新型冠狀病毒疫苗佐劑的研究現(xiàn)狀與展望

李海波，程 浩

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))藥學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系微生物與生化藥學(xué)教研室，國(guó)家免疫生物制品工程技術(shù)研究中心

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是一種具有包膜的正鏈單股RNA病毒，其引發(fā)的新冠病毒肺炎(COVID-19)正在全球蔓延，對(duì)人類健康以及全球經(jīng)濟(jì)構(gòu)成了巨大威脅[1]。截至2022年6月24日，全球已報(bào)告超過(guò)5.39億確診病例和632萬(wàn)例死亡。由于當(dāng)前治療手段有限，疫苗的研制和使用仍然是控制新冠病毒肺炎疫情的最重要手段[2]。

佐劑是添加到疫苗中以增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)，其可以減少免疫接種的次數(shù)，重塑適應(yīng)性免疫反應(yīng)、減少抗原劑量和提高保護(hù)效果。佐劑廣泛應(yīng)用于新冠病毒滅活疫苗、重組病毒疫苗和病毒樣顆粒疫苗。進(jìn)入臨床試驗(yàn)的新冠病毒疫苗所用佐劑包括無(wú)機(jī)物類佐劑鋁鹽、TLRs激動(dòng)劑、水包油類佐劑、油包水類佐劑、復(fù)合佐劑等。本文主要從新冠病毒疫苗佐劑種類、優(yōu)缺點(diǎn)及面臨的挑戰(zhàn)等方面進(jìn)行評(píng)述(表1)，并對(duì)未來(lái)新冠病毒疫苗佐劑的研究方向進(jìn)行展望。

表1 緊急授權(quán)使用或進(jìn)入臨床試驗(yàn)的新冠病毒疫苗及其使用佐劑

1 新冠病毒疫苗佐劑的研究現(xiàn)狀

1.1 鋁佐劑

鋁佐劑是我國(guó)唯一批準(zhǔn)用于人體的佐劑，已經(jīng)有九十多年的歷史，也是目前應(yīng)用最廣泛的疫苗佐劑。鋁佐劑發(fā)揮作用的機(jī)制尚不完全清楚，可能的機(jī)制包括延長(zhǎng)抗原的吸附時(shí)間，誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞的活化和成熟，激活炎癥小體[3-4]等。鋁佐劑主要促進(jìn)體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力弱。我國(guó)批準(zhǔn)上市的兩款滅活疫苗均選用鋁佐劑，其中科興的克爾來(lái)福(CoronaVac)的有效率達(dá)67%，能降低85%的住院率，降低89%的重癥監(jiān)護(hù)就診率以及降低80%的死亡率[5]。國(guó)藥的眾愛(ài)可維(BBIBP-CorV)對(duì)所有年齡組有癥狀和住院疾病的有效性估計(jì)為79%[6]。智飛生物的重組亞單位疫苗智克威得(ZF2001)也選用氫氧化鋁佐劑，綜合保護(hù)率81.76%，重癥保護(hù)率可達(dá)100%[4,7]。古巴疫苗FINLAY-FR-1A在鋁佐劑的基礎(chǔ)上添加了B群腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜囊泡，在已進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，疫苗接種后28d，RBD特異性IgG抗體增加了21倍以上，24名(80%)受試者中和抗體滴度高于1∶160[8-9]。四川大學(xué)研制的重組新冠病毒疫苗(Sf9細(xì)胞)，采用氫氧化鋁佐劑制成，與水包油類佐劑MF59相比免疫原性可能較弱，但是不良反應(yīng)較低[10]。

