基于UPLC-Q-TOF-MS技術及網絡藥理學方法探討六味地黃丸入腦成分改善D-gal模型大鼠學習記憶能力的作用機制Δ

邱 琦，徐艷明，薛 傲，王業(yè)秋，孫 琪，薛 慧，徐紅丹,3#，張 寧,#

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007； 3.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校，江蘇 無錫 214028)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種起病隱匿、與年齡相關的中樞神經退行性疾病[1]。目前，其發(fā)病機制尚未明確，而解釋該病發(fā)病機制的假說較多，可能為多因素參與的結果[2]。但不論是現(xiàn)有AD治療藥物或其他候選藥物，多僅針對AD的某個單一靶點或相關途徑，只能短期改善癥狀，不能從根本上治療AD[3]。相比于僅能調控單一靶點或途徑的藥物，中醫(yī)藥因其具有多成分、多靶點等優(yōu)勢，在發(fā)病機制復雜的AD等疾病的防治中有著巨大潛力[4]。中醫(yī)學中，AD的發(fā)病與腎虛密切相關，認為“腎精虛，腦髓空”為其基本病機，“補腎填精益髓”為根本治法[5]。六味地黃丸由熟地黃、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉和牡丹皮6味中藥組成，是我國傳承千年的經典補腎名方，AD正是六味地黃丸適應之證候。同時，六味地黃丸作為中藥復方，具有成分多、靶點廣等優(yōu)點，能夠針對疾病多個病理環(huán)節(jié)進行調控，與AD發(fā)病機制的復雜性和綜合性特征契合。研究結果表明，六味地黃丸可改善快速老化小鼠學習記憶功能，其改善作用可能與影響白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素6(IL-6)在腦組織的表達有關[6]；六味地黃丸可能通過影響中樞神經膽堿能系統(tǒng)，改善β淀粉樣蛋白(Aβ)前體蛋白/早老蛋白-1(APP/PS1)雙轉基因小鼠學習記憶能力[7]；六味地黃丸可對自然衰老大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及大腦皮質初級軀體感覺皮質區(qū)(S1Tr)神經元起到一定保護作用[8]；六味地黃丸腦脊液對Aβ1-40誘導的細胞活力降低也有明顯抑制作用[9]。目前，關于六味地黃丸在神經退行性疾病中的研究多集中于單靶點機制通路或環(huán)節(jié)，難以解釋其多成分、多靶點協(xié)同作用的問題；且現(xiàn)有研究結果也提示，六味地黃丸可通過血腦屏障發(fā)揮一定的中樞性藥理作用，而其腦通透性特征亦尚不清楚。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF-MS)技術靈敏度高、選擇性好、分離準確，被廣泛應用于中藥復雜體系成分的定性鑒別研究[10]；網絡藥理學方法具有系統(tǒng)性及整體性的研究特點，可在一定程度上彌補單一機制通路研究方法的局限性[11]。本研究基于UPLC-Q-TOF-MS技術分析六味地黃丸入腦成分，并根據(jù)獲得的入腦成分，應用網絡藥理學方法與體外驗證實驗，探討六味地黃丸入腦成分改善D-半乳糖(D-gal)模型大鼠學習記憶能力的潛在機制。

1 材料

1.1 實驗動物與細胞

雌性SD大鼠24只(遼寧長生生物技術股份有限公司)，體重210～250 g，飼養(yǎng)于無菌環(huán)境，自然光源(12L∶ 12D)，溫度20～22 ℃，相對濕度55%～65%，自由給水進食，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗，研究由黑龍江中醫(yī)藥大學倫理委員會批準(編號：2020021907)。高分化型PC12細胞(上海中喬新舟生物科技有限公司，批號：ZQ0150)。

1.2 儀器

SCIEX ExionLC AD液相色譜儀、SCIEX 5600+Q-TOF質譜儀(美國AB sciex公司)；RD-1121-NR-M新物體識別(上海移數(shù)信息科技有限公司)；ZH-Morris水迷宮設備(正華生物儀器設備有限公司)；MK3型酶標儀(上海熱電儀器有限公司)；HPC-150型流式細胞儀(加拿大Handyem公司)。

