已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[6]。

據(jù)報(bào)道，植物的抗氧化活性成分主要有黃酮類、多酚類、皂甙類、鞣質(zhì)類、維生素類、褪黑素類等[7]。其中黃酮和多酚類化合物是許多植物提取物的主要抗氧化活性成分，并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗過(guò)敏等多種生物活性及藥理作用[8-9]。因植物提取物在對(duì)抗氧化應(yīng)激所引起的神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心血管疾病、炎癥和糖尿病等各疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[10]，故對(duì)植物的抗氧化活性研究具有重要意義。

分心木是核桃內(nèi)的木質(zhì)隔膜，性味苦澀，具有很高的藥用價(jià)值和良好的抗氧化作用。但是經(jīng)常被當(dāng)作垃圾丟棄，造成很大的浪費(fèi)[11]。2020年，趕黃草通過(guò)國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心審查，批準(zhǔn)為新食品原料，成為藥食同源植物之一，其食用安全性受到認(rèn)可。趕黃草作為一種藥食同源植物，具有極高的藥用價(jià)值，甚至被賦予了“神仙草”的美譽(yù)[12]。代代花分布廣泛，資源豐富，同時(shí)具有很高的藥用價(jià)值，但是有關(guān)于代代花的研究報(bào)道較少[13]。青蒿作為一種常見(jiàn)的植物，從青蒿中提取的青蒿素可以用來(lái)治療瘧疾，因此具有極高的藥用價(jià)值[14]。這4種提取物據(jù)報(bào)道均含有多糖2.48%～17.12%、黃酮類2.54%～16.40%、多酚類2.39%～6.56%、氨基酸1.00%～3.21%等物質(zhì)[15-19]，并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗過(guò)敏等多種生物活性及藥理作用。

因此本研究將分心木、趕黃草、代代花、青蒿4種可食用植物及其副產(chǎn)物進(jìn)行提取，通過(guò)DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、鐵離子抗氧化能力法3種體外抗氧化能力測(cè)試，對(duì)4種植物提取物的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并將所得到結(jié)果與各植物提取物的總黃酮和總酚含量建立聯(lián)系，以期為天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

趕黃草（Penthorum chinense Pursh）：四川省古藺縣桂花鄉(xiāng)臣相趕黃草種植專業(yè)合作社；分心木（Diaphragma juglandis Fructus）、代代花（Citrus aurantium L.）：中國(guó)北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司；青蒿（Artemisia annua L.）水提取物：長(zhǎng)沙中仁生物科技有限公司。

總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測(cè)試劑盒（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP微板法）：上海源葉生物科技有限公司；蘆丁和亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉（分析純）：西安化學(xué)試劑廠；2，2-二苯基-1 苦基肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH） 自由基清除能力檢測(cè)試劑盒 、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6磺酸）[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]自由基清除能力檢測(cè)試劑盒、沒(méi)食子酸、福林-酚（Folin-Ciocaileu）試劑（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇：成都市科隆化學(xué)品有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平（AL-104型）：上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；粉碎機(jī)（BJ-300A型）：德清拜杰電器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（KH5200DE型）：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV 10D S96型）：廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；冷凍干燥機(jī)（FDU-2110型）：東京理化器械株式會(huì)社；酶標(biāo)儀（FLEXA-200型）：杭州奧盛儀器有限公司；恒溫水浴鍋（HH.S21-8型）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGG-9030B型）：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超純水制備儀（EPED-EZ-10TJ型）：南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；離心機(jī)（5425型）：德國(guó)艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

趕黃草、分心木、代代花經(jīng)晾曬干燥，將樣品粉碎后過(guò)60目篩待用。

1.3.2 植物提取物的制備

分心木的提取參考肖敏等[20]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取粉碎后的分心木粉末40 g，以60%乙醇提取活性成分，料液比為 1∶30（g/mL），53 ℃超聲輔助提取55 min，抽濾，殘?jiān)磸?fù)提取3次。合并濾液后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并冷凍干燥后即可得到約5 g淺棕色粉末即分心木提取物。