1.2 Toll樣受體(TLRs)激動(dòng)劑

Toll樣受體(TLRs)激動(dòng)劑多為合成小分子佐劑，具有分子設(shè)計(jì)靈活和容易量產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[11]。此外，TLRs激動(dòng)劑可以同時(shí)增強(qiáng)抗原特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，克服了鋁佐劑誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答能力弱的缺點(diǎn)。XS15是一種TLR2激動(dòng)劑，最初被設(shè)計(jì)用作腫瘤疫苗的佐劑。CoVac-1以XS15作為佐劑的，抗原由新冠病毒結(jié)構(gòu)蛋白的多個(gè)T細(xì)胞表位組成。在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，CoVac-1顯示了可接受的安全性，并誘導(dǎo)了強(qiáng)大的T細(xì)胞反應(yīng)，下一步將開(kāi)展B細(xì)胞或抗體缺乏患者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)[12-13]。PIKA佐劑是一種合成的雙鏈RNA(dsRNA)，能被TLR3識(shí)別并激活免疫反應(yīng)。以PIKA為佐劑的新冠病毒三聚體S蛋白可誘導(dǎo)快速、高效和長(zhǎng)效的中和抗體，產(chǎn)生強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)感染小鼠表現(xiàn)出完全的保護(hù)作用。此外，在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的研究表明，PIKA佐劑輔助三聚體S蛋白誘導(dǎo)了高中和效價(jià)的抗體，并在病毒攻擊后阻斷了病毒在肺部復(fù)制和感染[4,14]。CpG是一類模擬細(xì)菌和病毒遺傳物質(zhì)的合成DNA，可以靶向激活TLR9，已被開(kāi)發(fā)為乙型肝炎疫苗HEPLISAV-B的佐劑。Covax-19疫苗采用Advax-SM佐劑，該佐劑由delta菊粉多糖顆粒組成，其中含有TLR9激動(dòng)劑CpG55.2。接種了兩劑高劑量的Covax-19疫苗的雪貂，在感染后的第3天，其肺部或鼻腔洗液中均未檢測(cè)到病毒，顯示其可能降低病毒傳播[15-16]。

1.3 水包油類佐劑

乳劑在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)已被用作疫苗佐劑，但直至上世紀(jì)末，解決代謝問(wèn)題后才被批準(zhǔn)用于人類。水包油型乳劑免疫刺激效果比鋁佐劑更強(qiáng)，其分子作用機(jī)制尚不完全清楚[17]。雖然相對(duì)于其它類型的佐劑，水包油佐劑制備工藝復(fù)雜，但可以顯著增強(qiáng)疫苗在老年人群體的免疫保護(hù)效果。MF59由角鯊烯、吐溫80、司盤(pán)85組成，油相成分角鯊烯可降解且生物相容性好，能顯著刺激抗體產(chǎn)生，增強(qiáng)Th1型和Th2型免疫應(yīng)答，已用于季節(jié)性和大流行性流感疫苗。臨床前研究表明，昆士蘭大學(xué)研制的新冠病毒候選疫苗與MF59 佐劑相結(jié)合可以產(chǎn)生高水平的中和抗體，但進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)后由于可能干擾HIV病毒檢測(cè)而被叫停[18]。與MF59成分和粒徑相近，AS03也包含角鯊烯和吐溫80，不同的是含有α-生育酚。研究表明，AS03可誘導(dǎo)肌肉和引流淋巴結(jié)產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，促使單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞向引流淋巴結(jié)遷移。此外，AS03能夠刺激CD4+T細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)，可能與持續(xù)產(chǎn)生的中和抗體和記憶B細(xì)胞有關(guān)[19]。賽諾菲和葛蘭素史克聯(lián)合開(kāi)發(fā)的新冠病毒蛋白亞單位疫苗VAT00008，其采用AS03作為佐劑，在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，各劑量各年齡組(18～95歲)中，第2次注射后的中和抗體反應(yīng)率為95%～100%。目前進(jìn)行的Ⅲ期臨床試驗(yàn)將進(jìn)一步評(píng)價(jià)疫苗的效果、免疫原性和安全性[20]。

1.4 油包水類佐劑

MONTANIDE ISA 720是一種含有甘露醇單油酸脂乳化劑的以角鯊烯為基礎(chǔ)的佐劑，可以形成油包水體系，在注射部位抗原緩慢釋放，已在超過(guò)50個(gè)人體臨床試驗(yàn)中使用[21-22]。由Akston研制的新冠病毒疫苗AKS-452，研究發(fā)現(xiàn)在添加油包水佐劑MONTANIDETMISA 720后，接受一針劑和兩針劑注射的小鼠其中和抗體滴度提高了約7倍。此外，添加該佐劑的AKS-452疫苗在兔和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中具有免疫原性，對(duì)活病毒攻毒的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(USA-WA1/2020病毒株)和K18-人ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠(南非B.1.351病毒變體)具有完全保護(hù)作用[23]。