1.3 藥品與試劑

六味地黃丸濃縮丸購于北京同仁堂藥店(佳木斯店)，經黑龍江中醫(yī)藥大學陳效忠教授鑒定符合《中華人民共和國藥典：一部》標準；D-gal(上海麥克林生化科技有限公司，批號：D810319)；色譜級甲醇(美國Dikma公司，批號：W-50102)；蘇木精-伊紅(HE)染液(碧云天生物技術研究所，批號：C0105 S)。噻唑藍(MTT)粉末(美國Sigma公司，批號：20130716)；Aβ酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：E-EL-R3030)；活性氧(ROS)試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：S0033)；IL-6 ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，批號：F15870)；5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)ELISA試劑盒(廣州佰而林生物科技有限公司，批號：BI140723059、BI140722023)。

2 方法

2.1 藥液的配置

取六味地黃丸濃縮丸，研細，精密稱定20.25 g，置于具塞錐形瓶中加入去離子水100 mL，超聲(頻率40 kHz，功率180 W)處理1 h，攪拌，得六味地黃丸灌胃藥液。按89∶ 10∶ 1比例混合DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素，得DMEM培養(yǎng)液于4 ℃?zhèn)溆?；采用新鮮或保存時間較短的含藥腦脊液進行實驗，不做特殊處理。

2.2 分組及給藥

(1)動物實驗。將24只SD大鼠隨機分為空白(Control)組、模型(Model)組和給藥(LWDHW)組，每組6只。Model組、LWDHW組大鼠腹腔注射D-gal 250 mg/(kg·d)，連續(xù)4周，Control組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。同時，按人鼠等效劑量折算，LWDHW組大鼠每日以給藥量1.62 g/(kg·d)六味地黃丸藥液灌胃，Control組和Model組以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。(2)細胞實驗。分為空白(Control)組、模型(Model)組和六味地黃丸含藥腦脊液(LWDHW)組。將對數(shù)期細胞接種于DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。Control組更換DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；Model組更換DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，再給予20 mg/mL的D-gal培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；LWDHW組加入六味地黃丸腦脊液培養(yǎng)2 h，再給予20 mg/mL的D-gal培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3 行為學實驗

2.3.1 新物體識別實驗：各組大鼠在箱體內熟悉5 min后，放置兩個完全相同的小正方體到箱體一端，將大鼠背向小正方體放置在對側箱壁中點熟悉5 min。訓練1 h后，用另外一個完全不同的球形物體替換其中一個小正方體。從相同位置放入大鼠，記錄大鼠5 min內對新物體的接觸時間(Tn)和對舊物體的接觸時間(Tf)。識別指數(shù)=(Tn-Tf)/(Tn+Tf)。

2.3.2 Morris水迷宮實驗：整個實驗區(qū)域被分為四個象限，實驗包括定位航行實驗(前4日)與空間探索實驗(第5日)。定位航行實驗，于第四象限水下2 cm處放入平臺，保持平臺位置不變。將大鼠面向池壁，于一、二、三象限規(guī)定點放入水中。90 s內，找到目標平臺的大鼠，在平臺上停留30 s，未找到平臺的大鼠，人為將其放置在平臺上30 s，記錄大鼠找到平臺時間為逃避潛伏期?？臻g探索實驗，移除平臺，于一、二、三象限規(guī)定點將大鼠放入水迷宮中，記錄大鼠90 s內在目標(第四)象限的停留時間，記錄穿過平臺位置及有效(2倍平臺直徑)區(qū)域的次數(shù)。

2.4 樣品的采集

行為學實驗結束后，將Control組、LWDHW組大鼠頭部固定，用輸液針抵達小腦延髓池，抽取腦脊液，3 500 r/min(離心半徑8.5 cm)離心10 min，取上層腦脊液用于分析及細胞實驗；并摘取各組大鼠新鮮大腦，洗去殘留的血液，置于4%多聚甲醛中固定48 h，制HE染色病理切片。