趕黃草的提取參考郭建敏等[21]的方法并稍作修改。準(zhǔn)備稱取粉碎后的趕黃草粉末60 g，以70%乙醇提取活性成分，料液比為 1∶25（g/mL），55 ℃超聲輔助提取40 min，抽濾，殘?jiān)磸?fù)提取3次。合并濾液后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并冷凍干燥后即可得到約6 g淺棕色粉末即趕黃草提取物。

代代花的提取參考郝可欣等[22]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱量粉碎后的代代花粉末50 g，以60%乙醇提取活性成分，料液比為 1∶20（g/mL），55 ℃超聲輔助提取40 min，抽濾，殘?jiān)磸?fù)提取3次。合并濾液后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并冷凍干燥后即可得到約5 g棕色粉末即代代花提取物。

青蒿提取物以純水煮沸回流，按照料液比1∶10（g/mL）提取，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并冷凍干燥后即可得到棕黃色粉末即青蒿水提取物。

1.3.3 總黃酮含量的測(cè)定

參考《中國(guó)藥典》[23]的方法，并加以改進(jìn)。精密稱定樣品各0.15 g，加入30%乙醇定容至25 mL，超聲處理后過(guò)濾。精密量取上述濾液2 mL，加水定容至25 mL作為供試品溶液。分別從供試品溶液中取1 mL置于25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL搖勻，放置6 min，加NaOH試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外可見(jiàn)分光光度法，在500 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

用無(wú)水乙醇將于120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品稀釋至 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL。按上述方法進(jìn)行操作，以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

各提取物的總黃酮含量參考蘆?。╮utin，RT）標(biāo)準(zhǔn)曲線用蘆丁當(dāng)量（每克樣品中黃酮類化合物相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)，mg RT/g）表示，根據(jù)公式（1）計(jì)算，每個(gè)提取物平行測(cè)定3次。

式中：c為標(biāo)準(zhǔn)曲線算得被測(cè)液中總黃酮濃度，mg RT/mL；v為各待測(cè)樣品提取液總體積，mL；k為待測(cè)樣品提取液稀釋倍數(shù)；m為提取物粉末質(zhì)量，g。

1.3.4 多酚含量檢測(cè)

參考章林[24]的方法，并加以改進(jìn)。精密稱定樣品0.2 g加水定容至100 mL為待測(cè)液。取0.1 mL待測(cè)液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL福林-酚試劑，再加入3 mL濃度為100 g/L的Na2CO3溶液，定容后混勻。然后室溫下避光放置反應(yīng)2 h，在765 nm處測(cè)吸光度。

精密吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）于 10 mL 容量瓶?jī)?nèi)，加 1.0 mL Folin-Ciocaileu試劑，再加入3 mL濃度為100 g/L的Na2CO3溶液，混勻，加水定容，再混勻。然后室溫下避光放置反應(yīng)2 h，在765 nm處測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

各提取物的總酚含量參考沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）標(biāo)準(zhǔn)曲線用沒(méi)食子酸當(dāng)量（每克干樣品中酚類化合物相當(dāng)于沒(méi)食子酸的毫克數(shù)，mg GAE/g）表示，根據(jù)公式（2）計(jì)算。每個(gè)提取物平行測(cè)定3次。

式中：c為標(biāo)準(zhǔn)曲線算得被測(cè)液中總酚濃度，mg GAE/mL；v為各待測(cè)樣品提取液總體積，mL；k為待測(cè)樣品提取液稀釋倍數(shù)；m為提取物粉末質(zhì)量，g。

1.3.5 DPPH自由基清除能力檢測(cè)

將4種植物提取物以純水為溶劑，配制成一定濃度的樣品，10 000 r/min室溫離心3 min，取上清液作為待測(cè)液。將DPPH母液與無(wú)水乙醇按照體積比4∶21的比例配成DPPH工作液。按照DPPH自由基清除能力試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行加樣，混勻后室溫避光靜置30 min后，測(cè)定515 nm處的吸光度。空白孔、對(duì)照孔和測(cè)定孔的吸光值分別記為A空白、A對(duì)照和A測(cè)定。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力檢測(cè)