1.5 Matrix-M佐劑

Novavax的專利佐劑Matrix-M由兩個(gè)單獨(dú)40 nm大小的顆粒組成，每個(gè)顆粒都含有不同且結(jié)構(gòu)明確的皂苷部分(A組分和C組分)。Matrix-M可增強(qiáng)Th1和Th2反應(yīng)，誘導(dǎo)多個(gè)亞類的抗體，增強(qiáng)免疫細(xì)胞遷移，并節(jié)省抗原劑量。以Matrix-M為佐劑的新冠病毒疫苗NVX-CoV2373(約3萬(wàn)名受試者)和針對(duì)其他病原體的疫苗(約4200名受試者)，已在美國(guó)、英國(guó)等共29個(gè)Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)中使用[24-25]。在兩項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，NVX-CoV2373對(duì)輕度、中度和重度新冠病毒肺炎的保護(hù)率為90%。

1.6 復(fù)合佐劑

復(fù)合佐劑是將兩種及以上佐劑進(jìn)行組合，發(fā)揮佐劑的協(xié)同作用。為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)鋁佐劑誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答能力弱的不足，常用的策略是將可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的佐劑與鋁佐劑進(jìn)行組合構(gòu)建復(fù)合佐劑。印度的新冠病毒疫苗COVAXIN將TLR7/8激動(dòng)劑咪唑喹啉吸附到氫氧化鋁顆粒作為佐劑，Ⅲ期臨床試驗(yàn)疫苗的總體有效性為77.8%[26]。法國(guó)Valneva SE公司開(kāi)發(fā)的新冠病毒疫苗VLA2001則將鋁佐劑和CpG 1018進(jìn)行組合，在臨床前實(shí)驗(yàn)中能誘導(dǎo)比鋁佐劑更高的抗體水平，并促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答向Th1方向偏移，其Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示中和抗體血清轉(zhuǎn)化率95%以上，且能誘導(dǎo)針對(duì)S、M和N蛋白的廣泛T細(xì)胞反應(yīng)[27]。美國(guó)Vaxxinity公司的新冠病毒疫苗UB-612將CpG和與另外一種形式的鋁佐劑磷酸鋁進(jìn)行復(fù)配，以誘導(dǎo)Th1反應(yīng)[28]。用UB-612加強(qiáng)免疫后，受體結(jié)合域(RBD)和刺突(S)蛋白結(jié)合IgG抗體對(duì)多種新冠病毒變體產(chǎn)生了高交叉反應(yīng)性[29]。加拿大疫苗Covifenz將AS03與CpG 1018進(jìn)行組合，對(duì)18至64歲的試驗(yàn)參與者有效保護(hù)率71%，Ⅱ期臨床試驗(yàn)中期結(jié)果顯示該疫苗的高安全性和有效性，與恢復(fù)期患者血漿中的抗體反應(yīng)相比，中和抗體反應(yīng)高出10倍[30]。加拿大的另一款新冠病毒疫苗COVAC-1則采用TriAdj佐劑，由Poly(I∶C)、IDR-1002肽和聚磷腈按照1∶2∶1比例配制而成，之前的研究表明TriAdj佐劑可以促進(jìn)Th1/Th2均衡的免疫應(yīng)答[31]。

2 新冠病毒疫苗研發(fā)中應(yīng)用佐劑須考慮的問(wèn)題

新冠病毒仍然在全球廣泛傳播，且不斷有新的變異株出現(xiàn)，新冠病毒疫苗研發(fā)仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，其佐劑應(yīng)用須考慮以下幾個(gè)問(wèn)題。