2.5 HE染色觀察大鼠海馬神經元狀態(tài)

采用常規(guī)病理學方法對固定的腦組織進行脫水、包埋，制成蠟塊，切成4 μm厚度的蠟片。依次用二甲苯脫蠟，95%乙醇脫水，HE染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性膠封片。

2.6 入腦成分分析

2.6.1 樣品前處理：腦脊液樣品進樣前，取腦脊液200 μL于離心管中，加入甲醇800 μL，渦旋混合1 min，超聲(頻率40 kHz，功率180 W)1 min，13 000 r/min(離心半徑8.5 cm)離心10 min，取上清液，氮吹后用甲醇溶液60 μL復溶，過0.22 μm微孔濾膜，進樣5 μL。

2.6.2 UPLC-Q-TOF-MS分析：(1)色譜條件。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流速0.4 mL/min；檢測時間30 min，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-純乙腈(B)，進行梯度洗脫(0～12 min，0～70%B；12～12.5 min，70%B；12.5～16 min，70%～100%B；16～22 min，100%B)。(2)質譜條件。采用正、負離子檢測模式，一級質譜(ESI-MS)和二級質譜(ESI-MS2)掃描范圍分別為100～1 200、50～1 200 m/z；各氣路均使用He；離子化電壓(ISVF)為5 500 V，噴霧氣(GS1)、輔助加熱氣(GS2)壓力均為50 psi(1 psi≈6.895 kPa)，氣簾氣壓力(CUR)為35 psi，離子源溫度為550 ℃，錐孔電壓(DP)為90 V，一級質譜碰撞能量(CE)為10 V，二級質譜CE為35 V、碰撞能量范圍(CES)為15 V。

2.7 網絡藥理學方法

2.7.1 六味地黃丸入腦成分靶點收集：選取鑒定的全部六味地黃丸入腦成分作為目標成分，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選六味地黃丸入腦成分的分子靶點。在Uniprot(https://www.uniprot.org/)蛋白質數(shù)據(jù)庫中將入腦成分所作用的靶點名稱進行標準化。

2.7.2 AD相關靶點收集：以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞在治療靶點數(shù)據(jù)庫(TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://genecards.org)檢索AD疾病靶點，使用UniProt數(shù)據(jù)庫校正檢索靶點結果名稱。

2.7.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)核心網絡的構建：將六味地黃丸入腦成分靶點與AD疾病靶點取交集并繪制韋恩圖。將交集靶點提交至STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)在線網站，設定物種為人源基因“Homo sapiens”，構建PPI網絡模型，保存tsv文件。

2.7.4 六味地黃丸“入腦成分-靶點-AD”的網絡構建：將上述tsv文件導入CytoScape 3.7.2軟件，構建六味地黃丸“入腦成分-靶點-AD”網絡關系圖。

2.7.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析：將交集靶點導入Metascape在線網站(http://metascape.org/gp/index.html)，選擇對應的物種“H.sapinens”，對獲取的靶點信息進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。最后，將得到的數(shù)據(jù)導入微生信在線網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)可視化。

2.8 細胞實驗

2.8.1 MTT比色法檢測細胞增殖率：收集依據(jù)不同分組情況處理后的細胞，在96孔板中加入MTT(5 g/L)20 μL/孔，孵育4 h，移除上清液，加入DMSO 150 μL/孔搖晃10 min，在570 nm下用酶標儀檢測吸光度。

2.8.2 DCFH-DA熒光探針檢測ROS含量：收集依據(jù)不同分組情況處理后的細胞，移除培養(yǎng)液，在6孔板中加入 DCFH-DA(10 μmol/L)1 mL/孔，放入培養(yǎng)箱內靜置20 min后，每5 min混勻1次。孵育結束，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，收集細胞，加入無血清培養(yǎng)液1 mL，上流式細胞儀檢測。