將4種植物提取物以純水為溶劑，配制成一定濃度的樣品，10 000 r/min室溫離心3 min，取上清液作為待測(cè)液。根據(jù)比例配成ABTS工作液。按照ABTS+自由基清除能力試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行加樣，充分混勻后室溫避光靜置6min后，測(cè)定405nm處的吸光度。空白孔、對(duì)照孔和測(cè)定孔的吸光值分別記為A空白、A對(duì)照和A測(cè)定。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.3.7 總抗氧化能力檢測(cè)（FRAP法）

將4種植物提取物由純水配制成一定濃度，10 000 r/min室溫離心3 min，取上清液。將FRAP緩沖液、氯化三苯四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TPTZ）溶液、氯化鐵溶液按照體積比 10∶1∶1 配制FRAP工作液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用純水將亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液（10mmol/L）稀釋至 0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5 mmol/L。按照T-AOC試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行加樣，置于37℃水浴鍋保溫30 min后，測(cè)定593 nm處吸光度值。以系列Fe2+濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取提取物以純水為溶劑，配制成不同的濃度。按照上述方法進(jìn)行加樣，用酶標(biāo)儀檢測(cè)593 nm處吸光度。樣品最終的總抗氧化能力以Fe2+的當(dāng)量濃度（FRAP值）表示。

式中：cFe2+當(dāng)量為標(biāo)準(zhǔn)曲線算得提取物相對(duì)應(yīng)的Fe2+濃度，mmol/L ；c提取物為提取物濃度，mg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)的差異顯著性和相關(guān)性，采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮、總酚含量檢測(cè)結(jié)果

蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程：y=9.195 0x+0.018 9，R2=0.998 6，在測(cè)定范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度呈良好的線性相關(guān)。沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程：y=0.103 4x+0.018 3，R2=0.998 9，在測(cè)定范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度值呈良好的線性相關(guān)。4種植物提取物的總黃酮和總酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同植物提取物中的黃酮和多酚含量Table 1 Contents of flavonoids and polyphenols in different plant extracts

由表1可知，4種植物提取物中分心木提取物的總黃酮含量最高，為（21.87±0.55）mg RT/g，其次是趕黃草提取物，而青蒿和代代花提取物的總黃酮含量最低；趕黃草提取物的總酚含量最高，為（14.78±0.95）mg GAE/g，分心木和代代花提取物總酚含量之間無(wú)顯著差異，而青蒿提取物的總酚含量最低。

2.2 對(duì)DPPH自由基清除作用

DPPH自由基清除率的測(cè)試是作為判定樣本抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物、食品、保健品及藥品的抗氧化能力研究[25-26]。4種植物提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用見(jiàn)圖1。

圖1 4種植物提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH free radical sacvenging activities of four plant extracts

由圖1可知，在一定濃度范圍內(nèi)，4種植物提取物對(duì)DPPH自由基的清除率與濃度成量效關(guān)系，DPPH自由基的清除率均隨濃度的升高而增大。分心木和趕黃草提取物對(duì)DPPH自由基的清除率略低于VC，青蒿和代代花提取物對(duì)DPPH自由基清除率明顯低于VC，這說(shuō)明了分心木和趕黃草具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

對(duì)植物提取物濃度和相應(yīng)的DPPH自由基清除率進(jìn)行線性回歸分析，并通過(guò)回歸方程得到了不同提取物清除率的IC50。IC50值越小則說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)自由基的清除率達(dá)到50%時(shí)所需要的物質(zhì)濃度越小，對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)，反之則說(shuō)明對(duì)DPPH自由基的清除能力弱[27]。根據(jù)線性回歸方程可計(jì)算出各提取物的IC50值分別為分心木（38.85 μg/mL）、趕黃草（45.88 μg/mL）、青蒿（397.50 μg/mL）、代代花（634.23 μg/mL）。4 種提取物DPPH自由基清除能力的大小順序?yàn)榉中哪荆沮s黃草＞青蒿＞代代花。