2.1 佐劑的起效速度

在新冠病毒持續(xù)流行的背景下，接種疫苗的個(gè)體越早產(chǎn)生有效濃度的中和抗體，不僅可以保護(hù)接種個(gè)體免受病毒的侵染，在一定程度上還會(huì)阻斷病毒的傳播鏈，因此新冠病毒疫苗的研發(fā)中應(yīng)考慮選用可以輔助抗原快速誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的佐劑。

2.2 佐劑的持久性

隨著時(shí)間推移，疫苗接種者的抗體水平通常會(huì)逐漸下降。為了維持有效的抗體水平，必要時(shí)需要進(jìn)行加強(qiáng)免疫。持久強(qiáng)效佐劑可以輔助抗原維持長(zhǎng)期高水平的特異性免疫應(yīng)答，將會(huì)減少加強(qiáng)針的接種次數(shù)，從而提高新冠病毒疫苗接種的依從性。

2.3 佐劑的普適性

多數(shù)新冠病毒疫苗在青壯年人群中接種可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，然而對(duì)于老年人或有基礎(chǔ)疾病等免疫功能不全人群，通常需要?jiǎng)?chuàng)新的疫苗佐劑策略。水包油佐劑以及部分復(fù)合佐劑已經(jīng)在提高免疫功能不全人群的疫苗免疫應(yīng)答方面表現(xiàn)出了一定的潛力，未來(lái)可能作為普適性佐劑用于新冠病毒疫苗的研發(fā)。

3 新冠病毒疫苗佐劑的研究展望

目前已有多種新型佐劑用于新冠病毒疫苗開(kāi)發(fā)，由于鋁佐劑的應(yīng)用較成熟，其安全性在廣泛使用中得到驗(yàn)證，被用于多種類型的新冠病毒疫苗開(kāi)發(fā)。在所有進(jìn)入臨床試驗(yàn)或已上市的疫苗類型中，包括滅活疫苗、蛋白亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗等，使用鋁佐劑的新冠病毒疫苗占比約為37.5%。但新型佐劑的優(yōu)勢(shì)也逐漸體現(xiàn)出來(lái)，有望彌補(bǔ)傳統(tǒng)鋁佐劑的不足，因此有必要進(jìn)一步開(kāi)展創(chuàng)新佐劑的研究與開(kāi)發(fā)，我們認(rèn)為未來(lái)新冠病毒疫苗佐劑可以圍繞以下幾個(gè)方面開(kāi)展研究。

3.1 針對(duì)免疫功能低下人群的佐劑

由于各年齡段人群均對(duì)新冠病毒易感，實(shí)現(xiàn)全人群接種是形成群體免疫屏障、阻斷傳播的關(guān)鍵，但目前老年人以及有基礎(chǔ)疾病人群的新冠病毒疫苗接種的研究還非常少[32]。免疫功能低下導(dǎo)致該類人群感染新冠病毒的嚴(yán)重程度增加，并且當(dāng)前大多數(shù)新冠病毒疫苗的免疫原性和臨床療效在該人群中要顯著低于免疫功能正常人群。開(kāi)發(fā)新型佐劑是增強(qiáng)疫苗對(duì)免疫功能低下人群免疫原性的主要策略。雖然已經(jīng)有研究表明氫氧化鋁佐劑和CpG組成的復(fù)合佐劑可以提高新冠病毒疫苗對(duì)老年鼠的保護(hù)[33]，但至今還未有相關(guān)的臨床研究[34]。因此，后續(xù)還須重視對(duì)以上免疫功能低下人群新冠病毒疫苗佐劑的研究。