2.8.3 ELISA檢測Aβ1-42、ROS、IL-6、5-HT和DA的含量：收集依據(jù)不同分組情況處理后的細胞，采用常規(guī)雙抗體夾心ELISA法測定，具體步驟按照各ELISA試劑盒說明書進行。

2.9 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 行為學測試結果

3.1.1 對D-gal模型大鼠新物體識別實驗中識別指數(shù)的影響：與Control組相比，Model組大鼠新物體識別指數(shù)顯著降低(P<0.01)；與Model組相比，LWDHW組大鼠新物體識別指數(shù)顯著升高(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 新物體識別實驗中三組大鼠識別指數(shù)比較Tab 1 Comparison of recognition indexes among three groups of rats in the new object recognition test

3.1.2 Morris水迷宮實驗結果：(1)對D-gal模型大鼠定位航行實驗中逃避潛伏期的影響。與Control組相比，Model組大鼠定位潛伏期顯著延長(P<0.01)；與Model組相比，LWDHW組大鼠定位潛伏期顯著縮短(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學意義。各組大鼠在訓練過程中尋找平臺潛伏期逐漸縮短，但Control組和LWDHW組大鼠定位航行潛伏期縮短較快，Model組潛伏期縮短幅度較小，見表2。(2)對D-gal模型大鼠空間探索實驗中穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時間的影響。與Control組相比，Model組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著減少，靶象限停留時間顯著縮短(P<0.01)；與Model組相比，LWDHW組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著增加，靶象限停留時間顯著延長(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學意義，見表3。

表2 定位航行實驗中三組大鼠逃避潛伏期比較Tab 2 Comparison of escape latency among three groups of rats in place

表3 空間探索實驗中三組大鼠穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時間比較Tab 3 Comparison of the number of platform crossing and dwell time of target quadrant among three groups of rats in the space exploration n=6)

3.2 對D-gal模型大鼠海馬神經元狀態(tài)的影響

Control組的大鼠海馬區(qū)細胞排列規(guī)整，神經元數(shù)量較多，染色均一，核仁清晰可見，未見核固縮現(xiàn)象；與Control組相比，Model組大鼠海馬細胞排列紊亂，部分神經元丟失，神經元數(shù)目減少，細胞縮小，核仁不明顯，核固縮現(xiàn)象明顯；與Model組相比，LWDHW組海馬神經元排列較為規(guī)整，神經元數(shù)量較多，形態(tài)正常，核仁較清晰，沒有明顯核固縮現(xiàn)象，見圖1。

A. Control組；B. Model組；C. LWDHW組A. Control group; B. Model group; C. LWDHW group圖1 三組大鼠海馬神經元狀態(tài)比較(HE，×40)Fig 1 Comparison of morphology of hippocampal neurons among three groups of rats (HE, ×40)

3.3 六味地黃丸入腦成分分析結果

以峰面積的有無判斷該離子是否為含藥腦脊液中的特有成分即潛在入腦成分，通過質核比碎片的裂解規(guī)律以及數(shù)據(jù)庫比對確定7個原型入腦成分，分別為莫諾苷、(-)-奎寧酸、阿魏酸、芍藥苷、泛酸、5-羥甲基糠醛和尿苷，見表4，總離子流圖見圖2。

表4 六味地黃丸入腦成分分析結果Tab 4 Analysis results of brain-absorption components of Liuwei Dihuang pills

A.Control組(正離子模式)；B.LWDHW組(正離子模式)；C.Control組(負離子模式)；D.LWDHW組(負離子模式)A. Control group (positive ion model); B. LWDHW group (positive ion model); C. Control group (negative ion model); D. LWDHW group (positive ion model)圖2 Control組和LWDHW組大鼠腦脊液樣品在正離子和負離子模式下的UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖Fig 2 Total ionization chromatography of UPLC-Q-TOF-MS of rats cerebrospinal fluid samples in Control group and LWDHW group under positive and negative ion model