2.3 對(duì)ABTS+自由基清除作用

ABTS法可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測(cè)定，是使用最廣泛的間接檢測(cè)方法[28]。4種植物提取物對(duì)ABTS+自由基的清除作用見(jiàn)圖2。

由圖2可知，4種植物提取物對(duì)ABTS+自由基的清除率與濃度成量效關(guān)系，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越大對(duì)ABTS+自由基的清除率越大。4植物提取物對(duì)ABTS+由基清除率均小于VC，但也表明了4種植物提取物均具有一定的抗氧化活性。

圖2 4種植物提取物對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of four plant extracts on ABTS+free radical

各提取物的IC50值，分別為趕黃草0.81 mg/mL、分心木1.41 mg/mL、青蒿2.16 mg/mL、代代花4.03 mg/mL，4種提取物ABTS+自由基清除能力的順序?yàn)橼s黃草＞分心木＞青蒿＞代代花。

2.4 總抗氧化能力

FRAP法是一種通過(guò)鐵離子還原反應(yīng)的能力來(lái)測(cè)定總抗氧化能力的方法[29]?？偪寡趸芰?biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程：y=1.648 3x+0.141 3，R2=0.995，線性關(guān)系良好。4種植物提取物的總抗氧化能力見(jiàn)圖3。

圖3 4種植物提取物的總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidative capacities of four plant extracts

由圖3可知，4種植物提取物的總抗氧化能力大小順序?yàn)榉中哪綶（3.12±0.14）mmol/g]＞趕黃草[（2.74±0.18）mmol/g]＞青蒿[（0.45±0.01）mmol/g]＞代代花[（0.42±0.03）mmol/g]，與對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50值保持一致。

2.5 相關(guān)性分析

植物提取物抗氧化機(jī)制在于清除自由基、降低氧化中間體、抑制酶促氧化等，其抗氧化能力的大小又多與總和總黃酮含量呈正相關(guān)[30-31]。一般來(lái)說(shuō)多酚或黃酮含量越高，化合物抗氧化能力越強(qiáng)[32]。

采用SPSS17.0軟件對(duì)4種不同提取物中總黃酮含量、總多酚含量及抗氧化活性進(jìn)行了Person法相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4種植物提取物總酚、總黃酮與抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 2 The relationships of the contents of total polyphenols and total flavonoids with the antioxidant activity of four plant extracts

由表2可知，總黃酮含量與DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力呈顯著性相關(guān)，總酚含量與各抗氧化能力相關(guān)性不顯著。由此可見(jiàn)，4種植物提取物的抗氧化能力與總黃酮的含量排序基本保持一致。根據(jù)抗氧化能力與總黃酮含量的顯著相關(guān)性可以推測(cè)，以2-苯基色原酮所具有的母核的黃酮類化合物所形成的交叉共軛體系，在植物提取物的抗氧化綜合能力的大小比較中占主要因素[33]。

3 結(jié)論

對(duì)4種植物提取物的總酚、總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)以DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、總抗氧化能力為指標(biāo)，研究了4種植物提取物的抗氧化能力。結(jié)果表明，4種植物提取物均含有豐富的總黃酮和總酚。4種提取物中分心木提取物的總黃酮的含量最高，為（21.87±0.55）mg RT/g。趕黃草提取物的總酚含量最高，為（14.78±0.95）mg GAE/g。4種植物提取物中分心木的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力最強(qiáng)，IC50值和 FRAP值分別為 8.85 μg/mL和（3.12±0.14）mmol/g。趕黃草的ABTS+自由基清除能力最強(qiáng)，IC50值達(dá)到0.81 mg/mL。因此，分心木和趕黃草的綜合抗氧化能力大于青蒿和代代花。在總黃酮和總酚含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析中，總黃酮含量和抗氧化能力呈正相關(guān)，說(shuō)明對(duì)于這4種植物來(lái)說(shuō)，黃酮類化合物的抗氧化作用占主導(dǎo)地位。