3.2 增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答的佐劑

新冠病毒為單股正鏈RNA病毒，可在疫情發(fā)生發(fā)展中不斷變異，且其感染與免疫機(jī)制還有很多盲點(diǎn)，因此當(dāng)前研制的疫苗保護(hù)效力和免疫持久性仍然存在不確定因素。抗體一直被認(rèn)為在阻止新冠病毒感染中發(fā)揮重要作用，但隨著新冠病毒的變異，現(xiàn)有疫苗誘導(dǎo)的抗體對(duì)變異株的中和能力大幅下降[35]。然而，有研究者發(fā)現(xiàn)新冠康復(fù)者以及接種疫苗人群產(chǎn)生的T細(xì)胞應(yīng)答仍然能夠識(shí)別新冠病毒變異株[36-37]，提示誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答，尤其是CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，可能是應(yīng)對(duì)變異株感染的有效策略。鋁佐劑作為我國(guó)唯一獲批用于人體的佐劑，其增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力弱。研發(fā)可輔助抗原誘導(dǎo)強(qiáng)效、持久特異性T細(xì)胞應(yīng)答的佐劑是未來(lái)新冠病毒疫苗研究的重點(diǎn)。

3.3 新型黏膜免疫佐劑

由于新冠病毒主要通過(guò)呼吸道入侵人體，呼吸道黏膜免疫應(yīng)答對(duì)阻斷新冠病毒對(duì)宿主的感染至關(guān)重要[38]?，F(xiàn)有新冠病毒疫苗主要通過(guò)皮下或肌肉注射接種，所能激發(fā)的黏膜免疫應(yīng)答通常非常有限，導(dǎo)致當(dāng)前的新冠病毒疫苗“只能預(yù)防病癥，不能預(yù)防感染”[39]。缺乏安全有效的黏膜佐劑是限制黏膜遞送新冠病毒疫苗研發(fā)的主要障礙。我們的前期研究中，通過(guò)合理設(shè)計(jì)新型脂肽分子，發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的脂肽與新冠病毒重組RBD聯(lián)用滴鼻免疫小鼠，可以顯著提升血清、肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液中新冠病毒中和抗體的水平，提示新型脂肽可能是新冠病毒疫苗的候選佐劑[40]。盡管有部分黏膜佐劑處于臨床前或臨床研究階段，但其安全性和有效性還有待進(jìn)一步評(píng)估[41]。因此，迫切需要發(fā)展安全、高效的粘膜免疫佐劑來(lái)促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性黏膜免疫應(yīng)答，以應(yīng)對(duì)新冠病毒帶來(lái)的感染威脅。

3.4 復(fù)合佐劑的理性設(shè)計(jì)

由于不同佐劑的作用特點(diǎn)各不相同，為盡可能將各種佐劑的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，促進(jìn)疫苗激發(fā)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，發(fā)揮更好的免疫保護(hù)效果，佐劑的組合通常是必要的[42]。復(fù)合佐劑策略在新冠病毒疫苗研發(fā)中也備受重視，但多數(shù)是將傳統(tǒng)鋁佐劑和PAMPs進(jìn)行組合，在保留鋁佐劑良好的蛋白抗原存儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，彌補(bǔ)鋁佐劑不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的不足。然而，將PAMPs與鋁佐劑簡(jiǎn)單混合，無(wú)法靶向胞內(nèi)免疫活化位點(diǎn)，難以最優(yōu)發(fā)揮佐劑的免疫增強(qiáng)效用。因此，科學(xué)、合理的佐劑組合以及時(shí)空耦合的共遞送是復(fù)合佐劑形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，發(fā)揮協(xié)同作用的基礎(chǔ)[43]，該領(lǐng)域的研究有待進(jìn)一步深入。為了尋找到更為有效的新冠病毒疫苗復(fù)合佐劑，建議針對(duì)傳統(tǒng)佐劑的機(jī)制和結(jié)構(gòu)，采取高通量篩選以及理性設(shè)計(jì)等策略，開(kāi)展新冠病毒疫苗復(fù)合佐劑的研究。

隨著新冠病毒的不斷變異，其疫苗研發(fā)仍然在路上。佐劑作為提升疫苗保護(hù)效果的重要組成部分，也是當(dāng)前新冠病毒疫苗研究的熱點(diǎn)。雖然多種佐劑已經(jīng)應(yīng)用于新冠病毒疫苗，但現(xiàn)在佐劑的應(yīng)用仍然以經(jīng)驗(yàn)性為主，根據(jù)新冠病毒的感染特點(diǎn)進(jìn)行佐劑的合理化設(shè)計(jì)以及遞送可能是未來(lái)重要的研究方向。