3.4 網絡藥理學研究結果

3.4.1 六味地黃丸入腦成分靶點與AD相關靶點的收集：根據(jù)表4，在TCMSP、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選獲取102個六味地黃丸入腦成分的分子靶點。以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞在TTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索得到1 560個與AD相關的作用靶點。

3.4.2 PPI網絡的構建：將六味地黃丸入腦成分靶點與AD疾病靶點取交集，共得到47個交集靶點，韋恩圖見圖3。采用STRING構建PPI網絡模型，見圖4。圖4中包括46個節(jié)點，136條邊；節(jié)點越大、顏色越暗，表示Degree值越大，高的Degree值可作為靶點預測的重點；邊越粗，表示Combine score值越大，代表兩種蛋白之間的相互作用關系越強，相互作用多的靶點可能是六味地黃丸抗AD的關鍵。

圖3 六味地黃丸入腦成分靶點與AD疾病靶點的韋恩圖Fig 3 Venn diagram of brain-absorption components of Liuwei Dihuang pills and AD disease

圖4 六味地黃丸入腦成分靶點與AD疾病靶點的PPI核心網絡Fig 4 PPI core network of brain-absorption components of Liuwei Dihuang pills and AD disease

3.4.3 六味地黃丸“入腦成分-靶點-AD”的網絡構建：六味地黃丸“入腦成分-靶點-AD”網絡關系圖見圖5，獲得的網絡共包括53個節(jié)點，95條邊，7個六味地黃丸入腦成分中6個與AD靶點有直接作用，說明六味地黃丸抗AD可能是多成分、多靶點作用的結果。其中可能起到關鍵作用的成分為泛酸(pantothenic acid)、尿苷(uridine)和(-)-奎寧酸[(-)-quinic acid]。

圖5 六味地黃丸入腦成分-靶點-AD網絡構建Fig 5 Construction of “brain-absorption components-target-AD” network of Liuwei Dihuang pills

3.4.4 GO功能和KEGG通路富集分析：GO富集包括生物學過程(BP)、細胞組分(CC)以及分子功能(MF)，通過 GO功能富集分析可以獲得基因的生物學功能。本研究GO富集中富集到的主要條目44個，見圖6，其中BP主要涉及對β淀粉樣蛋白的反應、活性氧代謝、炎癥反應的調節(jié)、脂質分解代謝等；CC主要涉及多巴胺能突觸等；MF主要涉及β淀粉樣蛋白的結合、蛋白磷酸酶的結合、絲氨酸水解酶活性、神經遞質受體活性等。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對代謝通路進行富集分析，氣泡圖見圖7，結果表明，除涉及“Alzheimer’s disease”通路外，六味地黃丸入腦成分治療AD還涉及了精氨酸和脯氨酸代謝通路、5-羥色胺能突觸通路等14條信號通路。

圖6 六味地黃丸入腦成分與AD疾病交集靶點的GO功能富集分析Fig 6 GO functional enrichment analysis on the intersection targets of brain-absorption components of Liuwei Dihuang pills and AD disease

3.5 細胞實驗結果

3.5.1 對D-gal損傷PC12細胞增殖率的影響：與Control組比較，Model組細胞的增殖率顯著降低(P<0.01)；與Model組比較，LWDHW組細胞的增殖率顯著升高(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學意義，見表5。

表5 三組PC12細胞增值率比較(n=6)Tab 5 Comparison of proliferation rates among three groups of PC12 cells (n=6)

圖7 六味地黃丸入腦成分與AD疾病交集靶點的KEGG通路富集分析Fig 7 KEGG pathway enrichment analysis on the intersection targets of brain-absorption components of Liuwei Dihuang pills and AD disease

3.5.2 對D-gal損傷PC12細胞中Aβ1-42、ROS、IL-6、5-HT和DA的影響：與Control組比較，Model組細胞的Aβ1-42、ROS和IL-6水平顯著升高(P<0.01)，5-HT、DA水平顯著降低(P<0.01)；與Model組比較，LWDHW組細胞的Aβ1-42、ROS和IL-6水平顯著降低(P<0.01)，5-HT、DA水平顯著升高(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學意義，見表6。

表6 三組PC12細胞Aβ1-42、ROS、IL-6、5-HT和DA水平比較Tab 6 Comparison of Aβ1-42, ROS, IL-6, 5-HT and DA levels among three groups of PC12 cells

4 討論

老年斑(SPs)和神經原纖維纏結(NFTs)是被廣泛接受的AD神經病理標志[12]。Aβ沉積作為SPs的核心成分，主要來源于淀粉蛋白前β-分解酶1(BACE1)及γ-分解酶對Aβ前體蛋白(APP)的不當剪切；Tau蛋白在腦中促進微管的形成和穩(wěn)定，過度磷酸化的Tau蛋白從微管分離、聚集形成NFTs，二者均會改變神經元形態(tài)，誘導學習記憶能力損傷[13]?，F(xiàn)有研究結果表明，Aβ誘導的神經毒性主要由皮層和海馬神經元中Tau蛋白磷酸化的升高介導，Tau磷酸化水平的升高也被認為是Aβ誘導的神經毒性機制之一[14]；Aβ與Tau蛋白之間可能也存在一定的協(xié)同作用，二者可相互促進、共同發(fā)揮神經毒性，影響AD進展[15]。

在Aβ異常沉積情況下，Aβ及其前體APP的N端金屬結合域中的銅離子大量聚集，高效介導自由基氧化，導致腦中氧化應激等神經毒性的發(fā)生[16]；有研究結果發(fā)現(xiàn)，Tau的初期纖維化過程可能也與神經元中發(fā)生的氧化應激有關[17]。在氧化應激條件下，機體內ROS大量產生并蓄積[18]，對神經元膜脂質、蛋白質及核酸造成破壞，是氧化應激發(fā)生的直接標志，抑制其積累可能是抑制Aβ誘導神經毒性的有效途徑。同時，AD發(fā)病過程與慢性缺氧狀態(tài)密切相關，缺氧條件同樣會使ROS的積累增加，缺氧條件下的鼠腦切片也顯現(xiàn)出存在更多的Aβ斑塊沉積[19]。缺氧誘導因子1(HIF-1)與機體缺氧直接相關[20]，可通過抑制其亞型之一的HIF-1α表達，改善AD缺氧相關的氧化應激損傷。

同時，Aβ的異常沉積還可能是誘發(fā)AD中炎癥反應的原因之一，可隨著疾病的發(fā)展使小膠質細胞持續(xù)過度表達促炎因子，如IL-6、誘導性一氧化碳酶(iNOS/NOS2)等[21]，導致小膠質細胞對Aβ的清除減少，引起病變。Toll-Like受體4(TLR4)是小膠質細胞中表達最主要受體之一，絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)作為TLR4的下游，是炎癥中主要的信號傳導途徑[22-23]。黃貞偉等[24]發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4/MAPK信號通路激活可明顯改善LPS誘導的BV2小膠質細胞中IL-6 mRNA及iNOS蛋白的高表達，降低炎癥損傷。而炎癥與氧化應激的關系也十分密切，研究結果表明，在炎癥引發(fā)小鼠認知障礙過程中，ROS-p38 MAPK系統(tǒng)可相互作用，通過影響小膠質細胞激活、炎癥因子釋放及氧化應激的發(fā)生，導致認知功能障礙[25]。

過多的ROS還會加劇線粒體功能損傷，導致能量代謝障礙[26]。能量代謝異常是AD的主要特征之一，機體內脂質及氨基酸代謝異常對AD相關的能量代謝障礙具有重要影響[27-28]?；ㄉ南┧?AA)是一種多不飽和必需脂肪酸，具有抑制脂肪生成、促進脂肪分解的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2)和多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶(ALOX5)分別是AA合成各種內源性前列腺素和白三烯類介質的限速酶，二者均可以通過AA途徑參與機體的多種生理及病理過程，與AA共同在能量代謝(脂質代謝)的調節(jié)中發(fā)揮作用[29-30]。研究結果表明，機體內氨基酸對線粒體能量代謝同樣有著重要的調控作用。如絲氨酸可促進脂肪和脂肪酸的新陳代謝，Le等[31]發(fā)現(xiàn)通過給予營養(yǎng)的絲氨酸，AD小鼠的記憶功能得以恢復；精氨酸代謝可以通過一氧化氮合酶生成的NO，影響大鼠體內的脂類代謝，促進葡萄糖和脂肪酸的氧化分解以及脂肪細胞的脂解[32]。

此外，腦內神經遞質作為突觸間傳遞信息的重要媒介，是神經元發(fā)揮功能的基礎，包括乙酰膽堿類、單胺類和氨類等多種，其中乙酰膽堿、DA、γ-氨基丁酸(GABA)、5-HT及腎上腺素與AD密切相關[33]。而這些神經遞質的功能狀態(tài)也會受到Aβ和Tau的影響，Aβ沉積和過度磷酸化Tau蛋白會阻礙神經遞質的釋放，干擾神經元突觸蛋白活性、Ca2+和轉錄因子等重要因子，促進AD發(fā)展[34]。

本實驗利用UPLC-Q-TOF-MS技術鑒定出7個入腦化合物成分，其中6個與AD靶點有直接作用，分別為(-)-奎寧酸、阿魏酸、芍藥苷、泛酸、5-羥甲基糠醛和尿苷，可能在六味地黃丸治療AD中發(fā)揮重要作用。其中，阿魏酸是熟地黃中的活性成分，已被證實具有抗氧化和神經保護特性，可改善認知障礙[35]；5-羥甲基糠醛可通過提高腦組織抗氧化酶活力、降低脂質過氧化反應，改善學習記憶能力[36]；芍藥苷具有抗抑郁、抗炎和保護神經等多種藥理作用[37]；非腺苷核苷如尿苷，可對細胞外興奮性神經遞質谷氨酸或GABA水平起到一定的調節(jié)作用[38]。結合網絡藥理學結果，六味地黃丸入腦成分可對Aβ沉積相關的BACE1、APP等靶點參與的Aβ結合及反應過程；高度磷酸化Tau蛋白相關的蛋白磷酸酶的結合；氧化應激相關的ROS代謝過程、HIF-1信號通路；炎癥相關的TLR4、IL-6R和NOS2等靶點參與的MAPK級聯(lián)、炎癥反應的調節(jié)過程；能量代謝相關的PTGS2、ALOX5等靶點參與的脂質分解代謝過程、絲氨酸水解酶活性、精氨酸和脯氨酸代謝通路；神經遞質相關的α7煙堿型乙酰膽堿受體(CHRNA7)、多巴胺轉運體(SLC6A3)、α1亞型γ-氨基丁酸A受體(GABRA1)和β2腎上腺素受體(ADRB2)等靶點、參與突觸后膜電位調節(jié)的神經遞質受體活性、腎上腺素能受體活性、多巴胺能突觸、5-羥色胺能突觸通路和神經活性配體-受體相互作用通路等，起到一定調節(jié)作用。應用細胞實驗對前期預測的部分結果進行驗證，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸腦脊液可對D-gal損傷PC12細胞增殖率及Aβ1-42、ROS、IL-6、DA和5-HT水平起到一定的調節(jié)作用。但作為預測性實驗及體外細胞實驗，本實驗結果可能存在一定局限性，未來將繼續(xù)探索六味地黃丸在動物模型中發(fā)揮神經保護作用的相關機制。

綜上所述，本實驗結合UPLC-Q-TOF-MS技術與網絡藥理學方法，確定六味地黃丸入腦成分，并預測其改善學習記憶能力的相關機制，可為六味地黃丸在AD防治中的潛在應用提供參考。